Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Os autores reconhecem o BBSRC (BB/P005454/1), apoio financeiro. NH foi financiado pelo programa VILLUM Foundation Young Investigator.

1. preparação de uma mistura de lipídeos/UQ-10/FDLL
Nota: E. coli lipídios usados para a preparação dos lipossomas devem ser aliquotadas e cuidadosamente misturada com ubiquinona-10 (substrato) e long-comprimento de onda fluorescentes tingir-etiquetados lipídios (para determinação de tamanho de lipossomas) antes do reconstituição.
<ol><li>Utilizando uma seringa de vidro, 200 µ l de transferência de estoque de clorofórmio de lipídios polares extrair de Esc...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

O método descrito é adequado para estudar o próton bombeamento por proteínas de membrana respiratória que podem ser reconstituídas em lipossomas e são capaz de trocar elétrons com o pool de quinona. Atividade de bombeamento de prótons podem ser monitorado no nível do single-enzima usando corantes sensíveis ao pH (ratiometric) encapsulados no lúmen do lipossoma (figura 1A).
O método baseia-se na capacidade de ubiquinona (ou outras quinonas), incorporad...

Informação sobre a cinética e mecanismos de enzima é normalmente obtida a nível ensemble ou macroescala com população de enzima em milhares de milhões de moléculas, onde as medições representam uma média estatística. Sabe-se, entretanto, que macromoléculas complexas tais como enzimas podem demonstrar a heterogeneidade em seu comportamento e mecanismos moleculares observados no nível de conjunto não são necessariamente válidos para cada molécula. Tais desvios na escala de molécula individual foram extensivamente confirmados por estudos de enzimas único com uma variedade de métodos emergentes durante as últimas duas décadas1. Notavelmente, deteção de fluorescência da atividade de cada enzima tem sido usada para investigar a heterogeneidade das enzimas atividade2,3 ou descobrir o efeito de memória so-called (períodos de atividade de enzimas alta sucedido por períodos de baixa atividade e vice-versa)4,5.
Muitos estudos única enzima exigem que as enzimas são imobilizadas na superfície ou espacialmente fixo em outra maneira de manter-se suficientemente longo no campo de visão para observação contínua. Encapsulamento de enzima em lipossomas foi mostrado para habilitar a imobilização da enzima, evitando qualquer impacto negativo devido a superfície-enzima ou proteína-proteína interações6,7. Além disso, os lipossomas oferecem uma possibilidade única de estudar proteínas de membrana única em sua natural lipídios BICAMADA ambiente8,9,10.
Uma classe de proteínas de membrana, transportadores, exerce uma translocação direcional de substâncias através da membrana celular, um comportamento que pode ser estudado somente quando as proteínas são reconstituídas para o lipid bilayers (por exemplo, os lipossomas)11, 12,13. Por exemplo, translocação de protões, exibida por várias enzimas das cadeias de transporte electrónico de procariontes e eucariontes, desempenha um papel importante na respiração celular através da criação de uma força motriz protónica usada para a síntese de ATP. Neste caso, o próton atividade de bombeamento é acoplado à transferência de elétrons, embora o mecanismo detalhado deste processo muitas vezes continua elusivo.
