Name: lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

ويشكر المؤلفون على الدعم المالي المقدم من جائزة المحقق الجديد لعام 2017 من الرابطة الأمريكية للصيدلية، وجائزة هوكلمني للأمراض المخيفة من جامعة دوكين، وأموال بدء كلية الصيدلة لمختبر مانيكام. نود أن نشكر مختبر تسرب (جامعة Duquesne) للمساعدة الغربية النشاف والسماح باستخدام الصور أوديسي 16 بت. ونود أيضا أن ندرج مذكرة تقدير خاصة لكاندارب ديف (مختبر مانيكام) للمساعدة في النشاف الغربية.

1.General hCMEC /D3 ثقافة الخلية
<ol><li>إنعاش الخلايا المجمدة ملاحظة: تم إجراء جميع صيانة ثقافة الخلايا والتجارب داخل غطاء أمان حيوي معقم. تم شراء وسائل الإعلام الثقافية والمكملات الغذائية والكواشف كمنتجات معقمة أو تعقيمها عن طريق الترشيح باستخدام فلتر غشاء 0.22 م لمنع التلوث الميكروبي.<ol...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Camos, S., Mallolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+assaying+microvascular+endothelial+cell+pathophysiology+in+stroke.">Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke.</a> Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).</li><li>Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Blood-Brain+Barrier+Models-An+Overview+of+Established+Models+and+New+Microfluidic+Approaches.">In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Ohtsuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+targeted+absolute+proteomic+analysis+of+transporters,+receptors+and+junction+proteins+for+validation+of+human+cerebral+microvascular+endothelial+cell+line+hCMEC/D3+as+a+human+blood-brain+barrier+model.">Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).</li><li>Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+and+Drug+Delivery--In+vitro+Models+of+the+Ischemic+Blood-Brain+Barrier.">Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Llombart, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+secretomes+from+a+human+blood+brain+barrier+endothelial+cells+in-vitro+model+after+ischemia+by+stable+isotope+labeling+with+aminoacids+in+cell+culture+(SILAC).">Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC).</a> Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Avdeef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+can+in+vitro+brain+microcapillary+endothelial+cell+models+predict+rodent+in+vivo+blood-brain+barrier+permeability?.">How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells.">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).</li><li>Shao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+blood-brain+barrier+model+in+a+membrane-based+microchip+for+characterization+of+drug+permeability+and+cytotoxicity+for+drug+screening.">Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening.</a> Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).</li><li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+lab-on-a-chip+tool+for+modeling+biological+barriers.">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+evaluating+drug+transport+across+the+blood&#8211;brain+barrier.">In vitro model for evaluating drug transport across the blood&#8211;brain barrier.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+the+blood&#8211;brain+barrier+in+drug+discovery+and+development.">Modelling of the blood&#8211;brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).</li><li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).</li><li>Deli, M. A., &#193;brah&#225;m, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+Studies+on+In+vitro+Blood&#8211;Brain+Barrier+Models:+Physiology,+Pathology,+and+Pharmacology.">Permeability Studies on In vitro Blood&#8211;Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li><li>Ren, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+General+Method+To+Increase+Stokes+Shift+by+Introducing+Alternating+Vibronic+Structures.">A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Oupick&#253;, D., Kon&#225;k, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+delivery+systems+based+on+complexes+of+DNA+with+synthetic+polycations+and+their+copolymers.">DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers.</a> Journal of Controlled Release. 65, (2000).</li><li>Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).</li><li>Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trans-monolayer+permeability+calculations:+often+forgotten+assumptions.">In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions.</a> research focus reviews. 8, (2003).</li><li>Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li><li>Balda, M. S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+tight+junctions+are+revealed+by+ZO-1+isoforms.">Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms.</a> The American Physiological Society. , (1992).</li><li>Brown, R. C., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Modulation+of+Adherens+and+Tight+Junction+Function:+A+Potential+Mechanism+for+Blood-Brain+Barrier+Disruption+After+Stroke.">Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke.</a> Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).</li><li>Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Ca2++directly+regulates+tight+junctional+permeability+in+the+human+cervical+cell+line+CaSki.">Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).</li><li>Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+lntracellular+Calcium+in+Tight+Junction+Biogenesis.">Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).</li><li>Tobey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).</li><li>Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).</li><li>Posimo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+assays+for+cells+in+culture.">Viability assays for cells in culture.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+transport+as+a+mechanism+of+blood-brain+barrier+disruption+during+stroke.">Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke.</a> Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).</li><li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+surface+properties+on+nanoparticle-mediated+transport+of+drugs+to+the+brain.">Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.</a> Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).</li><li>Markoutsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+permeability+studies+of+BBB-targeting+immunoliposomes+using+the+hCMEC/D3+cell+line.">Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).</li></ol>

