Name: single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Yazarlar mali destek için BBSRC (1/P005454/BB) kabul etmiş oluyorsunuz. NH VILLUM Vakfı genç araştırmacı programı tarafından finanse edildi.

1. bir Lipid/UQ-10/FDLL karışımı hazırlanması
Not: E. coli lipidler lipozomlar hazırlanması için kullanılan bölünmemeli ve iyice karışık ubiquinone-10 (enzim Substratı) ve uzun dalga boyu floresan boya etiketli lipidler (lipozomlar boyutu tayini için) önce olmalıdır sulandırma.
<ol><li>Cam kullanarak, kloroform stokunun polar lipit transfer 200 µL 5 mg aliquots yapmak için cam şişe Escherichia coli (25 mg/mL) ayıklayın.</li>
	<li>1 mg/mL ...

<ol>
	<li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Biomolecule+Kinetics:+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme.">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li><li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating.">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).</li><li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis.">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li><li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).</li><li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+enzymes+sleep+and+work?.">Do enzymes sleep and work?.</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes.">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins.">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li><li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins.">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li><li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies.">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li><li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes:+Technologies+and+Analytical+Applications.">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase.">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li><li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes.">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li><li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).</li><li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes.">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li><li>Compton, R. G., Banks, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Understanding voltammetry. , (2018).</li><li>Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).</li><li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).</li><li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes.">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).</li><li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).</li><li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+protons,+potassium+ions,+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness.">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li><li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria)+inner+membrane+phospholipids:+No+effect+of+fatty+acid+composition.">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li><li>Eriksson, E. K., Agmo Hern&#225;ndez, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane.">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li><li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability.">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li></ol>

Açıklanan yöntemi tarafından lipozomlar yeniden solunum membran proteinlerinin pompalama proton çalışmaya uygundur ve quinone havuzu ile elektron alış verişi edebiliyoruz. Proton pompalama aktivitesi, lipozom Lümen (şekil 1A) kapsüllenmiş pH-duyarlı (ratiometric) boyalar kullanılarak tek-enzim düzeyinde izlenebilir.
Yöntemi ile bir SAM18değiştiren elektrotlar ile elektron alışverişi için yeteneğine ubiquinone (veya ...