Recentemente, temos demonstrado a possibilidade de detecção fluorescente de casal com eletroquímica para estudar próton bombeamento a atividade das enzimas única da terminal ubiquinol oxidase de Escherichia coli (citocromo bo3) reconstituído em lipossomas14. Isto foi conseguido através do encapsulamento de um corante fluorescente-membrana impermeável de sensíveis ao pH no lúmen de lipossomas preparados a partir de E. coli lipídios polares (figura 1A). A quantidade de proteína foi otimizada, assim que a maioria dos lipossomas também continham nenhuma ou apenas uma molécula de enzima reconstituído (de acordo com a distribuição de Poisson). Os dois substratos do citocromo bo3 foram fornecidos pela adição de ubiquinona à mistura lipídica que formou os lipossomas e oxigênio (ambiente) em solução. Os lipossomas são, então, escassamente adsorvidos em um eletrodo de ouro ultra-suave semi transparente, coberto com uma monocamada auto montada de 6-mercaptohexanol. Finalmente, o eletrodo é montado na parte inferior de uma célula de spectroelectrochemical simples (figura 1B). Controle eletroquímica do estado redox quinona piscina permite flexìvel acionar ou parar a reação enzimática, a qualquer momento, enquanto a tintura sensíveis ao pH é usada para monitorar as alterações de pH dentro do lúmen dos lipossomas como resultado da translocação de protões pelo enzimas. Usando que a intensidade de fluorescência de uma segunda, lipid-limite tintura fluorescente, o tamanho e volume de lipossomas individuais pode ser determinada e, portanto, a quantificação do próton enzima atividade de bombeamento. Usando esta técnica, nomeadamente encontramos que moléculas de citocromo bo3 são capazes de entrar em um estado de fuga espontânea que dissipa-se rapidamente a força motriz protónica. O objetivo deste artigo é apresentar a técnica de medições em lipossomas único em detalhe.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Bombeamento de prótons enzimas de elétron transferir reações de redox de duas cadeias de translocação de prótons através da membrana, criando uma força motriz protónica usada para a produção de ATP. A natureza anfifílica das proteínas de membrana requer especial atenção ao seu manuseamento e reconstituição no ambiente natural de lipídios é indispensável ao estudar os processos de transporte da membrana como translocação de prótons. Aqui, detalhamos um método que foi usado para a investigação do mecanismo de bombeamento de prótons de enzimas redox de membrana, tomando citocromo bo3 de Escherichia coli , por exemplo. Uma combinação de eletroquímica, microscopia de fluorescência é usada para controlar o estado de redox das quinona monitor e piscina pH mudanças no lúmen. Devido a resolução espacial de microscopia fluorescente, centenas de lipossomas podem ser medidas simultaneamente enquanto o conteúdo de enzima pode ser escalado para baixo para uma única enzima ou transportador por lipossomas. A análise dos respectivos única enzima pode revelar padrões na dinâmica funcional da enzima que pode ser oculto pelo comportamento de toda a população. Nós incluímos uma descrição de um script para análise automatizada de imagem.

A qualidade do ouro-modificado lamínula (eletrodo) com uma SAM de 6MH é verificada antes de cada experimento com espectroscopia de impedância eletroquímica. Figura 2A mostra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando espectroscopia de impedância eletroquímica, antes e depois de lipossomas são adsorvidos. Se a qualidade do SAM é suficiente, espectroscopia de impedância deve demonstrar um comportamento capacitivo quase puro, resultando em uma...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3 como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Este método permite o estudo da atividade de transporte de prótons de enzimas de membrana respiratória como o citocromo BO3 em um ambiente de camadas bi-camadas lipídicas naturais. As principais vantagens desta única técnica enzimática é a possibilidade de iniciar e parar reações enzimáticas a qualquer momento usando eletroquímica. Usando uma seringa de vidro transferir 200 microliters de estoque de clorofórmio de extrato polar lipídico de Escherichia coli em frascos de vidro para fazer cinco alíquotas miligramas.Adicione 50 microliters de um miligrama por mililitro ubiquinona 10 aos lipídios para fazer a proporção final de um a 100 ubiquinona 10 para lipídios. À mistura adicione 20 microliters de um miligrama por mililitro de comprimento de onda longa corante fluorescente rotulado lipídio