Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

저자 BBSRC (BB/P005454/1) 재정 지원에 대 한 인정합니다. NH는 VILLUM 재단 젊은 수 사관 프로그램에 의해 투자 되었다.

1. 지질/정리-10/FDLL 믹스의 준비
참고: E. 대장균 지질 리 준비를 위해 사용 해야 한다 aliquoted ubiquinone 10 (효소 기판)와 긴 파장 형광 염료 표시 된 지질 (리 크기 결정)에 대 한 이전에 철저 하 게 혼합 된 재구성입니다.
<ol><li>유리 주사기를 사용 하 여, 지질 극의 클로 프롬의 전송 200 µ L에서에서 추출 대장균 (25 mg/mL) 5 mg aliquots 수 있도록 유리 튜브로.</li>
	<...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

설명 하는 방법을 리로 재구성 될 수 있다 호흡 막 단백질에 의해 양수 하는 양성자를 공부 하는 게 적당 하다 고 quinone 풀 전자를 교환할 수 있습니다. Liposome 루멘 (그림 1A)에 pH에 민감한 (비율 계량) 염료를 사용 하 여 단일 효소 수준에서 양성자 펌프 활동을 모니터링할 수 있습니다.
방법은 전극 샘18수정 전자 교환 ubiquinone (또는 다른...

효소 메커니즘 및 활동에 대 한 정보는 앙상블 또는 macroscale 수준에 분자의 수백만에 수천에서 효소 인구와 측정 통계 평균을 나타내는 일반적으로 얻어진 다. 그러나 그것은 알려져 있다,, 효소 같은 복잡 한 고분자가 그들의 행동에 설명 할지도 모른다 및 앙상블 수준에서 관찰 하는 분자 메커니즘을 반드시 모든 분자에 대 한 유효 하지 않습니다. 개별 분자 가늠 자에 그런 편차는 광범위 하 게 지난 2 년간1동안 신흥 메서드의 다양 한 단일 효소의 연구에 의해 확인 되었습니다. 특히, 형광 탐지 개별 효소 활동의 효소 활동2,3 의 조사 또는 소위 메모리 효과 (낮은의 기간에 의해 성공 했다 높은 효소 활동의 기간을 발견 사용 되었습니다. 활동 및 반대로)4,5.
많은 단일 효소 연구 필요 효소 표면 또는 공간적으로 연속 관측 시야에서 충분히 긴 유지 하는 또 다른 방법은 고정에 움직일 수 있다. 리로 효소 캡슐 표면 효소 또는 단백질 단백질 상호 작용6,7인해 어떤 부정적인 영향을 방지 하면서 효소 immobilization 수 있도록 표시 되었습니다. 또한, 리 그들의 자연적인 지질 bilayer 환경8,,910단일 막 단백질을 공부 하는 독특한 가능성을 제공.
클래스의 막 단백질, 운반, 세포 막, 단백질은 지질 bilayers (예, 리)11로 재구성 하는 경우에 공부 될 수 있다 행동에 걸쳐 물질의 방향 전 연습 12,13. 예를 들어 양성자 전 좌, 간결한 및 핵 전자 수송 체인의 여러 효소에 의해 전시 ATP 합성에 사용 되는 양성자 동기 힘을 생성 하 여 세포 호흡에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 경우에,이 과정의 상세한 메커니즘 종종 애매 남아 있지만 활동을 양수 하는 양성자 전자 전송에 결합 이다.
최근, 우리 전기 화학의 대장균 (시 토 크롬 보3) 터미널 ubiquinol 산화 효소의 단일 효소의 활동을 양수 하는 양성자를 공부와 몇 형광 검출 가능성 입증 리14재구성 된다. 이것은 E 에서 준비 하는 리의 루멘으로는 pH에 민감한 막 불 침투성 형광 염료의 캡슐화에 의해 달성 대장균 극 지 지질 (그림 1A) 단백질 양은 대부분 리 (에 따르면 포아송 분포) 없거나 하나만 재구성된 효소 분자에 포함 되도록 최적화 되었다. 시 토 크롬 보3 의 두 기판 ubiquinone 솔루션에서 리 고 (주변) 산소를 형성 하는 지질 믹스에 추가 하 여 제공 되었다. 에 리는 띄엄띄엄 6-mercaptohexanol의 자기 조립된 단층으로 덮여 반투명 최상의 부드러운 골드 전극에 흡착 됩니다. 마지막으로, 전극은 간단한 spectroelectrochemical 셀 (그림 1B)의 하단에 장착 됩니다. Quinone 풀 산화 상태의 전기 제어 수를 유연 하 게 트리거 또는 pH에 민감한 염료에 의해 양성자 전 좌 결과로 리의 루멘 내 pH 변화를 모니터링 하는 데 사용은 어떤 순간에 효소 반응을 중지 하는 효소입니다. 두 번째, 지질 바인딩된 형광 염료, 크기와 개별 리의 볼륨의 형광 강도 확인할 수 있습니다 사용 하 고 따라서 효소 양성자 펌프 활동의 정량화. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 특히 시 토 크롬 보3 분자는 양성자 동기 힘을 급속 하 게 사라지는 자연 누수 상태를 들어갈 수을 발견. 이 문서의 목표는 자세히 단일 liposome 측정의 기법을 소개 하는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

