Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
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Los autores reconocen la BBSRC (BB/P005454/1) para apoyo financiero. NH fue financiado por el programa de VILLUM Fundación joven investigador.

1. preparación de una mezcla de lípidos/UQ-10/FDLL
Nota: E. coli lípidos utilizados para la preparación de los liposomas deben ser alícuotas y muy bien mezclada con la ubiquinona-10 (sustrato de la enzima) y onda larga fluorescentes tinte etiquetado lípidos (para determinación del tamaño de liposomas) antes del reconstitución.
<ol><li>Utilizando una jeringuilla de cristal, extracto de transferencia 200 μL del stock de cloroformo de lípidos polares de Escheric...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

El método descrito es adecuado para el estudio de las proteínas de la membrana respiratoria que pueden ser reconstituidas en liposomas de bombeo de protones y son capaces de intercambiar electrones con la piscina de la quinona. Actividad de bombeo del protón puede controlarse a nivel individual-enzima con colorantes sensibles al pH (proporcionales) encapsulados en el lumen del liposoma (figura 1A).
El método se basa en la capacidad de ubiquinona (u otras quino...

Información sobre mecanismos de enzimas y cinética se obtiene generalmente en el nivel de conjunto o de macroescala con población de enzima en los miles de millones de moléculas, donde las mediciones representan un promedio estadístico. Se sabe, sin embargo, que macromoléculas complejas como las enzimas pueden demostrar heterogeneidad en su comportamiento y mecanismos moleculares observados a nivel de conjunto no son necesariamente válidos para cada molécula. Tales desviaciones en la escala de la molécula individual han sido ampliamente confirmados por estudios de enzimas individuales con una variedad de métodos emergentes durante el último dos décadas1. En particular, detección de la fluorescencia de la actividad enzimática individuales se ha utilizado para investigar la heterogeneidad de la actividad de enzimas2,3 o descubrir el efecto de memoria supuesto (períodos de actividad de las enzimas altas por periodos de baja actividad y viceversa)4,5.
Muchos estudios de la enzima solo requieren que las enzimas son inmovilizadas sobre la superficie o espacial fija de otra manera permanecer suficientemente largo en el campo de visión para la observación continua. Encapsulación de enzima en liposomas se ha demostrado para permitir la inmovilización de la enzima al tiempo que evita cualquier impacto negativo por la superficie enzimas o proteínas interacciones6,7. Además, liposomas ofrecen una posibilidad única para el estudio de proteínas de la membrana solo en sus lípidos naturales bicapa entorno8,9,10.
Una clase de proteínas de membrana, transportadores, ejerce un desplazamiento direccional de sustancias a través de la membrana celular, un comportamiento que sólo puede ser estudiada cuando las proteínas se reconstituyen en el lípido bicapas (por ejemplo, liposomas)11, 12,13. Por ejemplo, translocación de protones, expuesto por varias enzimas de cadenas de transporte del electrón de prokaryotic y eukaryotic, desempeña un papel importante en la respiración celular, mediante la creación de una fuerza protón-motriz utilizada para la síntesis de ATP. En este caso, la actividad de bombeo de protones está acoplado a la transferencia de electrones, aunque el mecanismo detallado de este proceso a menudo sigue siendo elusivo.
Recientemente, hemos demostrado la posibilidad de detección fluorescente par con electroquímica para el estudio de actividad de las enzimas individuales de la oxidasa terminal ubiquinol de Escherichia coli (citocromo bo3) de bombeo de protones reconstituida en liposomas14. Esto se logró mediante la encapsulación de un colorante fluorescente impermeable membrana sensible al pH en el lumen de liposomas preparados a partir de E. coli lípidos polares (figura 1A). La cantidad de proteína fue optimizada para que liposomas mayoría tampoco contienen ninguna o solamente una molécula de enzima reconstituido (según la distribución de Poisson). Los dos sustratos de citocromo bo3 fueron proporcionados mediante la adición de ubiquinona a la mezcla de lípidos que forman los liposomas y el oxígeno (ambiente) en solución. Los liposomas son entonces escasamente fijado por adsorción en un electrodo de oro ultra suave semitransparente, cubierto con una monocapa uno mismo-montado de 6-mercaptohexanol. Finalmente, el electrodo se monta en la parte inferior de una celda electroquímicas simple (figura 1B). Control electroquímico del estado redox quinona piscina permite una flexible activar o detener la reacción enzimática en cualquier momento, mientras que el tinte pH-sensible se utiliza para monitorear cambios en el pH dentro del lumen de los liposomas como resultado de la translocación de protones por el enzimas. Por utilizar que se puede determinar la intensidad de fluorescencia de un colorante fluorescente en segundo lugar, enlazados a lípidos, el tamaño y el volumen de los liposomas y la cuantificación de protones enzima actividad de bombeo. Usando esta técnica, en particular encontramos que citocromo bo3 moléculas son capaces de entrar en un estado de escape espontáneo que rápidamente se disipa la fuerza motriz protónica. El objetivo de este artículo es presentar la técnica de mediciones solo liposomas en detalle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Enzimas bombas de protones, de electrones de transferencia cadenas par redox las reacciones de translocación de protón a través de la membrana, creando una fuerza protón-motriz utilizada para la producción de ATP. La naturaleza anfifílicas de proteínas de membrana requiere especial atención para su manejo y reconstitución en el medio lipídico natural es indispensable en el estudio de procesos de transporte de membrana como la translocación de protones. Aquí detallamos un método que se ha utilizado para la investigación del mecanismo de bombeo de protones de las enzimas redox de membrana, teniendo citocromo bo3 de Escherichia coli como ejemplo. Una combinación de microscopía electroquímica y de fluorescencia se utiliza para controlar el estado redox de las quinona piscina y monitorear cambios en el pH en el lumen. Debido a la resolución espacial de la microscopia fluorescente, cientos de liposomas se pueden medir simultáneamente mientras que el contenido de la enzima puede ser reducido a una sola enzima o transportador por liposomas. El análisis de la respectiva enzima solo puede revelar patrones en la dinámica funcional de enzimas que puede estar ocultos si no por el comportamiento de toda la población. Incluimos una descripción de una secuencia de comandos para el análisis de imagen automatizado.