دور رئيسي لBBB هو منع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ للحفاظ على انحلال البيئة الدقيقة العصبية. واحدة من السمات المميزة لBBB هو قدرة الخلايا البطانية الشعرية لتشكيل تقاطعات ضيقة (TJs) التي ختم على نحو فعال الطريق شبه الخلوي للنقل. أظهرنا فحصال...

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو الحاجز الوقائي الذي يحد من تدفق مكونات البلازما إلى أنسجة الدماغ ويتكون من خلايا بطانة الدماغ جنبا إلى جنب مع الخلايا الداعمة مثل pericytes. الدور الرئيسي لBBB هو أن تكون بمثابة الحاجز الذي يختم المسافة بين الدم المحيطي والجهاز العصبي المركزي (CNS) للحفاظ على الهيموسات من البيئة الدقيقة العصبية1،2. الخلايا البطانية الشعرية في الدماغ ختم المسار شبه الخلوي بشكل فعال عن طريق تشكيل تقاطعات ضيقة بين الخلايا (TJs)1. هذا الحاجز الواقي يسمح الجلوكوز والمواد الغذائية المختارة لدخول الدماغ في حين أنه يمنع غالبية الأيونات والمواد السامة والأدوية من المرور من خلال هذا الحاجز الضيق. وإلى جانب الدور الوقائي الذي يضطلع به المكتب، فإن وظيفة الحاجز الطبيعي لـ BBB تشكل تحديا ً شديداً في تطوير نظم إيصال المخدرات التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي.
في المختبر نماذج زراعة الخلايا من BBB هي أدوات مفيدة لدراسة البيولوجيا وفهم آثار العلاج من المخدرات على سلامة حاجز TJ. استخدمنا خط الخلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية الدماغية البشرية (hCMEC/D3) كنموذج في المختبر لأنه نموذج مقبول من بطانة الدماغ البشري3 ويلخص العديد من وظائف BBB البشرية. hCMEC /D3is واحدة من خطوط الخلايا الأكثر استخداما لنمذجة BBB في المختبر4،5،6،7،8،9. على الرغم من قيمها المنخفضة نسبيا من المقاومة الكهربائية عبر الانعندوات (TEER)، وهو مقياس لضيق الحاجز، يحتفظ هذا الخط الخلوي بمعظم الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا البطانية الدماغية، حتى كثقافة أحادية في غياب الخلايا الغليفية المشتركة الثقافة6،7. خط الخلية hCMEC /D3 يعبر عن علامات BBB متعددة بما في ذلك الناقلين النشطين والمستقبلات حتى مرور ما يقرب من 35 دون الخضوع للتمييز إلى الأنماط الظاهرية غير المستقرة6و7و9 ،10،11. السمة الأكثر لفتا للانتباه من خط الخلية hCMEC / D3 كنموذج BBB في المختبر هو قدرته على تشكيل TJs5،9،11،12. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن نماذج BBB المشتقة من الخلايا الجذعية أظهرت نفاذية أعلى في العديد من الدراسات مقارنة مع خط الخلية hCMEC/D3 وأنها لا تعبر عن بعض علامات BBB، فإنها لم تتطور بعد كنموذج الخلية BBB الأكثر شيوعا13. الأهم من ذلك، لا تزال نماذج BBB المشتقة من الخلايا الجذعية تتميز فيما يتعلق بأرقام المرور القصوى التي تسمح للخلايا للحفاظ على الأنماط الظاهرية BBB مستقرة14.
وتستخدم عادة ثلاث طرق أولية لتحديد سلامة حاجز TJ، بما في ذلك قياس TEER،وقياس معامل نفاذية واضح (P التطبيق) من جزيئات التتبع المائية الصغيرة مثل السكروز، الإينولين، لوسيفر الأصفر، الخ والمناعة من علامات الجزيئية المعروفة من TJs مثل claudin-5، ZO-1، occludin، الخ5. TEER هو طريقة بسيطة نسبيا وكمية أن يقيس المقاومة الكهربائية عبر أحاديةالخلية المستزرعة على الركيزة غشاء مسامية 5. ومع ذلك، يمكن أن تتأثر قيم TEER بالمتغيرات التجريبية مثل تكوين وسط الثقافة ونوع أداة