Enzim mekanizmaları ve Kinetik hakkında bilgi genellikle nerede bir istatistiksel ortalama ölçümleri temsil topluluğu veya macroscale düzeyde moleküller, milyonlarca binlerce enzim nüfus ile elde edilir. Bu, ancak, enzim kompleksi oluştururlar heterojenite onların davranış görülebilir ve moleküler mekanizmaları topluluk düzeyinde gözlenen her molekül için mutlaka geçerli değildir bilinmektedir. Bu tür sapmalar bireysel molekül ölçekte kapsamlı çalışmaları tek enzimler tarafından son yirmi yılda1sırasında ortaya çıkan yöntemler ile onaylandı. Özellikle, Floresans algılama bireysel enzim aktivitesinin enzim aktivitesi2,3 heterojen araştırmak veya sözde hafıza etkisi (düşük noktalarla başarılı yüksek enzim etkinlik dönemleri keşfetmek için kullanılan etkinlik ve tersi)4,5.
Birçok tek enzim çalışmaları enzimleri yüzey veya yeterince uzun sürekli gözlem için görüş alanı içinde kalmak için başka bir şekilde dağınık şekilde sabit immobilize gerektirir. Enzim kapsülleme lipozomlar içine herhangi bir olumsuz etkisi nedeniyle yüzey-enzim veya protein-protein etkileşimleri6,7önleme sırasında enzim tutuklaması etkinleştirileceği gösterilmiştir. Buna ek olarak, lipozomlar tek zar proteinleri onların doğal lipid bilayer çevre8,9,10eğitim için benzersiz bir imkanı verir.
Membran proteinlerinin, taşıyıcı, sınıf bir yön translocation maddelerin hücre zarı, proteinler lipid bilayers (örneğin, lipozomlar)11yeniden yükleyen sadece okudu bir davranış karşısında egzersizleri, 12,13. Örneğin, proton translocation prokaryotik ve ökaryotik elektron taşıma zinciri, çeşitli enzimler tarafından sergilenen, ATP sentezi için kullanılan bir proton-güdü güç oluşturarak önemli bir rol hücresel solunum oynar. Bu durumda, her ne kadar bu işlem detaylı mekanizmasının kez zor kalır etkinlik pompalama proton elektron transferi için birleştirilmiştir.
Son zamanlarda, Escherichia coli (sitokrom bo3) terminal ubiquinol oksidaz tek enzim aktivitesi pompalama proton çalışmaya elektrokimya ile çift floresan algılama olasılığı gösterdi lipozomlar14' te yeniden düzenlendi. Bu bir pH duyarlı membran geçirimsiz floresan boya E. hazırlanan lipozomlar Lümen içine encapsulation sağlanır coli kutup lipidler (şekil 1A). Böylece çoğu lipozomlar ya yok ya da sadece bir Sulandırılan enzim molekül (göre Poisson dağılımı) içerdiği protein miktarı optimize edildi. Sitokrom bo3 iki yüzeylerde ubiquinone lipozomlar ve (ortam) oksijen çözümde oluşturulan lipid karışımı ekleyerek temin edilmiştir. Lipozomlar sonra seyrek 6-mercaptohexanol otomatik olarak birleştirilmiş bir monolayer ile kaplı bir yarı saydam yumușak altın elektrot üzerinde adsorbe. Son olarak, elektrot bir basit Spektroelektrokimyasal hücre (şekil 1B) altta monte edilir. Quinone havuzu Redoks durumu elektrokimyasal kontrol sağlar bir esnek tetiklemek için veya pH duyarlı boya proton translocation tarafından bir sonucu olarak lipozomlar Lümen içinde pH değişiklikleri izlemek için kullanıldığı gibi her an enzimatik reaksiyon durdurmak için enzimler. Bir ikinci, lipid bağlı floresan boya, boyutu ve bireysel lipozomlar hacmi floresan yoğunluğu belirlenebilir ve enzim proton pompalama aktivitesi miktar kullanılarak böylece. Bu tekniği kullanarak, sitokrom bo3 molekülleri hızla proton sebep kuvvet kalır bir spontan kaçak durumuna girebilmesi için özellikle bulduk. Bu makalenin amacı tek lipozom ölçümleri ayrıntılı teknik tanıtmaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-Mercapto-1-hexanol (6MH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451088</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)</td>
			<td>BioChemika</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium holder (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary electrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>platinum wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipids</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>100600C</td>
			<td>25 mg/mL in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>EPO-TEK</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td>low fluorescence epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;ATTO633&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS1&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;HPTS2&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube (&#34;Texas Red&#34;)</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>TexasRed-DHPC was used in this work (&#955;exc 595 nm; &#955;em 615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative)</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 633-161</td>
			<td>ATTO633-DOPE can be used as alternative (&#955;exc 630 nm; &#955;em 651 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-33</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0172</td>
			<td>No 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725 RNR</td>
			<td>250 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td>
			<td>T101/V1</td>
			<td>1.75 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td></td>
			<td>99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gramacidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury sulfate reference electrode</td>
			<td>Radiometer (Hash)</td>
			<td>E21M012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin NL040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 5.5 sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Melford Laboratories</td>
			<td>B2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova 1.10</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td>Potentiostat control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60x/1.4 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2017</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td>Plotting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (Electrochemical cell)</td>
			<td>Orinoko</td>
			<td></td>
			<td>Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microbeads</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Biobeads, 20-50 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td>PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>CH Instruments</td>
			<td>CHI604C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scripting software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>R2017a</td>
			<td>Required toolboxes: &#39;Image Processing Toolbox&#39;, &#39;Parallel Computing Toolbox&#39;, &#39;Curve Fitting Toolbox&#39;, &#39;System Identification Toolbox&#39;, &#39;Optimization Toolbox&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>IDB Technologies LTD</td>
			<td>Si-C2 (N&#60;100&#62;P)</td>
			<td>&#216; 25 mm, 525 um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon cell (Electrochemical cell)</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td>Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td>Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin micropipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1190.100</td>
			<td>or similar gelloader tips 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquinone-10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>L-80XP</td>
			<td>with Ti 45 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB15063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single liposome measurements for the study of proton-pumping membrane enzymes using electrochemistry and fluorescent microscopy

