Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Forfatterne bekrefter BBSRC (BB/P005454/1) for økonomisk støtte. NH ble finansiert av VILLUM Foundation unge etterforsker Program.

1. forberedelse av en Lipid/UQ-10/FDLL-blanding
Merk: E. coli lipider brukes for liposomer utarbeidelse bør være aliquoted og grundig blandet med ubiquinone-10 (enzym substrat) og lang-bølgelengde fluorescerende farge-merket lipider (for liposomer størrelse vilje) før den rekonstituering.
<ol><li>Bruker glass sprøyte, Overfør 200 µL av kloroform lager av lipid polar Pakk ut fra Escherichia coli (25 mg/mL) i hetteglass å gjøre 5 mg dele.</li>
	<li>Legge ti...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

Metoden beskrevet er egnet til å studere proton pumpe av respiratoriske membran proteiner som kan rekonstitueres i liposomer og kan utveksle elektroner med quinone bassenget. Proton pumpe aktivitet kan overvåkes på enkelt-enzym nivå ved hjelp av pH-sensitive (ratiometric) fargestoffer innkapslet i liposome lumen (figur 1A).
Metoden er avhengig av evnen til ubiquinone (eller andre quinones), innlemmet i lipid-bilayer å utveksle elektroner med elektroder endret...

Informasjon om enzym mekanismer og kinetics hentes vanligvis på ensemble eller macroscale nivå med enzym befolkning i tusenvis til millioner av molekyler, der målinger representerer en statistisk gjennomsnitt. Det er imidlertid kjent at komplekse macromolecules for eksempel enzymer kan vise heterogene i deres oppførsel og molekylære mekanismer observert på ensemble nivå er ikke nødvendigvis gyldig for hvert molekyl. Slike avvik på individuelle molekyl skala er mye bekreftet av studier av enkelt enzymer med en rekke metoder voksende under de siste to tiårene1. Spesielt er fluorescens påvisning av personlige enzym aktivitet brukt til å undersøke heterogenitet enzym aktivitet2,3 eller oppdage såkalte minne effekten (perioder med høy enzym aktivitet etterfulgt av perioder med lav aktivitet og omvendt)4,5.
Mange enkelt enzym studier krever at enzymer er immobilized på overflaten eller romlig fast på en annen måte å være langt nok i synsfeltet for kontinuerlig observasjon. Enzym innkapsling i liposomer har vist aktiverer enzymet immobilisering mens forebygge den negative effekten skyldes det overflate-enzym eller protein-protein interaksjoner6,7. I tillegg tilbyr liposomer en enestående mulighet til å studere enkelt membran proteiner i deres naturlige lipid bilayer miljø8,9,10.
En klasse av membran proteiner, transportører, øvelser en retningsbestemt translokasjon av stoffer over cellemembranen, en virkemåte som bare kan studeres når proteiner er rekonstitueres i lipid bilayers (f.eks, liposomer)11, 12,13. For eksempel spiller proton translokasjon, utstilt ved flere enzymer prokaryotic og eukaryotic elektronet transport kjeder, en viktig rolle i cellular respirasjon ved å opprette en proton motiv kraft brukes for ATP syntese. I dette tilfellet er proton pumpe aktivitet koblet til elektron overføringen, selv om den detaljerte mekanismen av denne prosessen ofte forblir unnvikende.