القياس. مزيج محتمل من هذه العوامل يؤدي إلى توزيع واسع من قيم TEER تتراوح بين 2 إلى 1150 Ω سم2 في خط الخلية hCMEC /D3 المستزرعة لمدة 2-21 يوما13. تلطيخ المناعة هو طريقة بصرية لتحديد وجود بروتينات TJ عن طريق وضع العلامات على البروتين المستهدف باستخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك، ينطوي التلطيخ المناعي على سلسلة من الخطوات التجريبية، بما في ذلك الحاجة إلى إصلاح/نفاذية الخلايا التي قد تؤدي إلى قطع أثرية تجريبية وإشارات الفلورسنت قد تتلاشى مع مرور الوقت. قد تؤدي العوامل المذكورة أعلاه إلى أخطاء ذاتية تؤثر على جودة البيانات.
التركيز الرئيسي لهذا العمل هو تقديم فحص نفاذية واضحة تستند إلى LY تحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات المنافي في الخلايا المستزرعة hCMEC/D3. على الرغم من أن أنظمة BBB المتقدمة الأخرى في المختبر، مثل أنظمة الثقافة المشتركة، وأنظمة السوائل الدقيقة، هي من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية يحاكي مع وظيفة حاجز تحسنت بشكل كبير15،16،17،hCMEC /D3 transwell الإعداد هو نموذج بسيط وموثوق بها لتقدير حركية تشكيل TJ وفرز بسرعة تأثير تركيبات المخدرات المختلفة على وظيفة الحاجز. بشكل عام، قيمالتطبيق P متسقة لمختلف solutes المائية في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. على سبيل المثال، قيمالتطبيق P المبلغ عنها لمختلف solutes الكتلة الجزيئية المنخفضة المختلفة (مثل السكروز، مانيتول، LY، الخ) في مختلف نماذج BBB في المختبر هي في ترتيب 10-4 سم / دقيقة5،18،19 , 20.في الإعداد التجريبي لدينا، يتم بذر الخلايا البطانية الدماغ على غشاء ميكرومبوروس المغلفة بالكولاجين لتعلق الخلية وتشكيل أحادية الطبقة لتقليد الحاجز في الجسم الحي. وأضاف LY في الجانب apical ومن المتوقع أن اجتياز التقاطعات الضيقة بين الخلايا وتتراكم في الجانب الباضلي. وتشير تركيزات أكبر من LY في الجانب الباضيلي إلى وجود حاجز غير ناضج وغير عملي بالكامل، في حين تعكس التركيزات المنخفضة النقل المقيد بسبب وجود TJs وظيفية مما يؤدي إلى حاجز ناضج.
LY هو صبغة مائية مع قمم الإثارة / الانبعاثات متميزة ويتجنب الحاجة إلى جزيئات تتبع العلامة الراديوية مثل السكروز، مانيتول أو الإينولين. وهكذا، يمكن استخدام قيم الفلورة من LY لحساب نفاذية شبه الخلوية مباشرة عبر الطبقات الأحادية BBB. أيضا، بالمقارنة مع العديد من الأصباغ المتاحة تجاريا المستخدمة في المجالات الطبية الحيوية التي تعاني من التحولات ستوكس الصغيرة مثل الفلورسين21،تحول ستوكس من LY حوالي 108 نانومتر مع فصل الطيفية كافية، مما يسمح LY البيانات الفلورية باعتبارها قراءة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلوية. استخدمنا النشاف الغربي كتقنية متعامدة لإظهار التغيرات في التعبير عن البروتين علامة تقاطع ضيق، ZO-1، على مدى وقت الثقافة. يتم استخدام التعبير ZO-1 الكشف عن طريق النشاف الغربية لتكملة بياناتالتطبيق LY P وجنبا إلى جنب، وتشير هذه البيانات إلى أن التغييرات التي لوحظت في قيمالتطبيق LY P يعكس تشكيل طبقة أحادية مع زيادة تدريجية في التعبير عن علامة تقاطع ضيق، ZO-1.