abreviado FDLL. Homogeneize a solução de clorofórmio por vórtice curto e evaporar a maior parte do clorofórmio sob um suave fluxo de nitrogênio ou argônio.Remova os traços de clorofórmio inteiramente por evaporação adicional sob vácuo por pelo menos uma hora. Adicione 312,5 microliters de 40 mililitros de pH pH 7.4 a uma alíquota de lipídios ubiquinona 10 FDLL mistura seca. Misture o vórtice até que o filme lipíduo seja totalmente re-suspenso seguido de dois minutos de tratamento em um banho ultrassônico.Em seguida, adicione 125 microliters de 25 milimolares HPTS, um corante fluorescente sensível ao pH que será encapsulado dentro dos lipossomos. Agora adicione 137,5 microliters de 250 milimões de surfactante OGP. Depois de misturar usando vórtice, sonicize a mistura em um banho de água ultrassônica por 10 minutos para garantir que todos os lipídios sejam solubilizados em micelas surfactantes.Em seguida, transfira a dispersão para um tubo plástico de 1,5 mililitro. Adicione a quantidade necessária de cytocromo BO3 e adicione água ultra pura para fazer um volume total de 50 microliters. Incubar a mistura de reconstituição a quatro graus celsius por 10 minutos em uma batedeira.Em seguida, pesam 50 miligramas de microesferas de poliestireno em cada uma das duas tampas de tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, pese 100 miligramas de microesferas de poliestireno em outras duas tampas de tubo de 1,5 mililitro. Feche as tampas com filme de parafina para evitar a secagem.Adicione os primeiros 50 miligramas de microesferas de poliestireno na mistura de reconstituição colocando a tampa com microesferas de poliestireno no tubo plástico de 1,5 mililitro com a dispersão preparada. Em seguida, faça um giro curto por alguns segundos para trazer microesferas para o fundo do tubo. Incubar a suspensão a quatro graus celsius em uma batedeira para permitir que as microesferas de poliestireno absorvam o surfactante por 30 minutos.Repita as adições de microesferas de poliestireno e incubações da seguinte forma. Adicione 50 miligramas de microesferas por 60 minutos de incubação. Em seguida, adicione 100 miligramas de microesferas por 60 minutos de incubação.E, finalmente, adicione 100 miligramas de microesferas por 120 minutos de incubação. Separe a solução proteoliposome das microesferas de poliestireno usando uma micropipette com uma ponta fina. Diluir a dispersão em 90 mililitros de tampão MOPS no tubo ultracentrifuuge TI 45.Ultracentrize a dispersão usando um rotor TI tipo 45 a 125.000 vezes G durante uma hora para pellet os proteoliposomes. Após a ultracentrização, descarte o supernascimento e enxágue as pelotas com tampão MOPS sem reutilizar a pelota. Depois de descartar o tampão de lavagem, suspenda os proteoliposomes em 500 microliters de tampão MOPS, pipetando-o para frente e para trás com uma micropipette fina antes de transferir a suspensão para um tubo plástico de 1,5 mililitro.Após a centrifugação por cinco minutos a 12.000 vezes G para remover os detritos, transfira o supernatante que é o proteoliposomes reconstituído em um novo frasco. Cole até nove deslizamentos de tampa de vidro em uma superfície de ouro evaporada usando epóxi de baixa fluorescência bi-componente. Cure a cola a 80 graus celsius por quatro horas.Pouco antes da modificação com uma mono camada auto-montada, desprender a tampa de vidro desliza dos wafers de silicone com uma lâmina. Devido à magreza dos deslizamentos de cobertura, tome cuidado ao desprender os deslizamentos de cobertura para não quebrar ou quebrar os slides de vidro. Mergulhe a tampa recém-destacada revestida de ouro em uma solução de 6 marcasptohexanol e deixe a 20 a 25 graus celsius durante a noite para formar a auto-camada.No dia seguinte, remova os deslizamentos revestidos de ouro da solução e lave brevemente com água ou metanol e, em seguida, com isopropanol. Seque os deslizamentos revestidos de ouro sob um fluxo suave de gás. Monte o deslizamento de cobertura revestido de ouro em uma célula espectro-eletroquímica como diagramado no protocolo de texto.Faça contato com o ouro com um fio plano fora de uma área definida por um anel O de borracha e aparafusar firmemente a célula eletroquímica em cima dele. Adicione dois mililitros da solução tampão de eletrólitos e coloque os eletrodos de referência e auxiliares na célula. Proceda para verificar a qualidade da mono camada auto-montada e executar espaços em branco conforme descrito no protocolo de texto.Adicione proteoliposomes à célula eletroquímica a 0,5 miligramas por