Elektron, Proton pompa enzimler zincirleri çift Redoks reaksiyonları proton translocation için ATP üretimi için kullanılan bir proton-sebep kuvvet oluşturma membran arasında aktarın. Membran proteinlerinin amfifilik doğası kullandıklarında daha özel dikkat gerektirir ve membran taşıma işlemleri proton translocation gibi okurken sulandırma doğal lipid ortamına vazgeçilmezdir. Burada, biz Escherichia coli örnek olarak sitokrom bo3 alarak membran Redoks enzimler, proton pompa mekanizması soruşturma için kullanılan bir yöntem ayrıntılı. Elektrokimya ve floresan mikroskopi bir arada quinone havuzu ve monitör pH değişiklikleri Lümen Redoks durumunu kontrol etmek için kullanılır. Floresan mikroskopi Uzaysal çözünürlük nedeniyle, lipozomlar yüzlerce enzim içeriği bir tek enzim ya da ışınlama lipozom başına ölçeklendirilebilir iken aynı anda ölçülebilir. İlgili tek enzim analizi okuduğunuzda, aksi takdirde tüm popülasyon davranış tarafından gizlenmiş olabilir enzim fonksiyonel dinamiklerini ortaya çıkarabilir. Otomatik görüntü analizi için bir komut dosyası için bir açıklama içerir.

Altın-modified kapak notu (elektrot) kalite 6MH SAM ile elektrokimyasal empedans spektroskopisi ile her deneme önce kontrol edilir. Şekil 2A önce ve sonra lipozomlar adsorbe elektrokimyasal empedans Spektroskopi kullanarak ölçülen temsilci Cole-Cole araziler gösterir. SAM kalitesi yeterli değilse, empedans spektroskopisi yarı daire Cole-Cole mezarlığına çıkan hemen hemen saf bir kapasitif davranış göstermesi gerekmektedir. Cole-Cole arsa yar...

Watch this Scientific Journal Video about Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Burada, proton translocation moleküler mekanizması tek lipozomlar, lipid membranlar üzerinde çalışmak için bir protokol sitokrom bo3 örnek olarak kullanarak mevcut. Birleştirerek elektrokimya ve floresan mikroskopisi, lumen tek veziküller, tek içeren veya birden fazla enzim, pH değişiklikler algıladı ve ayrı ayrı analiz.

