Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Авторы признают СИББН (BB/P005454/1) для финансовой поддержки. NH финансировалась Программа следователь ВИЛЛУМ Фонд молодых.

1. Подготовка смеси липидов/UQ-10/FDLL
Примечание: E. coli липиды используются для приготовления липосомы должно быть aliquoted и тщательно смешивается с убихинон-10 (фермент субстрата) и длинноволновых Флюоресцентная краска меченых липиды (для определения размера липосомы) ...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

Метод, описанный подходит для изучения Протон накачки дыхательных мембранных белков, которые могут быть преобразованы в липосомах и имеют возможность обмениваться электронов с бассейном хиноны. Протон, насосные деятельность может контролироваться на уровне сингл фермента, используя...

На уровне ансамбля или macroscale с населением фермента в тысяч до миллионов молекул, где измерения представляют среднестатистический обычно информации о механизмах фермента и кинетика. Это известно, однако, что сложные макромолекулы как ферменты могут демонстрировать разнородность в их поведении и молекулярные механизмы на уровне ансамбля не обязательно верны для каждой молекулы. Такие отклонения в масштабе отдельных молекулы были широко подтверждены исследования одного ферментов с различными методами, возникающих в ходе последних двух десятилетий1. В частности флуоресценции обнаружения отдельных ферментативной активности был использован для расследования гетерогенность ферментов активность2,3 или обнаружить эффект так называемой памяти (периоды преуспело в периоды низкой активности высокой ферментов активность и наоборот)4,5.
Многие исследования одного фермента требуют, что ферменты иммобилизованных на поверхности или пространственно фиксированной в еще один способ оставаться достаточно долго, в поле зрения для непрерывного наблюдения. Было показано, что фермент инкапсуляции в липосомах включить иммобилизации фермента и предотвращения любых негативных последствий из-за поверхность фермента или белок белковых взаимодействий6,7. Кроме того липосомы предлагают уникальную возможность для изучения одного мембранных белков в их естественный липидный бислой окружающей среды8,9,10.
Класс мембранных белков, транспортеры, осуществляет направленного транслокации веществ через клеточную мембрану, поведение, которое можно изучать только когда белки будут преобразованы в липидных бислоев (например, липосомы)11, 12,13. Например Протон транслокации, выставлены несколько ферментов цепи переноса электронов прокариот и эукариот, играет важную роль в клеточное дыхание, создавая Протон движущая сила используется для синтеза АТФ. В этом случае Протон, насосные деятельность сочетается электрона передачи, хотя детальный механизм этого процесса часто ускользает.
Недавно мы продемонстрировали возможность флуоресцентного обнаружения пара с электрохимии для изучения Протон накачки активность ферментов одного терминала убихинола оксидазы Escherichia coli (цитохромы Бо3) Восстановленный в липосомах14. Это было достигнуто путем инкапсуляции рН чувствительной мембраны непроницаемый Люминесцентную краску в Люмене липосомы, подготовленных от э. coli полярных липидов (рис. 1A). Количество белка был оптимизирован так, что большинство липосомы либо содержащиеся не или только одна молекула восстановленный фермента (в зависимости от распределения Пуассона). Два субстратов цитохрома Бо3 были предоставлены путем добавления убихинон смесь липидов, который сформировал липосомы и кислорода (окружающей среды) в растворе. Липосомы затем малонаселенных адсорбированные на полупрозрачных Сверхплавное золото электрода, покрытые собственн-собранные монослоя 6-mercaptohexanol. Наконец электрод монтируется на нижней части простого spectroelectrochemical клеток (рис. 1B). Электрохимический управления хиноны бассейн окислительно-восстановительного состояния позволяет гибко запустить или остановить ферментативной реакции в любой момент, в то время как рН чувствительных краска используется для мониторинга изменений рН внутри просвета липосомы результате Протон