전자의 양성자 펌프 효소 ATP 생산에 사용 되는 양성자 동기 힘을 만드는 막에 걸쳐 체인 몇 redox 반응 양성자 전 좌를 전송 합니다. 막 단백질의 amphiphilic 자연 그들의 처리에 특히 주의 필요 그리고 양성자 전 좌 처럼 막 전송 프로세스를 공부를 할 때 자연 지질 환경으로 재구성 불가결 하지 않습니다. 여기, 우리는 예를 들어 대장균 에서 시 토 크롬 보3 복용 막 산화 환 원 효소의 양성자 펌핑 메커니즘의 조사를 위해 사용 된 방법 선발. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법의 조합 quinone 수영장과 모니터 pH 변화는 루멘의 산화 상태를 제어 하는 데 사용 됩니다. 형광 현미경의 해상도 인해 수백 리 측정할 수 있습니다 동시에 동안 효소 콘텐츠 단일 효소 또는 liposome 당 전송 축소 될 수 있습니다. 각각 단일 효소 분석 전체 인구의 동작에 의해 그렇지 않으면 숨겨져 있을 수 있습니다 효소 기능 역학에서 패턴을 밝힐 수 있다. 우리는 자동된 이미지 분석을 위한 스크립트의 설명을 포함합니다.

6MH의 샘과 금 수정 커버 슬립 (전극)의 품질 각 전기 화학 임피던스 분광학 실험 하기 전에 검사 됩니다. 그림 2A 리 흡착 전후 전기 화학 임피던스 분광학을 사용 하 여 측정 하는 대표적인 콜 콜 플롯을 표시 합니다. 샘의 품질 충분 한 경우에, 임피던스 분광학 세미 원 콜-콜 플롯 결과 거의 순수 용량 성 행동을 보여주어야 합니다. 콜 콜 플롯에 세미 ...

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Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3 를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