وكما أشير في وقت سابق، فإن التركيز الرئيسي لهذا العمل هو إظهار اختبار LY كتقنية بسيطة لرصد تشكيل طبقة أحادية المنافية مع تقاطعات ضيقة وظيفية. ومع ذلك، لإظهار فائدة إضافية من اختبار المتقدمة، قمنا بقياسالتطبيق LY P في الحمض النووي نانوجسيم transfecd hCMEC / D3 أحادية الطبقات. يمكن تكثيف الأحماض النووية في جسيمات نانوية متعددة الكهرباء بقطر 100-200 نانومتر عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي بين مجموعات البوليمرات المشحونة بشكل إيجابي ومجموعات الفوسفات المشحونة سلبا من الأحماض النووية22، 23.نشير إلى هذه المجمعات كجسيمات نانوية الحمض النووي (DNA NPs) في عملنا. في حين أن نيتنا هي نقل الخلايا والتعبير عن البروتين المطلوب، يجب علينا أن نضمن عدم المساس بخصائص الحاجز من الطبقات الأحادية hCMEC/D3. تشير بياناتنا إلى أن نظام الانف الجيني القياسي 4 h luciferase لا يغير بشكل ملموس نفاذية LY مما يدل على فائدة اختبارالتطبيق LY P لتحديد التغييرات في سلامة حاجز TJ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">hCMEC/D3 cell line</td>
			<td style="width:195px;">Cedarlane Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">102114.3C-P25</td>
			<td style="width:172px;">human cerebral microvascular endothelial cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gWizLuc</td>
			<td>Aldevron&#160;</td>
			<td>5000-5001</td>
			<td>Plasmid DNA encoding luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lucifer yellow CH dilithium salt&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>155267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Flat Bottom&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-Well Immuno Plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>437111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-MEM 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1951695</td>
			<td>Spinner-minimum essential medium (S-MEM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I&#160;</td>
			<td>Discovery Labware, Inc.</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Lysis 5X Reagent&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beetle Luciferin, Potassium Salt&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">SpectraMax i3&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Fluorescence Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ZO-1 Polyclonal Antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">61-7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:195px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">ab8245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:545px;">Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td style="width:123px;">128817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">12-well, Flat Bottom</td>
			<td style="width:195px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:123px;">25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">RIPA buffer (5X)</td>
			<td style="width:195px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">J62524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Odyssey CLx imager</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for scanning western blot membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier

يتكون حاجز الدم في الدماغ BBB من الخلايا البطانية التي تشكل حاجزا بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ لمنع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة. تقاطعات ضيقة (TJ) ختم فعال الفضاء شبه الخلوية في الطبقات الأحادية مما أدى إلى حاجز سليمة. تصف هذه الدراسة فحص الفلورة القائم على LY التي يمكن استخدامها لتحديدمعامل نفاذية واضحة (P التطبيق) وبدورها يمكن استخدامها لتحديد حركية تشكيل الطبقات الأحادية المطابقة وتقاطع ضيق الناتجة سلامة الحاجز في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. كما نبرهن على فائدة إضافية من هذا الاختبار لتحديد السلامة الوظيفية TJ في الخلايا المنقولة. بياناتنا من LY Pالتطبيق فحص يظهر أن الخلايا hCMEC / D3 البذر في إعداد transwell تحد بشكل فعال LY النقل شبه الخلوي 7 أيام بعد الثقافة. كفائدة إضافية من فحص المقدمة، ونحن نثبت أيضا أن نقل الجسيمات النانوية الحمض النووي لا يغير LY النقل شبه الخلوي في الطبقات الأحادية hCMEC/D3.

أولا، حددنا تأثير وقت الزراعة على نفاذية LY لتحديد الحركية الظاهرة لتشكيل TJ. يتم عرض قيمالتطبيق LY P المتوسط من اليوم 1 إلى 10 آخر البذر في الشكل 2a. في اليوم 1، كانمتوسط P التطبيق 4.25 × 10-4 سم / دقيقة وانخفض قليلا إلى 3.32 × 10-4 سم / دقيقة في اليو...

Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري

نقدم اختبار الفلورة لإثبات أن لوسيفر الأصفر (LY) هو علامة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلايا الظاهرة من الخلايا أحادية hCMEC /D3، وهو نموذج في المختبر من حاجز الدم والدماغ البشري. استخدمنا هذا الفحص لتحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات في خلايا hCMEC/D3 المستزرعة.

