Name: lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

लेखक अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ फार्मेसी से 2017 के नए अन्वेषक पुरस्कार से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं, डुकस्ने विश्वविद्यालय से एक Hunkele dreaded रोग पुरस्कार और Manickam प्रयोगशाला के लिए फार्मेसी शुरू हुआ धन के स्कूल. हम पश्चिमी blotting सहायता के लिए रिसाव प्रयोगशाला (डुकस्ने विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं और उनके ओडिसी 16-बिट imager के उपयोग की अनुमति. हम पश्चिमी सोख्ता के साथ मदद के लिए कांदरद दवे (मानिकम प्रयोगशाला) के लिए प्रशंसा का एक विशेष नोट भी शामिल करना चाहेंगे।

1. जनरल hCMEC / डी 3 सेल संस्कृति
<ol><li>जमे हुए कोशिकाओं का पुनर्जीवन नोट: सभी सेल संस्कृति रखरखाव और प्रयोगों एक बाँझ biosafety हुड के अंदर प्रदर्शन किया गया. संस्कृति मीडिया, पूरक और अभिकर्मकों या तो बाँझ उत्...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Griep, L. 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BBB की एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए प्रणालीगत परिसंचरण और मस्तिष्क के बीच गैर जरूरी आयनों और विषाक्त पदार्थों के आदान-प्रदान को रोकने के लिए तंत्रिका microenvironment के hemostasis बनाए रखने के लिए है. BBB की विशेषता विशेषत?...