Nylig viste vi muligheten til å par fluorescerende oppdagelsen med elektrokjemi å studere proton pumpe aktiviteten til enkelt enzymer i terminal ubiquinol oksidase av Escherichia coli (cytochrome bo3) rekonstituert i liposomer14. Dette ble oppnådd ved innkapsling av en pH-sensitive membran-ugjennomtrengelig fluorescerende fargestoff inn lumen av liposomer forberedt fra E. coli polar lipider (figur 1A). Hvor protein var optimalisert slik at de fleste liposomer inneholdt enten ingen eller bare ett rekonstituert enzym molekyl (ifølge Poisson-fordelingen). De to underlag cytochrome bo3 ble levert av legger ubiquinone til lipid mix som dannet liposomer og (ambient) oksygen i løsningen. Liposomer er så tynt adsorbert på en semi-gjennomsiktig ultrajevn gull elektrode, dekket med en selv montert monolayer av 6-mercaptohexanol. Endelig er elektroden montert på bunnen av en enkel spectroelectrochemical celle (figur 1B). Elektrokjemiske kontrollen av quinone basseng redoks kan fleksibelt utløse eller stoppe den enzymatiske reaksjonen når som helst mens pH-sensitive fargestoff brukes til å overvåke pH endringer i lumen av liposomer som følge av proton translokasjon av de enzymer. Ved hjelp av fluorescens intensiteten av en andre, lipid-bundet fluorescerende farge, størrelse og volum av personlige liposomer kan bestemmes og dermed kvantifisering av enzymet proton pumpe aktivitet. Bruker denne teknikken, fant vi spesielt at cytochrome bo3 molekyler er i stand til å inngå en spontan lekkasje tilstand som raskt forsvinner proton motiv kraft. Målet med denne artikkelen er å innføre teknikken av enkelt liposome målinger i detalj.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Proton pumpe enzymer av elektron overføre kjeder par Redoks-reaksjoner på proton translokasjon over membranen, opprette en proton motiv kraft brukes til ATP produksjon. Amphiphilic natur membran proteiner krever spesiell oppmerksomhet til deres håndtering, og rekonstituering i naturlige lipid miljøet er uunnværlig når studere membran transport prosesser som proton translokasjon. Her detalj vi en metode som har blitt brukt for etterforskningen av proton pumpe mekanisme membran redoks enzymer, tar cytochrome bo3 fra Escherichia coli som et eksempel. En kombinasjon av elektrokjemi og fluorescens mikroskopi brukes til å kontrollere redoks delstaten quinone svømmebasseng og skjermen pH endringene i lumen. På grunn av romlig oppløsning av fluorescerende mikroskopi, kan hundrevis av liposomer måles samtidig mens enzym innholdet kan skaleres til en enkelt enzym eller transporter per liposome. Respektive enkelt enzym analysen kan avsløre mønstre i enzym funksjonelle dynamikken som ellers kan skjules av oppførselen til hele befolkningen. Vi inkluderer en beskrivelse av et skript for automatisert bildeanalyser.

Kvaliteten på gull-endret cover slip (elektroden) med en SAM av 6MH kontrolleres før hvert eksperiment med elektrokjemiske impedans spektroskopi. Figur 2A viser representant Cole-Cole tomter målt ved hjelp av elektrokjemiske impedans spektroskopi før og etter liposomer er adsorbert. Hvis kvaliteten på SAM er tilstrekkelig, vise impedans spektroskopi en nesten ren kapasitiv atferd som resulterer i en halvsirkel Cole-Cole plott. Diameteren på semi-sirkel ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Her presenterer vi en protokoll for å studere molekylære mekanisme proton translokasjon over lipid membraner av enkelt liposomer, bruke cytochrome bo3 som et eksempel. Kombinere elektrokjemi og fluorescens mikroskopi, pH endringer i lumen enkelt blemmer, som inneholder én eller flere enzym, kan oppdages og analysert individuelt.