транслокации, ферменты. С помощью интенсивности флуоресценции второй, липидов прыгните Люминесцентную краску, размер и объем отдельных липосомы могут определяться и таким образом количественной фермента Протон, насосные деятельности. Используя эту технику, мы особенно обнаружили, что цитохромы Бо3 молекулы способны войти в состояние спонтанной утечки, что быстро рассеивается Протон движущей силой. Цель этой статьи заключается в внедрения метода измерений одного липосомы в деталях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Протон насосные ферменты электрона передачи цепи пара окислительно-восстановительных реакций в Протон транслокации через мембрану, создавая Протон движущей силы, используемые для производства АТФ. Амфифильных характер мембранных белков требует особого внимания к их обработки, и растворения в среду естественный липидный незаменима при изучении процессов переноса мембран как Протон транслокации. Здесь мы подробно метод, который был использован для исследования механизма Протон насосные мембраны окислительно-восстановительных ферментов, принимая цитохрома Бо3 от кишечной палочки в качестве примера. Сочетание электрохимии и флуоресцентной микроскопии используется для управления состоянием редокс хиноны бассейн и монитор изменений рН в просвете. Из-за пространственное разрешение флуоресцентной микроскопии сотни липосомы могут быть измерены одновременно в то время как содержание ферментов может быть уменьшен на одного фермента или транспортер в липосомы. Анализ соответствующих одного фермента может выявить закономерности в фермента функциональной динамики, которая в противном случае могут быть скрыты от поведения населения в целом. Мы включать описание скрипта для автоматизированного анализа.

Качество золота модифицированные покрытие скольжения (электрод) с СЭМОМ 6MH проверяется перед каждой эксперимент с электрохимических импедансной спектроскопии. Рисунок 2A показывает представитель участки Коул-Коул, измеряется с использованием электр?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Здесь мы представляем протокол изучать молекулярный механизм Протон транслокации через липидные мембраны одной липосом, с использованием цитохрома Бо3 в качестве примера. Сочетая электрохимии и микроскопии флуоресцирования, изменения рН в просвете одного везикулы, содержащие один или несколько фермента, могут быть обнаружены и анализируются индивидуально.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Этот метод позволяет изучать протонную транспортную активность ферментов дыхательных мембран, таких как цитохром BO3, в естественной липидной двухслойной среде. Основным преимуществом этой единственной ферментной техники является возможность запуска и остановки ферментативных реакций в любой момент с помощью электрохимии. Использование стеклянного шприца передачи 200 микролитров хлороформного запаса липидного полярного экстракта из кишечной палочки в стеклянные флаконы, чтобы сделать пять миллиграммовых алицитов.Добавьте 50 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр убихинона 10 к липидам, чтобы сделать окончательное соотношение от одного до 100 убихинона 10 к липидам. К смеси добавить 20 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр длинноволнового флуоресцентного красителя с надписью lipid сокращенно FDLL. Гомогенизировать раствор хлороформа коротким вихрем и испарять большую часть хлороформа под нежным потоком азота или аргона.Удалите следы хлороформа полностью путем дальнейшего испарения под вакуумом, по крайней мере один час. Добавьте 312,5 микролитров 40 миллимолярной MOPS pH 7.4 буфера к одной алиците липидов убихинона 10 FDLL сухой смеси. Смешайте вихрь до липидной пленки полностью повторно приостановлено следуют две минуты лечения в ультразвуковой ванне.Далее добавьте 125 микролитров 25 миллимолярной HPTS, чувствительный рН флуоресцентный краситель, который будет инкапсулирован внутри липосом. Теперь добавьте 137,5 микролитров 250 миллимолярный OGP сурфактант. После смешивания с помощью вихря, sonicate смесь в ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут, чтобы обеспечить все липиды solubilized в сурфактант micelles.