Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Författarna erkänner BBSRC (BB/P005454/1) för ekonomiskt stöd. NH finansierades av programmet VILLUM Foundation Young Investigator.

1. beredning av en Lipid/UQ-10/FDLL Mix
Obs: E. coli lipider används för liposomer beredning bör vara aliquoted och grundligt blandas med ubikinon-10 (enzym substrat) och lång våglängd fluorescerande färgämne-märkt lipider (för liposomer storleksbestämning) före den beredning.
<ol><li>Använda en spruta av glas, överföring 200 µL av kloroform lager av lipid polar extrahera från Escherichia coli (25 mg/mL) till att göra 5 mg alikvoter injektionsflas...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

Den beskrivna metoden är lämplig att studera proton pumpning av respiratoriska membranproteiner som kan beredas i liposomer och kan utbyta elektroner med quinone poolen. Proton pumpning aktivitet kan övervakas på singel-enzym nivå använda pH-känsliga (proportionerlig) färgämnen inkapslade i Liposom lumen (figur 1A).
Metoden bygger på ubikinon (eller andra kinoner), införlivas i lipid lipidens, förmåga att utbyta elektroner med elektroder modifierad me...

Information om enzymet mekanismer och kinetik erhålls vanligtvis på ensemble eller macroscale nivå med enzym befolkning i tusentals till miljontals molekyler, där mätningar utgör ett statistiskt genomsnitt. Det är dock känt att komplexa makromolekyler som enzymer kan påvisa heterogenitet i sitt beteende och molekylära mekanismer som observerats på ensemble-nivå är inte nödvändigtvis giltiga för varje molekyl. Sådana avvikelser på individuell molekyl skalan har bekräftats i stor utsträckning genom studier av enstaka enzymer med en mängd metoder som växer fram under de senaste två decennierna1. Särskilt, har fluorescens identifiering av enskilda enzymaktivitet använts för att undersöka heterogenitet enzymer aktivitet2,3 eller upptäck den s.k. minneseffekt (perioder av hög enzymer aktivitet efterträddes av perioder av låg aktivitet och vice versa)4,5.
Många enda enzym studierna kräver att enzymer är orörlig på ytan eller rumsligt fast på ett annat sätt att förbli tillräckligt lång i synfältet för kontinuerlig observation. Enzymet inkapsling i liposomer har visat att enzymet immobilisering samtidigt förhindra negativa följder på grund ytan-enzym eller protein-protein interaktioner6,7. Liposomer erbjuder dessutom en unik möjlighet att studera enstaka membranproteiner i deras naturliga lipid lipidens miljö8,9,10.
En klass av membranproteiner, transportörer, utövar en riktad flyttning av ämnen över cellmembranet, ett beteende som kan endast studeras proteiner är rekonstituerade i lipid lipidmonolager (e.g., liposomer)11, 12,13. Till exempel spelar proton translokation, visades av flera enzymer av prokaryota och eukaryota elektrontransport kedjor, en viktig roll i cellandningen genom att skapa en proton-drivkraft som används för ATP syntes. I det här fallet är protonen pumpning aktivitet kopplat till elektronöverföring, även om detaljerade mekanismen av denna process ofta förblir svårfångade.
