Name: lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch den New Investigator Award 2017 der American Association of Pharmacy, einen Hunkele Dreaded Disease Award der Duquesne University und die School of Pharmacy Start-up-Fonds für das Manickam-Labor. Wir möchten dem Leak-Labor (Duquesne University) für die Unterstützung durch western Blotting danken und die Verwendung ihres Odyssey 16-Bit-Imagers ermöglichen. Wir möchten auch eine besondere Dankesnote für Kandarp Dave (Manickam Labor) für die Hilfe bei western blotting.

1.Allgemeine hCMEC/D3 Zellkultur
<ol><li>Reanimation von gefrorenen Zellen HINWEIS: Alle Zellkulturpflege- und Experimente wurden in einer sterilen Biosicherheitshaube durchgeführt. Kulturmedien, Nahrungsergänzungsmittel und Reagenzien wurden entweder als sterile Produkte gekauft oder über Filtration mit einem 0,22 m Membranfilter sterilisiert, um mikrobielle Kontaminationen zu verhindern.<ol>
<li>8,5 ml Kollagenlösung (0,15mg/ml) in einen Gewebekulturkolben (75 cm2 Wachstumsbereich; ...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Griep, L. 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Eine Schlüsselrolle des BBB besteht darin, den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zwischen der systemischen Zirkulation und dem Gehirn zu verhindern, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Eines der charakteristischen Merkmale des BBB ist die Fähigkeit der Kapillaren-Endothelzellen, enge Knoten (TJs) zu bilden, die den parazellulären Transportweg effektiv versiegeln. Wir demonstrierten einen LY P App-Assay als quantitative Methode zur Bestimmung der s...

Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist die Schutzbarriere, die den Zustrom von Plasmakomponenten in das Gehirngewebe begrenzt und besteht aus Hirn-Endothelzellen zusammen mit unterstützenden Zellen wie Pericyten. Die Hauptrolle von BBB ist es, als Barriere zu dienen, die den Raum zwischen peripherem Blut und zentralem Nervensystem (ZNS) versiegelt, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung1,2zu erhalten. Die Hirnkapillaren-Endothelzellen versiegeln den parazellulären Weg effektiv durch Bildung interzellulärer enger Verbindungen (TJs)1. Diese Schutzbarriere ermöglicht glukose und ausgewählte Nährstoffe in das Gehirn zu gelangen, während es verhindert, dass die Mehrheit der Ionen, toxische Substanzen und Medikamente durch diese enge Barriere passieren. Neben ihrer Schützenrolle stellt die natürliche Barrierefunktion des BBB eine große Herausforderung bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen dar, die auf das ZNS abzielen.
In-vitro-Zellkulturmodelle der BBB sind hilfreiche Werkzeuge, um ihre Biologie zu studieren und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Integrität der TJ-Barriere zu verstehen. Wir verwendeten die menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzelllinie (hCMEC/D3) als In-vitro-Modell, da es sich um ein akzeptiertes Modell des menschlichen Gehirnendothel3 handelt und viele Funktionen des menschlichen BBB rekapituliert. hCMEC/D3ist eine der am häufigsten verwendeten Zelllinien für die Modellierung der BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Trotz ihrer vergleichsweise niedrigen Werte des transendotheliaalen elektrischen Widerstands (TEER), einem Maß für die Dichtheit der Barriere, behält diese Zelllinie die meisten morphologischen und funktionellen Eigenschaften von Hirnendothelzellen bei, selbst als Monokultur kokultivierte Gliazellen6,7. Die hCMEC/D3-Zelllinie drückt mehrere BBB-Marker einschließlich aktiver Transporter und Rezeptoren bis etwa Durchgang 35 aus, ohne eine Dedifferenzierung zu instabilen Phänotypen6,7,9 ,10,11. Das auffälligste Merkmal der hCMEC/D3-Zelllinie als In-vitro-BBB-Modell ist ihre Fähigkeit, TJs5,9,11,12zu bilden. Es sollte beachtet werden, dass, obwohl Stammzellen-abgeleitete BBB-Modelle in vielen Studien eine höhere Permeabilität zeigten als hCMEC/D3-Zelllinieund sie einige BBB-Marker ausdrücken, sie sich aber noch als das häufigste BBB-Zellmodell entwickeln 13 . Wichtig ist, dass stammzellenabgeleitete BBB-Modelle in Bezug auf maximale Durchgangszahlen gekennzeichnet werden müssen, die es den Zellen ermöglichen, stabile BBB-Phänotypen zu erhalten14.
Drei primäre Methoden werden häufig verwendet, um die Integrität der TJ-Barriere zu bestimmen,einschließlich der Messung von TEER, Messung des scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) von kleinen hydrophilen Tracermolekülen wie Saccharose, Inulin, Luzifergelb, usw. und Immunfärbung bekannter molekularer Marker von TJs wie claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER ist eine relativ einfache und quantitative Methode, die den elektrischen Widerstand über die Zellmonolayer misst, die auf einem porösen Membransubstrat kultiviert sind5. TEER-Werte können jedoch durch experimentelle Variablen wie die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Art des Messinstruments beeinflusst werden. Eine wahrscheinliche Kombination dieser Faktoren führt zu einer breiten Verteilung der TEER-Werte von 2 bis 1150 cm2 in der hCMEC/D3-Zelllinie, die für 2-21 Tage kultiviert wurde13. Immunostaining ist eine visuelle Methode, um das Vorhandensein von TJ-Proteinen zu bestimmen, indem das zielgerichtete Protein mit Antikörpern gekennzeichnet wird. Immunstaining beinhaltet jedoch eine Reihe von experimentellen Schritten, einschließlich der Notwendigkeit, Zellen zu fixieren/permeabilisieren, die zu experimentellen Artefakten führen können und die fluoreszierenden Signale können im Laufe der Zeit verblassen. Die oben genannten Faktoren können zu subjektiven Fehlern führen, die sich auf die Datenqualität auswirken.
Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt auf der Präsentation eines LY-basierten scheinbaren Permeabilitäts-Assays, der die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen bestimmt. Obwohl andere fortschrittliche In-vitro-BBB-Systeme, wie Co-Kultursysteme, mikrofluidische Systeme, physiologisch relevantere Mimik mit deutlich verbesserter Barrierefunktion15,16,17, das hCMEC/D3 sind transwell Setup ist ein einfaches und zuverlässiges Modell, um die Kinetik der TJ-Bildung zu schätzen und schnell die Wirkung verschiedener Arzneimittelformulierungen auf die Barrierefunktion abzuschirmen. Im Allgemeinen sind die P-App-Werte für verschiedene hydrophile Solutes in hCMEC/D3-Monolayern konsistent. Beispielsweise sind die gemeldeten P-App-Werte für verschiedene niedermolekulare Massensolutes (z. B. Saccharose, Mannitol, LY, etc.) in verschiedenen In-vitro-BBB-Modellen in der Größenordnung von 10-4 cm/min5,18,19 , 20. In unserem Versuchsaufbau werden die Endothelzellen des Gehirns auf einer kollagenbeschichteten mikroporösen Membran zur Zellanhaftung und Monolayerbildung gesät, um die In-vivo-Barriere nachzuahmen. Es wird erwartet, dass die in der apikalen Seite hinzugefügte LY die interzellulären engen Knoten durchqueren und sich in der basolateralen Seite ansammeln. Größere Konzentrationen von LY in der basolateralen Seite deuten auf eine unreife, nicht voll funktionsfähige Barriere hin, während niedrigere Konzentrationen einen eingeschränkten Transport aufgrund des Vorhandenseins funktioneller TJs widerspiegeln, was zu einer ausgereiften Barriere führt.