La calidad de la hoja cubierta oro modificado (el electrodo) con un SAM de 6MH se comprueba antes de cada experimento con espectroscopía de impedancia electroquímica. Figura 2A muestra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando la espectroscopia de impedancia electroquímica antes y después de liposomas son adsorbidos. Si la calidad de SAM es suficiente, espectroscopía de impedancia debe demostrar un comportamiento capacitivo casi puro dando por...

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Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medidas solo de liposomas para el estudio de enzimas de membrana bombas de protones usando electroquímica y microscopia fluorescente

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo molecular de la translocación de protones a través de membranas lipídica de liposomas sola, usando citocromo bo3 como ejemplo. Combinación electroquímica y microscopia de fluorescencia, cambios en el pH en el lumen de las vesículas individuales, contienen solo o múltiples enzimas, puede ser detectado y analizado individualmente.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Este método permite el estudio de la actividad de transporte de protones de enzimas de membrana respiratoria como el citocromo BO3 en un ambiente natural de dos capas de lípidos. Las principales ventajas de esta técnica enzimática única es la posibilidad de iniciar y detener las reacciones enzimáticas en cualquier momento utilizando electroquímica. Usando una jeringa de vidrio transfiera 200 microlitros de material de cloroformo de extracto polar lipídico de Escherichia coli en viales de vidrio para hacer alícuotas de cinco miligramos.Añadir 50 microlitros de un miligramo por mililitro ubiquinona 10 a los lípidos para hacer la proporción final de uno a 100 ubiquinona 10 a lípidos. A la mezcla añadir 20 microlitros de un miligramo por mililitro de longitud de onda larga colorante fluorescente etiquetado FDLL abreviado de lípidos. Homogeneizar la solución de cloroformo mediante vórtice corto y evaporar la mayor parte del cloroformo bajo un suave flujo de nitrógeno o argón.Retire los rastros de cloroformo por completo por una mayor evaporación al vacío durante al menos una hora. Añadir 312,5 microlitros de 40 MOPS milimétricas pH 7.4 tampón a una alícuota de lípidos ubiquinona 10 FDLL mezcla seca. Mezclar el vórtice hasta que la película de lípidos se suspenda por completo seguido de dos minutos de tratamiento en un baño ultrasónico.A continuación, agregue 125 microlitros de 25 HPTS mililolares, un tinte fluorescente sensible al pH que se encapsulará dentro de los liposomas. Ahora agregue 137,5 microlitros de 250 surfactantes OGP mili evolucionadores. Después de mezclar usando vórtice, sonicar la mezcla en un baño de agua ultrasónica durante 10 minutos para asegurar que todos los lípidos se solubilizan en micelas surfactantes.A continuación, transfiera la dispersión a un tubo de plástico de 1,5 mililitros. Añadir la cantidad necesaria de citocromo BO3 y añadir agua ultra pura para hacer un volumen total de 50 microlitros. Incubar la mezcla de reconstitución a cuatro grados centígrados durante 10 minutos en una mezcladora de rodillos.A continuación, pesa 50 miligramos de microperla de poliestireno en cada una de las dos tapas de tubo de 1,5 mililitros. A continuación, pesar 100 miligramos de microperla de poliestireno en otras dos tapas de tubo de 1,5 mililitros. Cierre las tapas con película de parafina para evitar el secado.Añadir los primeros 50 miligramos de microperlas de poliestireno en la mezcla de reconstitución poniendo la tapa con microperlas de poliestireno en el tubo de plástico de 1,5 mililitros con la dispersión preparada. A continuación, realice un giro corto durante un par de segundos para llevar las microperlaces a la parte inferior del tubo. Incubar la suspensión a cuatro