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

هذا البروتوكول هو تقنية قوية لتحديد سلامة وظيفية من تقاطعات ضيقة بين الخلايا في نموذج خلية من حاجز الدم البشري في الدماغ. هذا هو بروتوكول بسيط وغير مكلفة إلى حد ما يسمح بحساب نفاذية واضحة في فترة زمنية أقصر بدلا من تشغيل أطول المقايسة الحركية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحديد سلامة وظيفية من تقاطعات ضيقة في خلايا البطانية المخ المصابة بالجسيمات النانوية الحمض النووي البوليمر.لبدء طلاء الخلايا، تدرج ثقافة الأنسجة مكان مع أغشية microporous في لوحة ثقافة 24 جيدا. إضافة 400 ميكرولترات من 0.15 ملليغرام لكل ملليلتر نوع الكولاجين نوع واحد في كل إدراج ثقافة الأنسجة. ثم احتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون.صخرة لوحة 24-جيدا بلطف للسماح حتى انتشار حل الكولاجين على الغشاء microporous في إدراج ثقافة الأنسجة. بعد ساعة، قم بإزالة محلول الكولاجين وغسل الغشاء الصغير بلطف مع 0.4 ملليلتر من 1X PBS العازلة. الآن، لوحة خلايا hCMEC/D3 بكثافة 50،000 الخلايا لكل سنتيمتر مربع في إدراج الخلية.ضع لوحة 24-well مع إعداد ثقافة الأنسجة في الحاضنة للسماح بتعلق الخلايا والانتشار. احتضان لوحة لمدة سبعة أيام للسماح للخلايا للوصول إلى 100٪ التقاء. إزالة متوسطة النمو كل يومين ونقل 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام الطازجة قبل الدافئة في إدراج ثقافة الأنسجة.كرر إجراء الطلاء للنشاف الغربي لتحديد التغييرات في التعبير زو-1 لتحول جسيمات نانوية للحمض النووي، ولمقايسة ATP لتحديد جدوى الخلية في الخلايا المصابة. لتحديد نفاذية واضحة لوسيفر الأصفر، في كل يوم بعد البذر، وإزالة متوسطة النمو وإضافة 1.5 ملليلتر من العازلة النقل قبل الدافئة إلى الجانب القاعدي من البئر. الآن إضافة 58.3 ميكرولترات من 20 ميكرومولار لوسيفر الأصفر حل إلى الجانب apical من كل إدراج عبر جيدا.حفظ 50 ميكرولترات من الحل لقياسات الفلوريسنس. بعد إزالة تماما المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني المتبقية من الجانب apical، إضافة حل لوسيفر الأصفر في أسرع وقت ممكن لتجنب تجفيف الخلايا. ضمان وحدات التخزين دقيقة من حل لوسيفر الأصفر في الجانب apical.تأكد من إضافة نفس الحجم والدقة من حل لوسيفر الأصفر في جميع إدراج. العمل بسرعة لتجنب تجفيف الخلايا. احتضان الخلايا في لوحة دوارة شاكر في 100 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.ثم قم بإزالة 30 ميكرولترات من العينة الصفراء لوسيفر من كل مقصورة apical. نقل 20 ميكرومولار لوسيفر الأصفر الحل وعينات الجانب apical إلى أنابيب المسمى مسبقا. الآن تمييع العينة عشرة أضعاف باستخدام مخزن النقل المؤقت.قم بإزالة 500 ميكرولترتر من كل حجرة سفلي، ثم قم بنقل العينة إلى أنابيب تحمل علامات مسبقة. إعداد سلسلة من المعايير الصفراء لوسيفر للمنحنى القياسية. إضافة 100 ميكرولتررس من كل عينة apical والقياسية القاعدية إلى كل بئر من لوحة سوداء 96-well في مكررة.استخدم قارئ الفلورسينت الصغير لقياس شدة الفلور الأصفر لوسيفر وحساب نفاذية الظاهري، كما هو موضح في نص المخطوطة. تم استخدام تأثير وقت الاستزراع على نفاذية لوسيفر الصفراء لتحديد الحركية الظاهرة لتشكيل تقاطع ضيق. انخفضت قيم نفاذية واضح بشكل ملحوظ في اليوم السابع مقارنة مع اليوم الأول، مما يشير إلى أن الحاجز أصبح أكثر إحكاما.ثم استقرت قيم نفاذية واضح حتى اليوم 10. وهذا يعني أن تشكيل الحاجز كان كاملاً وعمليًا، مما أدى إلى انخفاض النقل شبه الخلوي الأصفر لوسيفر. تم استخدام النشاف الغربي للكشف عن التغيرات في التعبير عن البروتين ضيق تقاطع ZO-1 مع مرور الوقت.ويمثل النطاقان الشكلين زو-1. وكشف تحليل قياس الكثافة أن قيمة بكسل ZO-1 زادت من الأيام من ثلاثة إلى سبعة بعد البذر، مما يشير إلى أن البروتين تقاطع ضيق ZO-1 شكلت باستمرار من الأيام من ثلاثة إلى سبعة. بعد معالجة استنفاد الكالسيوم في اليوم السابع بعد البذر، كان نطاق ZO-1 غير قابل للكشف تقريبًا، مما يشير إلى أن ZO-1 لم يتمكن من التشكل في غياب أيونات الكالسيوم.كما هو مبين في النتائج، يمكن إجراء النشاف الغربي من البروتين زو-1 لتحديد التغيرات في مستوى التعبير من البروتينات تقاطع ضيق، واستكمال لوسيفر الأصفر القائم على البيانات النشاط الوظيفي. اكتشفنا أيضا أن النشاط الوظيفي للمفترقات الضيقة في الخلايا البطانية في الدماغ البشري لم يتأثر بتحول جسيمات نانوية للحمض النووي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

في المختبر تخلل من Ferritins تحميل FITC-عبر الفأر حاجز الدم في الدماغ: نموذج لدراسة تسليم Nanoformulated الجزيئات

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

في الوقت الحقيقي داخل المجهرية متعددةفوتون لتصور الموجات فوق الصوتية المركزة والعلاجات Microbubble لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

بناء نموذج لخلية عضلية ملساء للشريان الأورطي البشري على رقاقة لتلخيص الإجهاد الميكانيكي الحيوي في جدار الأبهر

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

اضطراب الحاجز الدموي للحبل الشوكي باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة منخفضة الكثافة في نموذج الفئران

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...