LY ist ein hydrophiler Farbstoff mit ausgeprägten Anregungs-/Emissionsspitzen und vermeidet die Notwendigkeit, Tracermoleküle wie Saccharose, Mannitol oder Inulin radioaktiv zu beschriften. So können die Fluoreszenzwerte von LY verwendet werden, um seine parazelluläre Permeabilität über die BBB-Monolayer direkt zu berechnen. Im Vergleich zu vielen kommerziell erhältlichen Farbstoffen, die in biomedizinischen Bereichen verwendet werden, die unter kleinen Stokes-Schichten wie Fluorescein21leiden, beträgt die Stokes-Verschiebung von LY etwa 108 nm mit ausreichender spektraler Trennung, so dass LY-Fluoreszenzdaten als robustes Auslesen zur Bestimmung der parazellulären Durchlässigkeit. Wir verwendeten Western Blotting als orthogonale Technik, um Veränderungen in der Expression des engen Knotenmarkerproteins ZO-1 im Laufe der Kulturzeit zu demonstrieren. ZO-1-Expression, die über Western Blotting erkannt wird, wird verwendet, um die LY P-App-Daten zu ergänzen, und in Kombination deuten diese Daten darauf hin, dass die beobachteten Veränderungen der LY P-App-Werte die Bildung einer Monolayer mit allmählicher Ausdruck der engen Anschlussmarkierung ZO-1.
Wie bereits erwähnt, liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit darin, einen LY-Assay als einfache Technik zur Überwachung der Bildung einer konfluenten Monoschicht mit funktionellen engen Knoten zu demonstrieren. Um jedoch einen zusätzlichen Nutzen des entwickelten Tests zu demonstrieren, haben wir die LY PApp in DNA-Nanopartikel-transfizierten hCMEC/D3-Monolayern gemessen. Nukleinsäuren können durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Polymergruppen und den negativ geladenen Phosphatgruppen von Nukleinsäuren 22 zu Polyelektrolyt-Nanopartikeln kondensiert werden22, 23. Wir bezeichnen diese Komplexe in unserer Arbeit als DNA-Nanopartikel (DNA-NPs). Während wir die Zelle transfetieren und das gewünschte Protein ausdrücken wollen, müssen wir sicherstellen, dass die Barriereeigenschaften der hCMEC/D3-Monolayer nicht beeinträchtigt werden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass ein standard4 h luziferase Gentransfektionsregime die LY-Permeabilität nicht messbar verändert, die den Nutzen des LY P App-Assays demonstriert, um Veränderungen in der TJ-Barriereintegrität zu bestimmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">hCMEC/D3 cell line</td>
			<td style="width:195px;">Cedarlane Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">102114.3C-P25</td>
			<td style="width:172px;">human cerebral microvascular endothelial cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gWizLuc</td>
			<td>Aldevron&#160;</td>
			<td>5000-5001</td>
			<td>Plasmid DNA encoding luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lucifer yellow CH dilithium salt&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>155267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Flat Bottom&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-Well Immuno Plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>437111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-MEM 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1951695</td>
			<td>Spinner-minimum essential medium (S-MEM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I&#160;</td>
			<td>Discovery Labware, Inc.</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Lysis 5X Reagent&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beetle Luciferin, Potassium Salt&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">SpectraMax i3&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Fluorescence Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ZO-1 Polyclonal Antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">61-7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:195px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">ab8245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:545px;">Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td style="width:123px;">128817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">12-well, Flat Bottom</td>
			<td style="width:195px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:123px;">25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">RIPA buffer (5X)</td>
			<td style="width:195px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">J62524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Odyssey CLx imager</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for scanning western blot membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier