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Bu yöntem, doğal lipid iki katmanlı bir ortamda sitokrom BO3 gibi solunum membran enzimlerinin proton taşıma aktivitesinin incelenmesini sağlar. Bu tek enzim tekniğinin en önemli avantajları elektrokimya kullanarak enzimatik reaksiyonları her an başlatma ve durdurma imkanıdır. Bir cam şırınga kullanarak beş miligram aliquots yapmak için cam şişeler içine Escherichia coli lipid polar ekstresi kloroform stok 200 mikrolitre transferi.Lipidler için 1 00 0 0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 Karışıma mililitre likit uzun dalga boyu floresan boya sıyrık olarak etiketlenmiş 20 mikrolitre lik fdll. Kloroform çözeltisini kısa girdaplarla homojenize edin ve kloroformun çoğunu nazik bir azot veya argon akışı altında buharlaştırın.En az bir saat boyunca vakum altında daha fazla buharlaşma ile tamamen kloroform izleri çıkarın. Lipitler ubiquinone 10 FDLL kuru karışımı bir aliquot için 40 milimolar MOPS pH 7,4 tampon 312,5 mikrolitre ekleyin. Lipid film tamamen yeniden askıya alınana kadar girdap karıştırın bir ultrasonik banyoda tedavi iki dakika takip.Sonraki 25 milimolar HPTS, lipozomlar içinde kapsüllenmiş olacak bir pH duyarlı floresan boya 125 mikrolitre ekleyin. Şimdi 250 milimolar OGP yüzey aktif 137,5 mikrolitre ekleyin. Girdap kullanarak karıştırdıktan sonra, tüm lipidler sürfaktan lı misel içine solubilize olduğundan emin olmak için 10 dakika boyunca bir ultrasonik su banyosukarışımı sonicate.Sonra 1.5 mililitrelik plastik tüp içine dağılım aktarın. Sitokrom BO3 gerekli miktarda ekleyin ve 50 mikrolitre toplam hacim yapmak için ultra saf su ekleyin. Reconstitution karışımını bir rulo mikserde 10 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın.Sonraki iki 1,5 mililitrelik tüp kapakları her içine polistiren mikroboncuklar 50 miligram ağırlığında. Sonra başka iki 1.5 mililitrelik tüp kapakları içine polistiren mikroboncuklar 100 miligram tartın. Kurumasını önlemek için kapakları parafin filmile kapatın.Hazırlanan dağılım ile 1,5 mililitrelik plastik tüp üzerinde polistiren mikroboncuklar ile kap koyarak reconstitution karışımı içine polistiren mikroboncuklar ilk 50 miligram ekleyin. Sonra tüpün altına mikroboncuklar getirmek için birkaç saniye için kısa bir spin gerçekleştirin. Polistiren mikroboncukların yüzey aktif maddeyi 30 dakika emmesini sağlamak için süspansiyonu bir silindir karıştırıcıüzerinde dört derecede kuluçkaya yatırın.Polistiren mikroboncukve kuluçka eklemelerini aşağıdaki gibi tekrarlayın. Kuluçka 60 dakika için mikroboncuklar 50 miligram ekleyin. Sonra kuluçka 60 dakika için mikroboncuklar 100 miligram ekleyin.Ve son olarak, 120 dakikalık kuluçka için 100 miligram mikroboncuk ekleyin. İnce uçlu bir mikropipet kullanarak proteolipozom solüsyonu polistiren mikroboncuklardan ayırın. TI 45 ultracentrifuge tüp MOPS tampon 90 mililitre dağılım seyreltin.Ultracentrifuge 125 bir tip 45 TI rotor kullanarak dağılım, bir saat için 000 kez G proteolipossomes pelet. Ultracentrifugation'ı takiben, supernatant'ı atın ve peleti yeniden sulandırmadan MOPS arabelleğiyle durula. Durulama tamponu attıktan sonra, süspansiyonu 1,5 mililitrelik plastik tüpe aktarmadan önce ince uçlu bir mikropipe tutarak 500 mikrolitre MOPS tamponundaki proteolipozomları yeniden askıya alın.12,000 kez G'de beş dakika santrifüjden sonra, yeniden oluşturulan proteoliposomes olan süpernatantı yeni bir şişeye aktarın. İki bileşenli düşük floresan epoksi kullanarak buharlaşan bir altın yüzeyinüzerine dokuz cam kapak kayar yapıştırın. Tutkalı 80 derecede dört saat boyunca tedavi edin.Kendi kendine monte edilmiş tek katmanlı modifikasyondan hemen önce, cam kapağı silikon gofretlerden bir bıçakla ayırın. Kapak kaymalarının inceliğinden dolayı, cam kaymaları kırmamak veya kırmamak için kapak kaymalarını çıkarırken dikkatli olmaya dikkat edin. Yeni ayrılmış altın kaplı kapağı 6-marcaptohexanol çözeltisine batırın ve kendi kendine monte edilmiş mono-tabakayı oluşturmak için bir gecede 20 ila 25 derece bekletin.Ertesi gün, çözeltiden altın kaplı kapak fişleri çıkarın ve su veya metanol ile kısa bir süre yıkayın ve daha sonra isopropanol ile. Hafif bir gaz akışı altında altın kaplı kapak fişleri kurulayın. Metin protokolünde diyagramlanan altın kaplı kapak fişini bir spektro-elektrokimyasal hücrede birleştirin.Kauçuk bir O-halkası ile tanımlanan bir alanın dışında düz bir tel ile altın temas ve sıkıca üstündeki elektrokimyasal hücre aşağı vida. Elektrolit tampon çözeltisinin iki mililitresini ekleyin ve referans ve yardımcı elektrotları hücreye yerleştirin. Kendi kendine biraraya getirilen mono katmanın kalitesini kontrol etmeye devam edin ve metin protokolünde açıklandığı gibi boşlukları çalıştırın.Mililitre son lipid konsantrasyonu başına 0,5 miligram elektrokimyasal hücreye proteoliposomes ekleyin ve bir pipet ile biraz karıştırın. Elektrot yüzeyinde proteolipozomların emilimi bitene kadar oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika bekleyin. Tampon çözeltisini en az 10 kez değiştirerek hücreyi yıkayın, ancak elektrot yüzeyini tamamen kuru bırakmaktan kaçının.