grados centígrados en una mezcladora de rodillos para permitir que las micropersiones de poliestireno absorban el surfactante durante 30 minutos.Repita las adiciones de microperdas de poliestireno e incubaciones de la siguiente manera. Añadir 50 miligramos de microperlas durante 60 minutos de incubación. Luego agregue 100 miligramos de microperlas durante 60 minutos de incubación.Y finalmente, añadir 100 miligramos de microperlas para 120 minutos de incubación. Separe la solución proteoliposoma de los micropers de poliestireno utilizando una micropipeta con una punta delgada. Diluir la dispersión en 90 mililitros de tampón MOPS en el tubo de ultracentrífuga TI 45.Ultracentrífaza la dispersión utilizando un rotor de tipo 45 TI a 125.000 veces G durante una hora para peletizar los proteoliposomas. Después de la ultracentrifugación, deseche el sobrenadante y enjuague los pellets con tampón MOPS sin resuspendir el pellet. Después de desechar el tampón de enjuague, vuelva a suspender los proteoliposomas en 500 microlitros de tampón MOPS pipegándolo de ida y vuelta con una micropipeta de punta fina antes de transferir la suspensión a un tubo de plástico de 1,5 mililitros.Después de la centrifugación durante cinco minutos a 12.000 veces G para eliminar los residuos, transfiera el sobrenadante que es los proteoliposomas reconstituidos a un vial nuevo. Pegue hasta nueve resbalones de cubierta de vidrio en una superficie de oro evaporado utilizando epoxi bicomponente de baja fluorescencia. Curar el pegamento a 80 grados centígrados durante cuatro horas.Justo antes de la modificación con una monocapa autoensamblada, desenganche los resbalones de la cubierta de vidrio de las obleas de silicona con una cuchilla. Debido a la delgadez de los resbalones de la cubierta, tenga cuidado al desmontar los resbalones de la cubierta para no agrietar o romper los portaobjetos de vidrio. Sumerja la cubierta recién desprendida recubierta de oro en una solución de 6-marcaptohexanol y deje a 20 a 25 grados centígrados durante la noche para formar la monocapa automontada.Al día siguiente, retire los resbalones de la cubierta recubierta de oro de la solución y lave brevemente con agua o metanol y luego con isopropanol. Seque la cubierta recubierta de oro se desliza bajo un suave flujo de gas. Montar el resbalón de cubierta recubierto de oro en una célula espectro-electroquímica como se diagrama en el protocolo de texto.Haga contacto con el oro con un alambre plano fuera de un área definida por una junta tórica de goma y atornille firmemente la célula electroquímica en la parte superior de la misma. Agregue dos mililitros de la solución tampón de electrolitos y coloque los electrodos de referencia y auxiliares en la célula. Proceda a comprobar la calidad de la monocapa automontada y ejecute espacios en blanco como se describe en el protocolo de texto.Añadir proteoliposomas a la célula electroquímica a 0,5 miligramos por mililitro de concentración final de lípidos y mezclar ligeramente con una pipeta. Espere de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente hasta que termine la absorción de proteoliposomas en la superficie del electrodo. Lave la célula cambiando la solución tampón al menos 10 veces, pero evite dejar la superficie del electrodo completamente seca.Ahora, ejecute la espectroscopia de impedancia electroquímica en el potencial de celda abierta para confirmar que la monocapa autoensamblada en el electrodo de oro permanece sin cambios. Ejecute voltammogramas cíclicos con velocidades de exploración de 10 y 100 milivoltios por segundo para observar la oxidación catalatica de ubiquinol y la reducción de oxígeno por citocromo BO3 en los potenciales de inicio de la reducción de quinona electroquímica. Modifique el electrodo de oro como antes pero utilizando cinco microgramos por mililitro proteoliposomas.Para estudios