Die Blut- und Hirnschranke BBB besteht aus Endothelzellen, die eine Barriere zwischen dem systemischen Kreislauf und dem Gehirn bilden, um den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zu verhindern. Enge Knoten (TJ) versiegeln effektiv den parazellulären Raum in den Monolayern, was zu einer intakten Barriere führt. Diese Studie beschreibt einen LY-basierten Fluoreszenz-Assay, der zur Bestimmung seinesscheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) verwendet werden kann und wiederum verwendet werden kann, um die Kinetik der Bildung von konfluenten Monolayern und die daraus resultierende enge Kreuzung zu bestimmen. Barriereintegrität in hCMEC/D3-Monolayern. Darüber hinaus zeigen wir einen zusätzlichen Nutzen dieses Assays, um die funktionelle Integrität von TJ in transfizierten Zellen zu bestimmen. Unsere Daten aus dem LY P App-Test zeigen, dass die hCMEC/D3-Zellen, die in einem Transwell-Setup gesät wurden, den LY-Parazelltransport effektiv auf 7 Tage nach der Kultur beschränken. Als zusätzlichen Nutzen des vorgestellten Tests zeigen wir auch, dass die DNA-Nanopartikeltransfektion den LY-Parazelltransport in hCMEC/D3-Monolayern nicht verändert.