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) मस्तिष्क के ऊतकों में प्लाज्मा घटकों के प्रवाह को सीमित सुरक्षात्मक बाधा है और इस तरह के pericytes के रूप में समर्थन कोशिकाओं के साथ मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के होते हैं. बीबीबी की प्रमुख भूमिका एक अवरोध के रूप में काम करना है जो परिधीय रक्त और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के बीच की जगह को सील करता है ताकि तंत्रिका सूक्ष्म पर्यावरण1,2के हेमोस्टेसिस को बनाए रख सके . मस्तिष्क केशिका अंत:संवदेलिया कोशिकाएं अंतरकोशिकीय तंग जंक्शनों (टीजे)1के गठन के माध्यम से परकोशिकीय मार्ग को प्रभावी ढंग से सील करती हैं। यह सुरक्षात्मक बाधा ग्लूकोज और चयनित पोषक तत्वों मस्तिष्क में प्रवेश करने की अनुमति देता है, जबकि यह आयनों के बहुमत को रोकता है, विषाक्त पदार्थों और दवाओं इस तंग बाधा के माध्यम से गुजर से. इसकी सुरक्षात्मक भूमिका के अलावा, बीबीबी का प्राकृतिक अवरोध समारोह सीएनएस को लक्षित करने वाली दवा वितरण प्रणालियों के विकास में एक गंभीर चुनौती बन गया है।
BBB के इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल अपने जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए और TJ बाधा अखंडता पर दवा उपचार के प्रभाव को समझने के लिए उपयोगी उपकरण हैं. हम एक इन विट्रो मॉडल के रूप में मानव मस्तिष्क microvascular endothelial सेल लाइन (hCMEC/D3) का इस्तेमाल किया क्योंकि यह मानव मस्तिष्क endothelium3 के एक स्वीकार किए जाते हैं मॉडल है और मानव BBB के कई कार्यों recapitulates. hCMEC/D3is इन विट्रो4,5,6,7,8,9में BBB मॉडलिंग के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेल लाइनों में से एक . transendothelial विद्युत प्रतिरोध (टीईईईईआर) के अपने अपेक्षाकृत कम मूल्यों के बावजूद, बाधा जकड़न का एक उपाय है, इस सेल लाइन मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के रूप में रूपात्मक और कार्यात्मक गुणों के अधिकांश बरकरार रखती है, यहां तक कि की अनुपस्थिति में एक मोनोकल्चर के रूप में सहकृषि ग्लिल कोशिकाएं6,7. HCMEC/D3 सेल लाइन सक्रिय ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स सहित कई BBB मार्करों व्यक्त करता है जब तक लगभग मार्ग 35 अस्थिर phenotypes6,7,9 के लिए dedifferentiation के दौर से गुजर के बिना ,10,11. इन विट्रो बीबीबी मॉडल के रूप में एचसीएमईसी/डी 3 सेल लाइन की सबसे उल्लेखनीय विशेषता टीजे5,9,11,12बनाने की क्षमता है . यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि स्टेम सेल व्युत्पन्न BBB मॉडल hCMEC/D3 सेल लाइन के साथ तुलना में कई अध्ययनों में उच्च पारगम्यता से पता चला है और वे कुछ BBB मार्करों व्यक्त करते हैं, वे अभी तक सबसे आम BBB सेल मॉडल13के रूप में विकसित करने के लिए कर रहे हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि स्टेम सेल व्युत्पन्न BBB मॉडल अधिकतम मार्ग संख्या है कि कोशिकाओं को स्थिर BBB phenotypes14बनाए रखने के लिए अनुमति देने के संबंध में विशेषता होना शेष है.
तीन प्राथमिक तरीकों आमतौर पर टीजे बाधा अखंडता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, TEER की माप सहित, स्पष्ट पारगम्य गुणांक की माप (पीअनुप्रयोग) इस तरह के सुक्रोज, inulin, Lucifer पीला के रूप में छोटे हाइड्रोफिलिक अनुरेखक अणुओं की, आदि और TJs के ज्ञात आणविक मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग जैसे कि क्लाउडिन-5, जेडओ-1, ऑक्लूडिन, आदि5. टीईईईआर एक अपेक्षाकृत सरल और मात्रात्मक विधि है जो छिद्रयुक्त झिल्ली पर सुसंस्कृत कोशिका मोनोलेयरों के पार विद्युत प्रतिरोध को मापता है. हालांकि, TEER मूल्यों इस तरह की संस्कृति माध्यम की संरचना और माप साधन के प्रकार के रूप में प्रयोगात्मक चर से प्रभावित किया जा सकता है। इन कारकों के संभावित संयोजन से 2-21 दिनों 13 के लिए सुसंस्कृत एचसीएमईसी/डी 3 सेल लाइन में2 से 1150 सेमी2 तक के टीईईआर मूल्यों का व्यापक वितरण होता है। इम्यूनोस्टेनिंग एंटीबॉडी का उपयोग करलक्षित प्रोटीन लेबलिंग द्वारा टीजे प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक दृश्य विधि है। हालांकि, इम्यूनोस्टेनिंग में प्रयोगात्मक चरणों की एक श्रृंखला शामिल है, जिसमें प्रयोगात्मक कलाकृतियों में परिणाम हो सकने वाली कोशिकाओं को ठीक करने/परमेबिलाइज़ करने की आवश्यकता शामिल है और फ्लोरोसेंट सिग्नल समय के साथ फीका हो सकते हैं। उपरोक्त कारकों व्यक्तिपरक त्रुटियों डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
इस कार्य का प्राथमिक फोकस एक LY-आधारित स्पष्ट पारगम्यता परख को सुसंस्कृत hCMEC/D3 कोशिकाओं में एक confluent मोनोलेयर गठन की गतिज निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत करने के लिए है। हालांकि अन्य उन्नत इन विट्रो BBB सिस्टम, जैसे सह-संस्कृति प्रणाली, microfluidic सिस्टम, शारीरिक रूप से काफी सुधार बाधा समारोह15,16,17, hCMEC / ट्रांसवेल सेटअप टीजे गठन की गतिज ताकने और बाधा समारोह पर विभिन्न दवा योगों के प्रभाव को तेजी से स्क्रीन करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय मॉडल है। सामान्य में, पीएप्लिकेशन मूल्यों hCMEC/D3 monolayers में विभिन्न हाइड्रोफिलिक विलेय के लिए संगत कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न कम आणविक द्रव्यमान विलेय के लिए रिपोर्ट किए गए पीऐप मान (जैसे कि सुक्रोज, मैनिटॉल, एलई, आदि) विभिन्न इन विट्रो बीबीबी मॉडल में 10 -4 सेमी/ , 20.हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं कोशिका लगाव और monolayer गठन के लिए एक कोलेजन लेपित microporous झिल्ली पर बीज रहे हैं में विवो बाधा की नकल. शीर्ष पक्ष में जोड़ा गया लया गया अंतरकोशिकीय तंग संधिओं को पार करने और बासोपार्श्विक पक्ष में जमा होने की आशा है। बासोपार्श्व पक्ष में एलएचई की अधिक सांद्रता एक अपरिपक्व, पूर्ण रूप से कार्यात्मक बाधा का संकेत देती है, जबकि कम सांद्रता एक परिपक्व बाधा में जिसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक टीजे की उपस्थिति के कारण प्रतिबंधित परिवहन को प्रतिबिंबित करती है।
एलई एक हाइड्रोफिलिक डाई है जिसमें अलग-अलग उत्तेजना/उत्सर्जन चोटियों होती है और सुक्रोज, मैनिटॉल या इनुलिन जैसे रेडियोलेबल ट्रेसर अणुओं की आवश्यकता से बचा जाता है। इस प्रकार, एलई के फ्लोरोसेंट मानों का उपयोग BBB मोनोलेयर्स में इसकी पारकोशिकीयता की प्रत्यक्ष गणना करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, जैव चिकित्सा क्षेत्रों में उपयोग किए जाने वाले कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों की तुलना में जो फ्लोरोरेसिन21जैसे छोटे स्टोक्स शिफ्ट से पीड़ित हैं, एलआई के स्टोक्स शिफ्ट पर्याप्त वर्णक्रमीय जुदाई के साथ लगभग 108 एनएम है, इस प्रकार एलआई फ्लोरोसेंस डेटा को एक के रूप में अनुमति देता है paracellular पारगम्यता निर्धारित करने के लिए मजबूत readout. हम एक orthogonal तकनीक के रूप में पश्चिमी blotting का इस्तेमाल किया तंग जंक्शन मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए, $O-1, संस्कृति के समय पर. ओओ-1 अभिव्यक्ति पश्चिमी blotting के माध्यम से पता चला LY Pएप्लिकेशन डेटा के पूरक और संयोजन में प्रयोग किया जाता है, इन आंकड़ों का सुझाव है कि LY Pअनुप्रयोग मूल्यों में मनाया परिवर्तन में क्रमिक वृद्धि के साथ एक मोनोलेयर के गठन के चिंतनशील है तंग जंक्शन मार्कर की अभिव्यक्ति, $O-1.
जैसा कि पहले बताया गया है, इस काम का केंद्रीय ध्यान कार्यात्मक तंग जंक्शनों के साथ एक confluent monolayer के गठन की निगरानी के लिए एक सरल तकनीक के रूप में एक LY परख प्रदर्शित करने के लिए है. हालांकि, विकसित परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, हम डीएनए नैनोकण में LY पीएप्लिकेशन को मापा-transfected hCMEC / न्यूक्लिक अम्लों को पॉलिमर के धनावेशित समूहों तथा न्यूक्लिक अम्लों के ऋणावेषित फॉस्फेट समूहों के बीच स्थिर वैद्युत अन्योन्यक्रिया के माध्यम से 100-200 दउ के व्यास वाले पॉलीइलेक्ट्रोलाइट नैनोकणों में संघनित किया जा सकताहै, 23हम अपने काम में डीएनए नैनोकणों (डीएनए एन पी एस) के रूप में इन परिसरों का उल्लेख करते हैं। जबकि हमारा इरादा कोशिकाओं transfect और वांछित प्रोटीन व्यक्त करने के लिए है, हम यह सुनिश्चित करना चाहिए कि hCMEC/D3 monolayers के बाधा गुण समझौता नहीं कर रहे हैं. हमारे डेटा से पता चलता है कि एक मानक 4 एच luciferase जीन transfection शासन measurably LY Pएप्लिकेशन परख की उपयोगिता का प्रदर्शन TJ बाधा अखंडता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए परिवर्तन नहीं करता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">hCMEC/D3 cell line</td>
			<td style="width:195px;">Cedarlane Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">102114.3C-P25</td>
			<td style="width:172px;">human cerebral microvascular endothelial cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gWizLuc</td>
			<td>Aldevron&#160;</td>
			<td>5000-5001</td>
			<td>Plasmid DNA encoding luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lucifer yellow CH dilithium salt&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>155267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Flat Bottom&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-Well Immuno Plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>437111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-MEM 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1951695</td>
			<td>Spinner-minimum essential medium (S-MEM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I&#160;</td>
			<td>Discovery Labware, Inc.</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Lysis 5X Reagent&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beetle Luciferin, Potassium Salt&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">SpectraMax i3&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Fluorescence Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ZO-1 Polyclonal Antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">61-7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:195px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">ab8245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:545px;">Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td style="width:123px;">128817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">12-well, Flat Bottom</td>
			<td style="width:195px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:123px;">25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">RIPA buffer (5X)</td>
			<td style="width:195px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">J62524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Odyssey CLx imager</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for scanning western blot membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier

रक्त मस्तिष्क बाधा BBB endothelial कोशिकाओं है कि प्रणालीगत परिसंचरण और मस्तिष्क के बीच एक बाधा फार्म गैर जरूरी आयनों और विषाक्त पदार्थों के आदान प्रदान को रोकने के होते हैं. तंग जंक्शनों (टीजे) प्रभावी ढंग से एक परतों में paracellular अंतरिक्ष एक बरकरार बाधा में जिसके परिणामस्वरूप सील. यह अध्ययन एक LY-आधारित फ्लोरोसेंट परख का वर्णन करता है जिसका उपयोग इसकी स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पीऐप)निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और बदले में इसका उपयोग संप्रवाही मोनोलेयरों के गठन की गतिजता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और परिणामस्वरूप तंग जंक्शन HCMEC/D3 मोनोलेयर्स में बाधा अखंडता। हम आगे transfected कोशिकाओं में TJ कार्यात्मक अखंडता निर्धारित करने के लिए इस परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता प्रदर्शित करता है. एलई पीएप्लिकेशन परख से हमारे डेटा से पता चलता है कि hCMEC/D3 कोशिकाओं को एक ट्रांसवेल सेटअप में वरीयता प्राप्त प्रभावी ढंग से LY paracellular परिवहन 7 दिन के बाद संस्कृति सीमा. प्रस्तुत परख की एक अतिरिक्त उपयोगिता के रूप में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि डीएनए नैनोकण transfection एचसीएमईसी/डी 3 मोनोलेयर्स में LY paracellular परिवहन को परिवर्तित नहीं करता है।