Şimdi, elektrokimyasal empedans spektroskopisini açık hücre potansiyeline göre çalıştırın ve altın elektrotüzerindeki kendi kendine birleştirilmiş mono-tabakanın değişmediğini doğrulayın. Elektrokimyasal kinon redüksiyonunun başlangıç potansiyellerinde sitokrom BO3 tarafından katalatik ubinol oksidasyonu ve oksijen azaltımı gözlemlemek için saniyede 10 ve 100 milivolt tbmkif hızları ile döngüsel voltammogram çalıştırın. Daha önce olduğu gibi altın elektrot değiştirin ama mililitre proteoliposomes başına beş mikrogram kullanarak.Tek enzim çalışmaları için sitokrom BO3 lipid oranını 0.1 ve 0.2% arasında daldırma yağı bir damla yerleştirin ve daha sonra ters floresan mikroskop 60 kez yağ hedefi elektrokimyasal hücre azaltmak. FDLL floresan için uygun filtreleri kullanarak elektrot yüzeyine odaklanın. Tek lipozomlar mikroskop hedefinin kırınım sınırında parlak noktalar olarak görünmelidir.FDLL floresans bir görüntü alın. HTPS floresansının arka plandan açıkça görülebilen ve ayırt edilebilir olduğunu doğrulamak için mikroskoptaki HPTS floresan filtre setlerinden birine geçin. Durum böyle değilse ışık yoğunluğunu artırın.İki HTPS filtre kümesini değiştirerek zamanlanmış görüntü edinimi gerçekleştirmek için mikroskop yazılımını programla. Bunu yapmak için, bir saniye pozlama ayarlayın ve ardından menü uygulamalarına gidin. Ardından ND Kazanım'ı tanımlayın/çalıştırın ve iki HTPS kanalı seçin.Görüntü edinmeler arasındaki gecikmeyi en az olarak ayarlayın. Bu denemede 0,3 saniye gecikme ve beş dakikalık toplam süre kullanın. Metin protokolünde belirtildiği gibi görüntü edinimi sırasındaki potansiyeli değiştirmek için potansiyostat ayarlarını ayarlayın.Şimdi, aynı anda mikroskop üzerinde zamanlanmış görüntü edinimi ve potansiyostat üzerinde potansiyel dizi elle aynı anda her iki ölçüm başlatarak çalıştırın. Burada gösterilen üç farklı kapsama elektrotlar emilen lipozomların floresan görüntüleri vardır. Lipozomiçeren boya, görüntülerde parlak noktalar olarak görülebilir.Resmin orta kısmı arka plan floresan düzeyini ortaya çıkarmak için fotoğraf ağartılmış oldu. İki HTPS kanalındaki görüntüler, iki kanal arasındaki oranın bu deneyde kullanılan 7,4 pH'a karşılık geldiği süper bir durumdeğildir. Daha fazla sayıda lipozom FDLL kanalı ile görülebilir, hangi hiçbir HPTS kapsüllü lipozomların varlığını gösterir.HPTS ve FDLL kanalları arasındaki fark daha yüksek kapsama larda daha belirgindir. Muhtemelen yüksek lipozom kapsama, lipozomlar patlama veya yüzeyde sigorta olasılığı daha yüksektir çünkü. Burada, iki HTPS kanalında lipozom floresan değişimi, denemenin 300 saniyesi boyunca ilgili alanın 3Boyutlu yüzey çizimi olarak gösterilir.İndirgeme potansiyeli 60 saniye ile 180 saniye arasında uygulandı. İki HPTS kanalının zamana göre hacim metrik yoğunluk oranının karşılık gelen çizimi gösterilir. Burada gösterilen sitokrom BO3 içeriği % 1.3 olduğunda tek bir görüntü içinde tüm vezikül pH değişikliklerinin ortancaları 0.1 ve 0.3 volt arasında bir potansiyel uygulandığında pH artışı açıkça görülebilir.Sitokrom BO3 içeriği %0,1'lik çok daha düşük bir değer olduğunda, ortanca eğriler boş lipozomlardan neredeyse ayırt edilemez hale gelir. Artıklar lipozomların protonlara geçirgenliğini artırabileceğinden, sürfaktanların lipozom dispanserlerden tamamen çıkarılmasını sağlamak önemlidir. Bu yöntemler bize genellikle kullanılan suda çözünen kinon analogları aksine doğal lipophilic quinone substrat belirli sorular sormak için izin verir.Dahası, tek enzim deneyleri, proteinin protonların serbestçe geriye doğru aktığı bir proton kanalı olarak hareket ettiği daha önce bilinmeyen bir sızıntı durumunu belirletmis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film kızılötesi elektrokimya H2 oksidasyon çalışma için [NiFe] Hydrogenase tarafından gösterdi

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...