이 방법은 자연 지질 이중 층 환경에서 시토 크롬 BO3와 같은 호흡기 막 효소의 양성자 수송 활성을 연구 할 수 있습니다. 이 단일 효소 기술의 주요 장점은 전기 화학을 사용하여 언제든지 효소 반응을 시작하고 중지 할 수있는 가능성입니다. 에스키치아 대장균추출물의 엽록소 육수 200마이크로리터를 유리 바이알로 유리 바이옴으로 유리 주사기 로 옮기는 유리 주사기 를 사용한다.지질에 1-100 유비퀴논 10의 최종 비율을 만들기 위해 밀리리터 유비퀴논 10당 1밀리그램의 50 마이크로리터를 추가합니다. 혼합물에 밀리리터 긴 파길이 형광염료 라벨이 부착된 지질 약식 FDLL당 1밀리그램의 20마이크로리터를 첨가한다. 짧은 소용돌이에 의해 클로로폼 용액을 균질화하고 부드러운 질소 또는 아르곤 흐름 하에서 대부분의 클로로포름을 증발시다.적어도 한 시간 동안 진공 상태에서 추가 증발에 의해 클로로폼 흔적을 완전히 제거하십시오. 지질 유비퀴논 10 FDLL 드라이 믹스의 알리쿼트에 40 밀리머걸러 MOPS pH 7.4 버퍼의 312.5 마이크로리터를 추가합니다. 지질 필름이 완전히 다시 중단 될 때까지 소용돌이를 혼합하고 초음파 목욕에서 치료의 2 분 다음.다음으로 25 밀리머 HPTS의 125 마이크로 리터를 추가, 리포솜 내부에 캡슐화 됩니다 pH 민감한 형광 염료. 이제 250 밀리머 OGP 계면 활성제의 137.5 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이를 사용하여 혼합 한 후, 모든 지질이 계면 활성제 미젤로 용해되도록 10 분 동안 초음파 수조에서 혼합물을 초음파 처리합니다.그런 다음 분산을 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브로 옮킨다. 필요한 양의 사이토크롬 BO3를 추가하고 초순수수를 추가하여 총 50마이크로리터를 만듭니다. 롤러 믹서에서 10 분 동안 섭씨 4도에서 재구성 혼합물을 배양합니다.다음 무게 50 폴리스티렌 마이크로 비드의 각 에 1.5 밀리 리터 튜브 캡. 그런 다음 100 밀리그램의 폴리스티렌 마이크로비드를 또 다른 두 개의 1.5 밀리리터 튜브 캡에 넣습니다. 파라핀 필름으로 캡을 닫아 건조를 방지합니다.1.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 폴리스티렌 마이크로비드가 있는 캡을 준비된 분산과 함께 넣어 재구성 혼합물에 폴리스티렌 마이크로비드 의 첫 50 밀리그램을 추가합니다. 그런 다음 몇 초 동안 짧은 스핀을 수행하여 마이크로비드를 튜브 바닥에 가져옵니다. 폴리스티렌 마이크로비드가 계면 활성제를 30분 동안 흡수할 수 있도록 롤러 믹서에서 섭씨 4도에서 서스펜션을 배양합니다.다음과 같이 폴리스티렌 마이크로비드와 인큐베이션의 추가를 반복합니다. 50 밀리그램의 마이크로비드를 60분 동안 첨가하세요. 그런 다음 100 밀리그램의 마이크로비드를 60분 동안 배양합니다.그리고 마지막으로, 120 분 동안 100 밀리그램의 마이크로비드를 추가하십시오. 얇은 팁이 있는 마이크로파이프를 사용하여 폴리스티렌 마이크로비드와 프로테오올리포솜 용액을 분리합니다. TI 45 초센심분리기 튜브에서 90밀리리터의 MOPS 버퍼에서 분산을 희석시하십시오.125, 000배 G에서 타입 45 TI 로터를 사용하여 분산을 1시간 동안 발동성포생을 펠릿화한다. 초원심분리에 따라, 상체를 버리고 펠릿을 다시 중단하지 않고 MOPS 버퍼로 펠릿을 헹구십시오. 헹구는 버퍼를 폐기한 후, 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브로 서스펜션을 전송하기 전에 얇은 기울어진 마이크로파이프로 앞뒤로 파이펫을 사용하여 MOPS 버퍼의 500 마이크로리터에서 프로테오올리포좀을 다시 중단합니다.12, 000회 G에서 5분간 원심분리를 거쳐 잔해를 제거하고, 재구성된 프로테오폴좀인 상체를 새로운 유리병으로 옮긴다. 이중 성분 저형 에폭시를 사용하여 증발된 금 표면에 최대 9개의 유리 커버 미끄러짐을 붙입니다. 접착제를 섭씨 80도에서 4시간 동안 치료합니다.자체 조립 된 모노 레이어로 수정하기 직전에 실리콘 웨이퍼에서 유리 커버 슬립을 블레이드로 분리하십시오. 커버 슬립의 얇음으로 인해 커버 슬립을 분리하여 유리 슬라이드를 깨뜨리거나 부서지지 않도록 주의하십시오. 갓 분리된 골드 코팅 커버 슬립을 6-마카토헥사놀 솔루션에 담그고 하룻밤 사이에 섭씨 20~25도에 그대로 두어 조립된 모노층을 형성합니다.다음 날, 용액에서 금 코팅 커버 슬립을 제거하고 물이나 메탄올로 간략하게 씻은 다음 이소프로파놀로 간략하게 씻습니다. 