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Denne metoden gjør det mulig å studere protontransportaktivitet av respiratoriske membranenzymer som cytokrom BO3 i et naturlig lipid-tolagsmiljø. De viktigste fordelene med denne enkeltenzymteknikken er muligheten til å starte og stoppe enzymatiske reaksjoner når som helst ved hjelp av elektrokjemi. Ved hjelp av en glasssprøyte overføre 200 mikroliter kloroform lager av lipid polar ekstrakt fra Escherichia coli til hetteglass for å lage fem mg aliquots.Tilsett 50 mikroliter på ett mg per milliliter ubiquinone 10 til lipidene for å gjøre det endelige forholdet mellom en til 100 ubiquinone 10 til lipider. Til blandingen tilsett 20 mikroliter av ett milligram per milliliter lang bølgelengde fluorescerende fargestoff merket lipid forkortet FDLL. Homogenisere kloroformløsningen ved kort vortexing og fordampe det meste av kloroformen under en mild nitrogen- eller argonstrøm.Fjern kloroformsporene helt ved ytterligere fordampning under vakuum i minst en time. Tilsett 312,5 mikroliter på 40 millimolar MOPS pH 7.4 buffer til en aliquot lipider ubiquinone 10 FDLL tørr blanding. Bland vortex til lipidfilmen er fullstendig suspendert igjen etterfulgt av to minutters behandling i et ultralydbad.Deretter legger du til 125 mikroliter på 25 millimolar HPTS, et pH-sensitivt fluorescerende fargestoff som vil bli innkapslet inne i liposomer. Legg nå til 137,5 mikroliter på 250 millimolar OGP overflateaktivt middel. Etter blanding ved hjelp av vortex, sonikere blandingen i et ultralydvannbad i 10 minutter for å sikre at alle lipider er solubilisert til overflateaktive micelles.Overfør deretter spredningen til et 1,5 milliliter plastrør. Tilsett den nødvendige mengden cytokrom BO3 og tilsett ultra rent vann for å lage et totalt volum på 50 mikroliter. Inkuber rekonstitueringsblandingen ved fire grader celsius i 10 minutter på en rullemikser.Deretter veier 50 milligram polystyren mikroperler inn i hver av de to 1,5 milliliter rør caps. Deretter veier 100 milligram polystyren mikroperler i ytterligere to 1,5 milliliter rør caps. Lukk hettene med parafinfilm for å unngå tørking.Tilsett de første 50 milligram polystyrenmikroperadene i rekonstitueringsblandingen ved å sette hetten med polystyrenmikroperler på det 1,5 milliliter plastrøret med forberedt dispersjon. Utfør deretter et kort spinn i et par sekunder for å bringe mikroperler til bunnen av røret. Inkuber suspensjonen ved fire grader celsius på en rullemikser slik at polystyrenmikroperlene kan absorbere overflateaktivt middel i 30 minutter.Gjenta tilleggene av polystyrenmikroperler og inkubasjoner som følger. Tilsett 50 mg mikroperler i 60 minutter med inkubasjon. Tilsett deretter 100 mg mikroperler i 60 minutter med inkubasjon.Og til slutt, legg til 100 mg mikroperler i 120 minutter med inkubasjon. Skill proteoliposomløsningen fra polystyrenmikroperadene ved hjelp av en mikropipette med en tynn spiss. Fortynn spredningen i 90 milliliter MOPS-buffer i TI 45 ultracentrifugerør.Ultracentrifuge dispersjonen ved hjelp av en type 45 TI rotor ved 125, 000 ganger G i en time for å pellet proteoliposomene. Etter ultracentrifugation, kast supernatanten og skyll pellets med MOPS buffer uten å gjenbruke pellet. Etter å ha kastet skyllebufferen, må proteoliposomene suspenderes på nytt i 500 mikroliter mopsbuffer ved å pipe den frem og tilbake med en tynn tippet mikropipette før suspensjonen overføres til et 1,5 milliliter plastrør.Etter sentrifugering i fem minutter ved 12 000 ganger G for å fjerne rusk, overføre supernatanten som er de rekonstituerte proteoliposomene til et nytt hetteglass. Lim opp til ni glassdeksel glir på en fordampet gulloverflate ved hjelp av bi-komponent lavfluorescens epoksy. Cure limet ved 80 grader celsius i fire timer.Like før du modifikasjon med et selvmontert monolag, løsner du glassdekselet fra silikonwafersene med et blad. På grunn av dekselets tynnhet glir, vær forsiktig når du løsner dekselet glir for ikke å sprekke eller bryte glassskliene. Dypp det nyliggende gullbelagte dekselet glir inn i en 6-marcaptohexanol løsning og la på 20 til 25 grader celsius over natten for å danne den selvmonterte mono-lag.Neste dag, fjern gullbelagt dekselet glir fra løsningen og vask kort med vann eller metanol og deretter med isopropanol. Tørk det gullbelagte dekselet glir under en mild gassstrøm. Sett sammen det gullbelagte dekselet i en spektroelektrokjemisk celle som diagram i tekstprotokollen.Ta kontakt med gullet med en flat ledning utenfor et område definert av en gummi O-ring og skru ned den elektrokjemiske cellen på toppen av den. Tilsett to milliliter av elektrolyttbufferløsningen og plasser referanse- og hjelpeelektrodene i cellen. Fortsett med å kontrollere kvaliteten på det selvmonterte monolaget og kjøre emner som beskrevet i