Nyligen har visat vi möjligheten att par fluorescerande upptäckt med elektrokemi att studera proton pumpning aktiviteten av enda enzymer av den terminal ubiquinol oxidasen av Escherichia coli (cytokrom bo3) Ombildade i liposomer14. Detta uppnåddes genom inkapsling av pH-känsliga membran-impermeable fluorescerande färgämne in i lumen av liposomer beredd från E. coli polära lipider (figur 1A). Mängden protein var optimerad så att de flesta liposomer innehöll antingen ingen eller endast en färdigberedd enzym molekyl (enligt poissonfördelning). De två substratesna för cytokrom bo3 tillhandahölls genom att lägga till ubikinon lipid mixen som bildade liposomer och (ambient) syre i lösning. Liposomer är sedan glest adsorberat på en halvtransparent ultramjuk guld elektrod, täckt med en själv monterade enskiktslager av 6-mercaptohexanol. Slutligen, elektroden är monterad på undersidan av en enkel spektroelektrokemisk cell (figur 1B). Elektrokemiska quinone pool redox statens kontroll tillåter en att flexibelt utlösa eller stoppa enzymatisk reaktion när som helst, medan pH-känsliga färgämnet används för att övervaka pH-förändringar inuti lumen av liposomer till följd av proton translokation av den enzymer. Med hjälp av fluorescensintensiteten hos en andra, lipid-bundna fluorescerande färg, storlek och volym av enskilda liposomer kan bestämmas och således kvantifiering av enzymet proton pumpning aktivitet. Med denna teknik, upptäckte vi särskilt att cytokrom bo3 molekyler ska kunna gå in i en spontan läcka tillstånd som snabbt avleder den proton drivkraft. Målet med denna artikel är att införa tekniken med enda Liposom mätningar i detalj.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Proton-pumpa enzymer av elektron överföra kedjor par redoxreaktioner till proton flyttning över membranet, skapa en proton-drivkraft som används för produktion av ATP. Membranproteiner amfifila kräver särskild uppmärksamhet åt deras hantering och beredning i naturliga lipid miljön är oumbärlig när man studerar processer för membran som proton translokation. Här, detalj vi en metod som har använts för utredning av proton-pumpning mekanismen av membran redox enzymer, tar cytokrom bo3 från Escherichia coli som ett exempel. En kombination av elektrokemi och fluorescence mikroskopi används för att kontrollera redox staten quinone pool och övervaka pH förändringar i lumen. På grund av den rumsliga upplösningen i fluorescerande mikroskopi, kan hundratals liposomer mätas samtidigt medan halten enzym kan skalas till en enda enzym eller transportören per Liposom. Respektive enda enzym analys kan avslöja mönster i enzymet funktionella dynamik som annars kan vara dolda av beteendet hos hela befolkningen. Vi inkluderar en beskrivning av ett skript för automatiserad bildanalys.

Kvaliteten på det guld-modifierade täckglaset (elektroden) med en SAM av 6MH kontrolleras före varje experiment med elektroimpedansspektroskopi. Figur 2A visar representativa Cole-Cole tomter mätt med elektroimpedansspektroskopi före och efter liposomer adsorberas. Om kvaliteten på SAM är tillräcklig, bör impedans spektroskopi Visa en nästan ren kapacitiv beteende vilket resulterar i en halvcirkel Cole-Cole tomt. Diametern på halvcirkeln i en kompl...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Här presenterar vi ett protokoll för att studera den molekylära mekanismen av proton flyttning över lipid membran av enda liposomer, med cytokrom bo3 som exempel. Att kombinera elektrokemi och fluorescensmikroskopi, pH-förändringar i lumen av enstaka blåsor, som innehåller enstaka eller flera enzym, kan identifieras och analyseras individuellt.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Denna metod gör det möjligt att studera proton transport aktivitet av respiratoriska membran enzymer som cytokrom BO3 i en naturlig lipid bi-lager miljö. De främsta fördelarna med denna enda enzymteknik är möjligheten att starta och stoppa enzymatiska reaktioner när som helst med hjälp av elektrokemi. Med hjälp av en glasspruta överföring 200 mikroliter av kloroform bestånd av lipid polära extrakt från Escherichia coli i glasflaskor att göra fem milligram alikvoter.Lägg till 50 mikroliter på ett milligram per milliliter ubiquinone 10 till lipiderna för att göra det slutliga förhållandet mellan en till 100 ubiquinone 