부드러운 가스 흐름 아래에서 금코팅 커버 슬립을 건조시다. 텍스트 프로토콜에서 다이어그램으로 분광 전기 화학 전지에 금 코팅 커버 슬립을 조립합니다.고무 O 링에 의해 정의 된 영역 외부 의 평평한 와이어와 금에 접촉하고 단단히 그것의 상단에 전기 화학 셀아래로 나사. 전해질 버퍼 용액의 2밀리리터를 추가하고 셀에 참조 및 보조 전극을 배치합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자체 조립된 모노 레이어의 품질을 확인하고 공백을 실행합니다.밀리리터 최종 지질 농도당 0.5 밀리그램의 전기화학적 세포에 프로테오올리포좀을 추가하고 파이펫과 약간 섞어드린다. 전극 표면에 프로테오폴좀의 흡수가 완료될 때까지 실온에서 30~60분 정도 기다립니다. 버퍼 용액을 10회 이상 변경하여 셀을 세척하지만 전극 표면이 완전히 건조하게 되는 것을 피하십시오.지금, 금 전극에 자기 조립 된 단층을 확인하기 위해 오픈 셀 잠재력에서 전기 화학 임피던스 분광기를 실행 변경되지 않은 남아있다. 경추형 voltammograms를 스캔 속도 10 및 100 밀리볼트초당 실행하여 전기 화학 퀴논 감소의 발병 잠재력에서 시토크롬 BO3에 의한 쌍경 유비퀴놀 산화 및 산소 감소를 관찰합니다. 이전과 같이 금 전극을 수정하지만 밀리리터 프로테올리푸좀당 5 마이크로그램을 사용한다.단일 효소 연구의 경우 시토크롬 BO3를 지질 비율을 0.1에서 0.2%로 감소시키는 데, 침수 오일한방울을 정한 다음, 전기화학전지는 역형 현미경의 60배 오일 목표에 놓는다. FDLL 형광에 적합한 필터를 사용하여 전극 표면에 초점을 맞춥니다. 단일 리포솜은 현미경 목표의 회절 한계에 밝은 반점으로 나타나야 한다.FDLL 플로레시전의 이미지를 가져 가라. HTPS 플로레시엔스가 배경과 명확하게 표시되고 구별되는지 확인하기 위해 현미경에 HPTS 플로레시네이션 필터 세트 중 하나로 전환합니다. 그렇지 않은 경우 광 강도를 증가시면 광 강도를 높입니다.두 개의 HTPS 필터 세트를 번갈아 하여 시간 제한 된 이미지 수집을 수행 하는 현미경 소프트웨어를 프로그래밍 합니다. 이렇게 하려면 1초 노출을 설정한 다음 메뉴 응용 프로그램으로 이동합니다. 그런 다음 ND 인수를 정의/실행하고 두 개의 HTPS 채널을 선택합니다.이미지 수집 간의 지연을 최소한으로 설정합니다. 이 실험에서는 0.3초 지연 및 총 5분 지속 시간을 사용합니다. potentiostat의 설정을 조정하여 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 이미지 수집 중에 잠재력을 변경합니다.이제 두 측정을 동시에 수동으로 시작하여 현미경 및 전위 시퀀스에 대한 시간 제한 된 이미지 수집을 동시에 실행합니다. 여기에 표시된 리포솜의 형광 이미지는 세 가지 다른 범위에서 전극에 흡수된다. 리포솜을 함유한 염료는 이미지에서 밝은 반점으로 볼 수 있습니다.이미지의 중앙 부분은 배경 꽃집 수준을 밝히기 위해 사진 표백되었습니다. 두 HTPS 채널의 이미지는 두 채널 간의 비율이 이 실험에서 사용되는 7.4의 pH에 해당하는 매우 침전할 수 없습니다. 더 많은 수의 리포솜이 FDLL 채널과 함께 표시되며, 이는 HPTS캡슐이 없는 리포솜의 존재를 나타냅니다.HPTS와 FDLL 채널의 차이는 더 높은 범위에서 더 두드러집니다. 아마도 높은 리포솜 커버리지에서 리포솜이 표면에 파열되거나 융합될 가능성이 더 높기 때문일 수 있습니다. 여기서, 두 HTPS 채널에 대한 리포솜 플로르시엔스의 변화는 실험300초 동안 해당 영역의 3D 표면 플롯으로 도시된다.환원 잠재력은 60초에서 180초 사이에 적용되었습니다. 두 HPTS 채널의 볼륨 미터강도 비율과 시간의 해당 플롯이 표시됩니다. 여기에 도시된 사이토크롬 BO3 함량이 1.3%인 경우 단일 이미지 내에서 모든 소포 pH 변경의 중앙값이 0.1~0.3볼트 사이의 전위가 적용될 때 pH의 증가가 선명하게 나타난다.사이토크롬 BO3 함량이 0.1%의 훨씬 낮은 값일 때 중앙값 곡선은 빈 리포솜과 거의 구별할 수 없게 됩니다. 잔류가 양성자에 리포솜의 투과성을 증가시킬 수 있기 때문에 리포솜 경륜의 시대에서 계면활성제의 완전한 제거를 보장하는 것이 중요하다. 이러한 방법을 사용하면 자주 사용되는 수용성 퀴논 유사체와 는 달리 천연 리포필성 퀴논 기판에 대한 구체적인 질문을 할 수 있습니다.또한, 단일 효소 실험은 단백질이 양성자가 자유롭게 거꾸로 흐르는 양성자 채널의 역할을 하는 이전에 알려지지 않은 누출 상태를 확인하였다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...