enzimáticos individuales, reducir la relación citocromo BO3 a lípidos a entre 0,1 y 0,2%Coloque una gota de aceite de inmersión y luego la célula electroquímica en el objetivo de aceite 60 veces de un microscopio de fluorescencia invertido. Usando filtros apropiados para la fluorescencia FDLL, concéntrese en la superficie del electrodo. Los liposomas individuales deben aparecer como puntos brillantes en el límite de difracción del objetivo del microscopio.Tome una imagen de FDLL florescence. Cambie a uno de los conjuntos de filtros de florescencia HPTS en el microscopio para verificar que la florescencia de HTPS es claramente visible y distinguible del fondo. Aumente la intensidad de la luz si no es el caso.Programe el software del microscopio para realizar una adquisición de imágenes cronopcionada alternando dos conjuntos de filtros HTPS. Para ello, establezca una exposición de un segundo y, a continuación, vaya a las aplicaciones de menú. A continuación, defina/ejecute ND Acquisition y seleccione dos canales HTPS.Establezca el retardo entre las adquisiciones de imágenes como mínimo. En este experimento utilice un retraso de 0,3 segundos y una duración total de cinco minutos. Ajuste la configuración del potenciostato para cambiar el potencial durante la adquisición de la imagen como se indica en el protocolo de texto.Ahora, ejecute simultáneamente la adquisición de imágenes cronometen en el microscopio y la secuencia potencial en el potenciostato iniciando manualmente ambas mediciones al mismo tiempo. Aquí se muestran imágenes de fluorescencia de liposomas absorbidos en los electrodos en tres coberturas diferentes. El tinte que contiene liposomas es visible en las imágenes como puntos brillantes.La parte central de la imagen fue blanqueada con foto para revelar el nivel de florescencia de fondo. Las imágenes en dos canales HTPS son súper imposiblesables donde la relación entre los dos canales corresponde a un pH de 7.4 utilizado en este experimento. Un mayor número de liposomas son visibles con el canal FDLL, lo que indica la presencia de liposomas que no tienen HPTS encapsulado.La diferencia entre los canales HPTS y FDLL es más pronunciada en coberturas más altas. Posiblemente porque con una cobertura de liposomas alta, los liposomas son más propensos a estallar o fusionarse en la superficie. Aquí, el cambio de una florescencia liposoma en dos canales HTPS se muestra como una gráfica de superficie 3D del área correspondiente durante 300 segundos del experimento.El potencial reductivo se aplicó entre 60 segundos y 180 segundos. Se muestra la gráfica correspondiente de la relación de intensidad métrica de volumen de dos canales HPTS frente al tiempo. Aquí se muestran las medianas de todos los cambios de pH de la vesícula dentro de una sola imagen cuando el contenido de citocromo BO3 es 1.3%Un aumento en el pH es claramente visible cuando se aplica un potencial entre 0.1 y 0.3 voltios.Cuando el contenido de citocromo BO3 es un valor mucho menor de 0.1%, las curvas medianas se vuelven casi indistinguibles de las de los liposomas vacíos. Es importante asegurar la eliminación completa del surfactante de las dispensaciones liposomas ya que los residuos pueden aumentar la permeabilidad de los liposomas a los protones. Estos métodos nos permiten hacer preguntas específicas sobre el sustrato natural de quinona lipofílica en contraste con los análogos de quinona soluble en agua a menudo utilizados.Además, los experimentos de una sola enzima identificaron un estado de fuga previamente desconocido donde la proteína actúa como un canal de protones donde los protones fluyen libremente hacia atrás.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

Bioquímica

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Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

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