10 till lipider. Till blandningen tillsätt 20 mikroliter av ett milligram per milliliter lång våglängd fluorescerande färgämne märkt lipid förkortat FDLL. Homogenisera kloroformlösningen genom kortvirvelning och avdunsta det mesta av kloroformen under ett skonsamt kväve- eller argonflöde.Avlägsna kloroformspåren helt genom ytterligare avdunstning under vakuum i minst en timme. Lägg till 312,5 mikroliter på 40 millimolar MOPS pH 7,4 buffert till en alikvot av lipider ubiquinone 10 FDLL torr mix. Blanda virvel til lipidfilmen är helt åter upphängd följt av två minuters behandling i ett ultraljudsbad.Nästa lägga till 125 mikroliter av 25 millimolar HPTS, ett pH-känsligt fluorescerande färgämne som kommer att kapslas in inuti liposomer. Nu lägga till 137,5 mikroliter av 250 millimolar OGP ytaktivt. Efter blandning med hjälp av virvel, sonikera blandningen i ett ultraljud vattenbad i 10 minuter för att säkerställa att alla lipider är solubilized i surfaktant miceller.Överför sedan spridningen till ett 1,5 milliliter plaströr. Tillsätt den erforderliga mängden cytokrom BO3 och tillsätt ultra rent vatten för att göra en total volym på 50 mikroliter. Inkubera rekonstitutionsblandningen vid fyra grader celsius i 10 minuter på en rullblandare.Nästa väga 50 milligram polystyren mikropärlor i var och en av de två 1,5 milliliter rörlock. Väg sedan 100 milligram polystyren mikropärlor i ytterligare två 1,5 milliliter rörlock. Stäng locken med paraffinfilm för att förhindra torkning.Tillsätt de första 50 milligram polystyren mikropärlor i rekonstitution blandningen genom att sätta locket med polystyren mikropärlor på 1,5 milliliter plaströr med den beredda dispersion. Utför sedan ett kort spinn i ett par sekunder för att få mikropärlor till botten av röret. Inkubera suspensionen vid fyra grader celsius på en rullblandare så att polystyrenmikrobpärlorna kan absorbera ytaktiva ämnena i 30 minuter.Upprepa tillägg av polystyren mikropärlor och inkubationer enligt följande. Tillsätt 50 milligram mikropärlor för 60 minuters inkubation. Tillsätt sedan 100 milligram mikropärlor för 60 minuters inkubation.Och slutligen, tillsätt 100 milligram mikropärlor för 120 minuters inkubation. Separera den proteoliposomliga lösningen från polystyrenkropärlorna med hjälp av en mikropipette med en tunn spets. Späd spridningen i 90 milliliter MOPS buffert i TI 45 ultracentrifugrör.Ultracentrifug dispersionen med hjälp av en typ 45 TI rotor vid 125, 000 gånger G i en timme att pelleten proteoliposomerna. Efter ultracentrifugering kasserar du supernatanten och sköljer pelletsen med MOPS-buffert utan att återständ pelleten. Efter att sköljbufferten kasserats, upphäv åter proteoliposomerna i 500 mikroliters av MOPS-buffert genom att pipettera den fram och tillbaka med en tunn tippad mikropipette innan suspensionen överförs till ett 1,5 milliliter plaströr.Efter centrifugeringen i fem minuter vid 12 000 gånger G för att avlägsna skräpet överför du supernatanten som är de rekonstituerade proteoliposomerna till en ny injektionsflaska. Lim upp till nio glaslock glider på en avdunstat guld yta med bi-komponent lågfluorescens epoxi. Bota limmet vid 80 grader varmt i fyra timmar.Strax före modifiering med ett självmonterat monoskikt lossa glaslocket glider från silikonplattorna med ett blad. På grund av att täckluckorna är tunna, var försiktig när du lossar täckslilen för att inte spricka eller bryta glasglasen. Doppa den nybefriade guldbelagda locket glider in i en 6-marcaptohexanol lösning och låt ligga på 20 till 25 grader celsius över natten för att bilda självmonterade mono-skikt.Nästa dag, ta bort den guldbelagda täckslilen från lösningen och tvätta kort med vatten eller metanol och sedan med isopropanol. Torka det guldbelagda locket glider under ett skonsamt gasflöde. Montera den guldbelagda täcksnedsteget i en spektro-elektrokemisk cell som diagramsatt i textprotokollet.Ta kontakt med guldet med en platt tråd utanför ett område som definieras av en gummi O-ring och tätt skruva ner den elektrokemiska cellen på toppen av den. Tillsätt två milliliter av elektrolytbuffertlösningen och placera referens- och hjälpelektroderna i cellen. Fortsätt att kontrollera kvaliteten på det självmonterade mono-lagret och kör blankor enligt beskrivningen i textprotokollet.Lägg proteoliposomes