Затем перенесите дисперсию в пластиковую трубку на 1,5 миллилитров. Добавьте необходимое количество цитохрома BO3 и добавьте ультра чистую воду, чтобы сделать общий объем 50 микролитров. Инкубировать смесь восстановления при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут на роликовом миксере.Следующий вес 50 миллиграммов полистирола микробусы в каждом из двух 1,5 миллилитров трубки шапки. Затем взвесить 100 миллиграммов полистирола микробусы в еще два 1,5 миллилитров трубки шапки. Закройте колпачки парафиновой пленкой, чтобы предотвратить высыхание.Добавьте первые 50 миллиграммов полистирола микробусы в смесь восстановления, поставив крышку с полистирола микробусы на 1,5 миллилитров пластиковой трубки с подготовленной дисперсии. Затем выполните короткий спин в течение нескольких секунд, чтобы принести микробусы на дно трубки. Инкубировать подвеску при четырех градусах по Цельсию на ролик смеситель, чтобы полистирол микробусы поглощать сурфактант в течение 30 минут.Повторите добавления полистирола микробусы и инкубации следующим образом. Добавьте 50 миллиграммов микробусов в течение 60 минут инкубации. Затем добавьте 100 миллиграммов микробусов в течение 60 минут инкубации.И, наконец, добавить 100 миллиграммов микробусов в течение 120 минут инкубации. Отделить протеолипосомный раствор от полистирола микробусы с помощью микропипета с тонким кончиком. Разбавить дисперсию в 90 миллилитров буфера MOPS в TI 45 ультрацентрифуг трубки.Ультрацентрифуг дисперсии с использованием ротора типа 45 TI при 125 000 раз G в течение одного часа, чтобы гранулировать протеолипосомы. После ультрацентрифугации отбросьте супернатант и промойте гранулы буфером MOPS, не перерасходуя гранулы. После отбрасывания полоскания буфера, повторно приостановить протеолипосомы в 500 микролитров буфера MOPS путем трубопроводов его туда и обратно с тонким наконечником micropipette перед передачей подвески на 1,5 миллилитров пластиковой трубки.После центрифугации в течение пяти минут в 12 000 раз G, чтобы удалить мусор, передать супернатант, который является восстановленным proteoliposomes в новый флакон. Клей до девяти стеклянный покров скользит на испаряется золотая поверхность с помощью двухкомпонентных низкофлуоресценции эпоксидной смолы. Лечить клей при 80 градусах по Цельсию в течение четырех часов.Незадолго до модификации с самосборкой монослоя, отсоедините стеклянную крышку скользит от силиконовых пластин с лезвием. Из-за тонкости крышки скользит, заботиться при отсоединения крышки скользит, чтобы не трещины или разбить стеклянные слайды. Dip свежеотдельный позолоченный покрытием крышка скользит в 6-marcaptohexanol раствор и оставить при 20 до 25 градусов по Цельсию на ночь, чтобы сформировать самостоятельно собранный монослой.На следующий день, удалить покрытие с золотым покрытием скользит от раствора и мыть кратко с водой или метанолом, а затем с изопропанолом. Сухая крышка с золотым покрытием скользит под нежным потоком газа. Соберите крышку с золотым покрытием в спектро-электрохимическую ячейку, как это показано в текстовом протоколе.Установить контакт с золотом с плоской проволокой за пределами области определяется резиновым O-кольцо и плотно винт вниз электрохимической ячейки на верхней части его. Добавьте два миллилитров электролитного буферного раствора и поместите в ячейку эталонные и вспомогательные электроды. Приступайте к проверке качества самостоятельно собранного монослоя и запускайте пробелы, описанные в текстовом протоколе.Добавить протеолипосомы в электрохимическую клетку при 0,5 миллиграмма на миллилитр конечной концентрации липидов и слегка смешать с пипеткой. Подождите от 30 до 60 минут при комнатной температуре, пока поглощение протеолипосом на поверхности электрода не будет закончено. Вымойте ячейку, изменив буферный раствор по крайней мере 10 раз, но не оставляйте поверхность электрода полностью сухой.