Zuerst haben wir den Effekt der Kultivierungszeit auf die LY-Permeabilität bestimmt, um die scheinbare Kinetik der TJ-Bildung zu bestimmen. Die durchschnittlichen LY P-App-Werte vom Tag 1 bis 10-Post-Seeding sind in Abbildung 2adargestellt. Am ersten Tag betrug die durchschnittlicheP-App 4,25 x 10-4 cm/min und fiel am 2. Tag leicht auf 3,32 x 10-4 cm/min. Der mittlere P-App-Wert stieg am 3. Tag leicht au...

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Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

Wir präsentieren einen Fluoreszenz-Test, um zu zeigen, dass Lucifer Yellow (LY) ein robuster Marker ist, um die scheinbare parazelluläre Durchlässigkeit von hCMEC/D3-Zellmonolayern zu bestimmen, einem In-vitro-Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Wir verwendeten diesen Assay, um die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen zu bestimmen.

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Dieses Protokoll ist eine robuste Technik, um die funktionelle Integrität interzellulärer enger Knoten in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zu bestimmen. Dies ist ein einfaches und ziemlich kostengünstiges Protokoll, das es ermöglicht, die scheinbare Permeabilität in einem kürzeren Zeitraum zu berechnen, anstatt einen längeren kinetischen Assay auszuführen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die funktionelle Integrität von engen Knoten in Gehirn endotheliale Zellen transfiziert mit Polymer-DNA-Nanopartikeln zu bestimmen.Um mit der Zellbeschichtung zu beginnen, legen Sie Gewebekultureinsätze mit mikroporösen Membranen in eine 24-Well-Kulturplatte. Fügen Sie 400 Mikroliter 0,15 Milligramm pro Milliliter Kollagen Typ eins in jedem Gewebekultureinsatz hinzu. Dann für eine Stunde in einem 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator inkubieren.Rocken Sie die 24-Well-Platte sanft, um eine gleichmäßige Ausbreitung der Kollagenlösung über die mikroporöse Membran in den Gewebekultureinsätzen zu ermöglichen. Nach einer Stunde die Kollagenlösung entfernen und die mikroporöse Membran vorsichtig mit 0,4 Millilitern 1X PBS Puffer waschen. Jetzt, Platte hCMEC / D3-Zellen mit einer Dichte von 50 000 Zellen pro Quadratzentimeter in den Zelleneinsätze.Legen Sie die 24-Well-Platte mit Gewebekultur-Setup in den Inkubator, um Zellanhaftung und Proliferation zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platte für sieben Tage, damit die Zellen 100% Konfluenz erreichen können. Entfernen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag und übertragen Sie 0,5 Milliliter vorgewärmter Frischmedien in die Gewebekultureinsätze.Wiederholen Sie das Beschichtungsverfahren für Western Blotting, um Veränderungen der ZO-1-Expression für die DNA-Nanopartikeltransfektion zu bestimmen, und für den ATP-Test, um die Zelllebensfähigkeit in transfezierten Zellen zu bestimmen. Zur Bestimmung der scheinbaren Durchlässigkeit von Luzifergelb entfernen Sie an jedem Tag nach der Aussaat das Wachstumsmedium und fügen Sie 1,5 Milliliter vorgewärmten Transportpuffers auf die basolaterale Seite des Brunnens. Fügen Sie nun 58,3 Mikroliter 20-Mikromolar Lucifer Yellow Lösung auf der apikalen Seite jeder Trans-Well-Einsatz.Sparen Sie 50 Mikroliter der Lösung für Fluoreszenzmessungen. Nachdem Sie den Rest-PBS-Puffer vollständig von der apikalen Seite entfernt haben, fügen Sie die Luzifer-Gelb-Lösung so schnell wie möglich hinzu, um eine Trocknung der Zellen zu vermeiden. Stellen Sie genaue Volumina der Lucifer Yellow-Lösung auf der apikalen Seite sicher.Stellen Sie sicher, dass Sie das gleiche und genaue Volumen der Lucifer Yellow-Lösung in allen Einsätzen hinzufügen. Arbeiten Sie schnell, um das Trocknen der Zellen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen in einem Drehplatten-Shaker bei 100 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius für 60 Minuten.Dann entfernen Sie 30 Mikroliter der Lucifer Yellow Probe aus jedem apikalen Fach. Übertragen Sie die 20-Mikromolar Lucifer Yellow-Lösung und die apikalen Seitenproben in vorbeschriftete Röhrchen. Verdünnen Sie nun die Probe mit dem Transportpuffer verzehnfacht.Entfernen Sie 500 Mikroliter aus jedem basolateralen Fach und übertragen Sie die Probe in vorbeschriftete Schläuche. Bereiten Sie eine Reihe von Lucifer Yellow-Standards für die Standardkurve vor. Fügen Sie 100 Mikroliter jeder Standard-Apikal- und Basolateral-Probe zu jedem Brunnen einer schwarzen 96-Well-Platte in doppelter Ausführung hinzu.Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser, um die Luzifergelbe Fluoreszenzintensität zu messen und die scheinbare Permeabilität zu berechnen, wie im Manuskripttext beschrieben. Der Effekt der Kultivierungszeit auf die Durchlässigkeit von Luzifergelb wurde verwendet, um die scheinbare Kinetik der engen Knotenbildung zu bestimmen. Die sichtbaren Permeabilitätswerte sanken am siebten Tag im Vergleich zum ersten Tag deutlich, was darauf hindeutet, dass die Barriere enger wurde.Die scheinbaren Permeabilitätswerte stabilisierten sich dann bis zum 10. Tag. Dies implizierte, dass die Barrierebildung vollständig und funktionell war, was zu einem verringerten luzifergelben parazellulären Transport führte. Western Blotting wurde verwendet, um Veränderungen in der Expression des engen Knotenproteins ZO-1 im Laufe der Zeit zu erkennen.Die beiden Bänder stellen die beiden ZO-1-Isoformen dar. Die Densitometrie-Analyse ergab, dass der Pixelwert von ZO-1 von den Tagen drei bis sieben nach der Aussaat stieg, was darauf hindeutet, dass sich das enge Knotenprotein ZO-1 kontinuierlich von den Tagen drei bis sieben gebildet hat. Nach der Kalziumabbaubehandlung am siebten Tag nach der Aussaat war das Band von ZO-1 fast nicht nachweisbar, was darauf hindeutet, dass ZO-1 sich ohne Kalziumionen nicht bilden konnte.Wie in den Ergebnissen gezeigt, kann eine westliche Blotting von ZO-1-Protein durchgeführt werden, um Veränderungen in der Expressionsebene von engen Junction-Proteinen zu bestimmen, die die Lucifer Yellow-basierten funktionellen Aktivitätsdaten ergänzen. Wir entdeckten auch, dass die funktionelle Aktivität enger Kreuzungen in menschlichen Gehirnendothelzellen nicht durch DNA-Nanopartikeltransfektion beeinflusst wurde.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Intravitale Multiphotonenmikroskopie in Echtzeit zur Visualisierung fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen zur Erhöhung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

Störung der Blut-Rückenmark-Schranke mittels fokussiertem Ultraschall niedriger Intensität im Rattenmodell

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...