till den elektrokemiska cellen på 0,5 milligram per milliliter slutliga lipider koncentration och blanda något med en pipett. Vänta 30 till 60 minuter i rumstemperatur tills absorptionen av proteoliposomer på elektrodytan är klar. Tvätta cellen genom att byta buffertlösning minst 10 gånger, men undvik att lämna elektrodytan helt torr.Nu, kör elektrokemiska impedans spektroskopi på öppen cell potential att bekräfta självmonterade mono-skikt på guld elektroden förblir oförändrad. Kör cykliska voltammogram med skanningshastighet 10 och 100 millivolt per sekund för att observera catalatisk ubiquinol oxidation och syrereduktion genom cytokrom BO3 vid insläktetspotentialer av elektrokemisk quinone-reduktion. Modifiera guldelektroden som tidigare men med hjälp av fem mikrogram per milliliterprooliposomer.För enstaka enzymstudier minska cytokrom BO3 till lipid förhållandet till mellan 0,1 och 0,2%Placera en droppe nedsänkning olja och sedan den elektrokemiska cellen på 60 gånger olja mål av en inverterad fluorescens mikroskop. Med hjälp av lämpliga filter för FDLL fluorescens, fokusera på elektrodytan. Enda liposomer bör visas som ljusa fläckar vid diffraktion gränsen för mikroskopet objektivet.Ta en bild av FDLL-florescence. Byt till den av HPTS-filteruppsättningarna för florescens på mikroskopet för att verifiera att HTPS-florescence är tydligt synlig och urskiljbar från bakgrunden. Öka ljusintensiteten om det inte är fallet.Programmera mikroskopprogramvaran för att utföra en tidsansed bildanskaffning genom att växla två HTPS-filteruppsättningar. För att göra det, ange en en sekund exponering sedan navigera till menyprogram. Definiera/kör sedan ND-förvärv och välj två HTPS-kanaler.Ställ in fördröjningen mellan bildförvärven som minst. I detta experiment använda 0,3 sekunders fördröjning och fem minuters total varaktighet. Justera inställningarna för potentiostaten för att ändra potentialen under bildinhämtningen som anges i textprotokollet.Nu, samtidigt köra tidsantagen bild förvärv på mikroskopet och den potentiella sekvensen på potentiostat genom att manuellt starta båda mätningarna samtidigt. Visas här är fluorescens bilder av liposomer absorberas på elektroderna vid tre olika täckningar. Färgämnet som innehåller liposomer syns på bilderna som ljusa fläckar.Den centrala delen av bilden var fotoblekt för att avslöja bakgrunden florescence nivå. Bilderna på två HTPS-kanaler är superodebla där förhållandet mellan de två kanalerna motsvarar ett pH på 7,4 som används i detta experiment. Ett större antal liposomer är synliga med FDLL-kanalen, vilket indikerar förekomsten av liposomer som inte har någon HPTS inkapslad.Skillnaden mellan kanalerna HPTS och FDLL är mer uttalad vid högre täckningar. Möjligen eftersom vid hög liposom täckning, liposomer är mer benägna att brista eller säkring på ytan. Här visas bytet av en liposom-florescence på två HTPS-kanaler som en 3D-yttäppta av motsvarande område under 300 sekunder av experimentet.Den reduktiva potentialen applicerades mellan 60 sekunder och 180 sekunder. Motsvarande rity med volymmetrisk intensitetsförhållande för två HPTS-kanaler kontra tid visas. Visas här är medianerna för alla vesikel pH-förändringar inom en enda bild när cytokrom BO3 innehåll är 1,3%En ökning av pH syns tydligt när en potential mellan 0,1 och 0,3 volt tillämpas.När cytokrom BO3 innehåll är ett mycket lägre värde på 0,1%medianen kurvorna blir nästan omöjlig att skilja från dem av tomma liposomer. Det är viktigt att säkerställa fullständigt avlägsnande av ytaktiva från liposomdispenserna eftersom rester kan öka permeabiliteten hos liposomerna till protoner. Dessa metoder gör det möjligt för oss att ställa specifika frågor om det naturliga lipofila quinone-substratet i motsats till de ofta använda vattenlösliga quinoneanalogerna.Ytterligare mer identifierade de enda enzymexperimenten ett tidigare okänt läcktillstånd där proteinet fungerar som en protonkanal där protoner fritt flödar bakåt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Enda molekyl Super-upplösning avbildning av Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranet med nya fluorescerande Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infraröd elektrokemi visat för studie av H2 Oxidation av en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...