concentração de lipídios finais mililitros e misture ligeiramente com uma pipeta. Aguarde de 30 a 60 minutos em temperatura ambiente até que a absorção de proteolipóss na superfície do eletrodo esteja concluída. Lave a célula alterando a solução tampão pelo menos 10 vezes, mas evite deixar a superfície do eletrodo completamente seca.Agora, execute espectroscopia eletroquímica de impedância em potencial de célula aberta para confirmar que a mono-camada auto-montada no eletrodo de ouro permanece inalterada. Execute os ciclogramas cíclicos com taxas de varredura 10 e 100 milvolts por segundo para observar a oxidação catalítica de ubiquinol e a redução de oxigênio por cytocromo BO3 em potencial de início de redução eletroquímica da quinone. Modifique o eletrodo de ouro como antes, mas usando cinco microgramas por proteoliposomes mililitros.Para estudos de enzima única reduza a relação citocromo BO3 para lipídio entre 0,1 e 0,2% Coloque uma gota de óleo de imersão e, em seguida, a célula eletroquímica no objetivo 60 vezes do óleo de um microscópio de fluorescência invertida. Utilizando filtros apropriados para fluorescência FDLL, concentre-se na superfície do eletrodo. Lipossomos únicos devem aparecer como pontos brilhantes no limite de difração do objetivo do microscópio.Tire uma imagem da florescência da FDLL. Mude para um dos conjuntos de filtros de floresnce do HPTS no microscópio para verificar se a florescence HTPS é claramente visível e distinguível a partir do fundo. Aumente a intensidade da luz se não for o caso.Programe o software de microscópio para realizar uma aquisição de imagem cronometrado alternando dois conjuntos de filtros HTPS. Para isso, defina uma exposição de um segundo e navegue para aplicativos de menu. Em seguida, defina/execute a aquisição do ND e selecione dois canais HTPS.Defina o atraso entre as aquisições de imagens no mínimo. Neste experimento use 0,3 segundo de atraso e duração total de cinco minutos. Ajuste as configurações do potencialiostat para alterar o potencial durante a aquisição da imagem, conforme indicado no protocolo de texto.Agora, execute simultaneamente a aquisição de imagem cronometrado no microscópio e a sequência potencial no potencialiostat, iniciando manualmente ambas as medições ao mesmo tempo. Aqui são mostradas imagens de fluorescência de lipossomos absorvidos nos eletrodos em três coberturas diferentes. O corante contendo lipossomos são visíveis nas imagens como pontos brilhantes.A parte central da imagem foi foto-branqueada para revelar o nível de floresnce de fundo. As imagens em dois canais HTPS são super imposiveis onde a razão entre os dois canais corresponde a um pH de 7,4 usado neste experimento. Um número maior de lipossomos são visíveis com o canal FDLL, o que indica a presença de lipossomos que não têm HPTS encapsulados.A diferença entre os canais HPTS e FDLL é mais acentuada em coberturas mais altas. Possivelmente porque em alta cobertura liposso, lipossomos são mais propensos a estourar ou fundir na superfície. Aqui, a mudança de um florescência lipossa em dois canais HTPS é mostrada como um gráfico de superfície 3D da área correspondente durante 300 segundos do experimento.O potencial redutivo foi aplicado entre 60 segundos e 180 segundos. A proporção correspondente da razão de intensidade métrica de volume de dois canais HPTS versus tempo é mostrada. Aqui estão as medianas de todas as alterações de pH vesícula dentro de uma única imagem quando o teor de CYtocromo BO3 é de 1,3% Um aumento no pH é claramente visível quando um potencial entre 0,1 e 0,3 volts é aplicado.Quando o teor de CYtocromo BO3 é um valor muito menor de 0,1% as curvas medianas tornam-se quase indistinguíveis das de lipossomos vazios. É importante garantir a remoção completa do surfactante das dispensas lipossas, uma vez que os resíduos podem aumentar a permeabilidade dos lipossos aos prótons. Esses métodos permitem-nos fazer perguntas específicas sobre o substrato de quinona lipofílico natural em contraste com os análogos de quinone solúveis em água frequentemente usados.Além disso, os experimentos de enzimas identificaram um estado de vazamento até então desconhecido onde a proteína age como um canal de prótons onde prótons fluem livremente para trás.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Bioquímica

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Proteína de filme infravermelho eletroquímica demonstrada por estudo de oxidação de2 H pela hidrogenase [NiFe]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...