tekstprotokollen.Tilsett proteoliposomer til den elektrokjemiske cellen ved 0,5 milligram per milliliter endelig lipider konsentrasjon og bland litt med en pipette. Vent 30 til 60 minutter ved romtemperatur til absorpsjonen av proteoliposomer på elektrodeoverflaten er ferdig. Vask cellen ved å endre bufferløsningen minst 10 ganger, men unngå å la elektrodeoverflaten være helt tørr.Kjør nå elektrokjemisk impedansspektroskopi ved åpen cellepotensial for å bekrefte at det selvmonterte monolaget på gullelektroden forblir uendret. Kjør sykliske voltammogrammer med skannehastigheter 10 og 100 millivolt per sekund for å observere katalatisk ubiquinoloksidasjon og oksygenreduksjon ved cytokrom BO3 ved utbruddet av elektrokjemisk quinonereduksjon. Endre gullelektroden som før, men bruk fem mikrogram per milliliter proteoliposomer.For enkeltenzymstudier redusere cytokrom BO3 til lipid forholdet til mellom 0,1 og 0,2%Plasser en dråpe nedsenking olje og deretter den elektrokjemiske cellen på 60 ganger olje mål for en invertert fluorescens mikroskop. Bruk passende filtre for FDLL fluorescens, fokuser på elektrodeoverflaten. Enkelt liposomer skal vises som lyse flekker på diffraksjonsgrensen for mikroskopmålet.Ta et bilde av FDLL florescence. Bytt til et av HPTS florescence-filtersettene på mikroskopet for å kontrollere at HTPS-florescence er godt synlig og kan skilles fra bakgrunnen. Øk lysintensiteten hvis det ikke er tilfelle.Programmer mikroskopprogramvaren for å utføre et tidsinnhenting av bilder ved å veksle mellom to HTPS-filtersett. Hvis du vil gjøre dette, angir du en eksponering på ett sekund og navigerer deretter til menyprogrammer. Deretter definere / kjøre ND oppkjøp og velg to HTPS-kanaler.Angi forsinkelsen mellom bildeanskaffelser som minimum. I dette eksperimentet bruk 0,3 sekunders forsinkelse og fem minutters total varighet. Juster innstillingene for potensistaten for å endre potensialet under bildeanskaffelsen som angitt i tekstprotokollen.Nå kjører du samtidig det tidsinne erfarne bildeoppkjøpet på mikroskopet og den potensielle sekvensen på potensistaten ved å starte begge målingene manuelt samtidig. Vist her er fluorescens bilder av liposomer absorbert på elektrodene på tre forskjellige dekninger. Fargestoffet som inneholder liposomer er synlige på bildene som lyse flekker.Den sentrale delen av bildet ble fotobleket for å avsløre bakgrunnen florescence nivå. Bildene på to HTPS-kanaler er super umuligheter der forholdet mellom de to kanalene tilsvarer en pH på 7,4 som brukes i dette eksperimentet. Et større antall liposomer er synlige med FDLL-kanalen, noe som indikerer tilstedeværelsen av liposomer som ikke har noen HPTS innkapslet.Forskjellen mellom HPTS- og FDLL-kanalene er mer uttalt ved høyere dekning. Muligens fordi ved høy liposomdekning, liposomer er mer sannsynlig å sprekke eller sikring på overflaten. Her vises endringen av en liposomet florescence på to HTPS-kanaler som en 3D-overflateplott av det tilsvarende området i løpet av 300 sekunder av eksperimentet.Det reduktive potensialet ble brukt mellom 60 sekunder og 180 sekunder. Den tilsvarende tomten for volumberegningsintensitetsforhold på to HPTS-kanaler kontra tid vises. Vist her er medianene for alle vesikkel pH-endringer i ett enkelt bilde når cytokrom BO3-innhold er 1,3%En økning i pH er tydelig synlig når et potensial mellom 0,1 og 0,3 volt påføres.Når cytokrom BO3-innhold er en mye lavere verdi på 0,1% blir mediankurvene nesten umulig å skille fra de av tomme liposomer. Det er viktig å sikre fullstendig fjerning av overflateaktivt middel fra liposomet dispensasjoner siden rester kan øke permeabiliteten av liposomer til protoner. Disse metodene tillater oss å stille spesifikke spørsmål om det naturlige lipofile quinone-substratet i motsetning til de ofte brukte vannløselige kinoneanalogene.Videre identifiserte enkeltenzymeksperimentene en tidligere ukjent lekkasjetilstand der proteinet fungerer som en protonkanal der protoner fritt flyter bakover.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molekyl Super-Resolution Imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infrarød elektrokjemi demonstrert for studier av H2 oksidasjon av en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...