Теперь запуск электрохимической спектроскопии на открытой клеточной потенциале для подтверждения самосборного монослоя на золотом электроде остается неизменным. Запуск циклических вольтамммограмм со скоростью сканирования 10 и 100 милливольт в секунду для наблюдения каталатической окисления убихинола и сокращения кислорода цитохром bo3 при наступлении потенциалов электрохимического сокращения хинона. Измените золотой электрод, как и раньше, но используя пять микрограммов на миллилитр протеолипосомы.Для одного фермента исследования уменьшить цитохром BO3 к липидное соотношение между 0,1 и 0,2%Поместите каплю масла погружения, а затем электрохимической клетки на 60 раз масляной цели перевернутой флуоресценции микроскопа. Используя соответствующие фильтры для флуоресценции FDLL, сосредоточьтесь на поверхности электрода. Одиночные липосомы должны появляться как яркие пятна на пределе дифракции цели микроскопа.Сделай снимок флуоресценции FDLL. Переключитесь на один из наборов фильтра флуоресценции HPTS на микроскопе, чтобы убедиться, что флуоресценция HTPS хорошо видна и различима от фона. Увеличьте интенсивность света, если это не так.Программа микроскоп программного обеспечения для выполнения приутупляется изображение приобретения путем чередования двух наборов фильтров HTPS. Для этого установите одну секунду экспозиции, а затем перейдите в приложения меню. Затем определите/запустите приобретение ND и выберите два канала HTPS.Установите задержку между приобретениями изображений как минимум. В этом эксперименте используйте 0,3-секундную задержку и пятиминутную общую продолжительность. Отрегулируйте настройки potentiostat, чтобы изменить потенциал во время приобретения изображения, как указано в текстовом протоколе.Теперь одновременно запустите время получения изображения на микроскопе и потенциальную последовательность на potentiostat, вручную начав оба измерения в то же время. Здесь показаны флуоресцентные изображения липосом, поглощаемые электродами при трех различных покрытиях. Краситель, содержащий липосомы, виден на изображениях как яркие пятна.Центральная часть изображения была отбеленной, чтобы показать уровень фоновых флоресок. Изображения на двух каналах HTPS сверхвыразимы там, где соотношение между двумя каналами соответствует рН 7,4, используемому в этом эксперименте. Большее количество липосом видны с каналом FDLL, что указывает на наличие липосом, которые не инкапсулированы HPTS.Разница между каналами HPTS и FDLL более выражена при более высоком охвате. Возможно, потому, что при высоком липосоме покрытие, липосомы, скорее всего, лопнет или предохранитель на поверхности. Здесь изменение липосомной флуоресценции на двух каналах HTPS отображается как 3D поверхностный участок соответствующей области в течение 300 секунд эксперимента.Редуктивный потенциал применялся от 60 секунд до 180 секунд. Показан соответствующий участок соотношения интенсивности метрики объема двух каналов HPTS к времени. Здесь показаны медианы всех изменений pH vesicle в пределах одного изображения, когда содержание цитохрома BO3 составляет 1,3%Увеличение рН хорошо видно, когда потенциал между 0,1 и 0,3 вольт применяется.Когда содержание цитохрома BO3 значительно ниже значения 0,1%, средние кривые становятся почти неотличимыми от значений пустых липосом. Важно обеспечить полное удаление сурфактанта из липосомных диспенсаций, так как остатки могут увеличить проницаемость липосом протонов. Эти методы позволяют задавать конкретные вопросы о натуральном липофильном субстрате хинона в отличие от часто используемых водорастворимых аналогов хинона.Более того, эксперименты с одним ферментом выявили ранее неизвестное состояние утечки, в котором белок действует как протонный канал, где протоны свободно текут назад.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Одиночных молекул Super-Resolution Imaging фосфатидилинозит 4,5-бисфосфат в плазматической мембране с новыми флуоресцентных зондов

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления2 H

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Визуализация диффузной динамики золотых нанородов на клеточной мембране с помощью одной наночастицы Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...