सबसे पहले, हम TJ गठन की स्पष्ट गतिजता निर्धारित करने के लिए LY पारगम्यता पर समय culturing के प्रभाव का निर्धारण किया. दिन 1 से 10-पोस्ट बोने के लिए मतलब LY Pएप्लिकेशन मान चित्र 2aमें दिखाए ग?...

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Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer पीला - मानव रक्त मस्तिष्क बैरियर के एक सेल मॉडल में एक मजबूत Paracellular स्थायित्व मार्कर

हम एक फ्लोरोसेंट परख प्रस्तुत करने के लिए प्रदर्शित करता है कि Lucifer पीला (LY) एक मजबूत मार्कर hCMEC/D3 सेल monolayers, मानव रक्त मस्तिष्क बाधा के एक इन इन इन इन इन इन इन इन इन इन इन विट्रो मॉडल की स्पष्ट paracellular पारगम्यता निर्धारित करने के लिए है. हमने इस परख का उपयोग सुसंस्कृत एचसीएमईसी/डी 3 कोशिकाओं में एक-प्रवाही मोनोलेयर गठन की गतिज ताक का प्रयोग किया।

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

यह प्रोटोकॉल मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा के सेल मॉडल में इंटरसेलुलर तंग जंक्शनों की कार्यात्मक अखंडता को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत तकनीक है। यह एक सरल और काफी सस्ती प्रोटोकॉल है जो लंबे समय तक गतिज परख चलाने के बजाय कम समय अवधि में स्पष्ट पारमशीलता की गणना की अनुमति देता है। इस विधि का उपयोग बहुलक डीएनए नैनोकणों से संक्रमित मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं में तंग जंक्शनों की कार्यात्मक अखंडता को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है।सेल प्लेटिंग शुरू करने के लिए, ऊतक संस्कृति को 24-अच्छी संस्कृति प्लेट में माइक्रोपोरस झिल्ली के साथ सम्मिलित करें। प्रत्येक ऊतक संस्कृति डालने में 0.15 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर कोलेजन टाइप एक के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट।24-अच्छी तरह से प्लेट को धीरे-धीरे रॉक करें ताकि ऊतक संस्कृति आवेषण में माइक्रोपोरस झिल्ली पर कोलेजन समाधान के प्रसार की अनुमति दी जा सके। एक घंटे के बाद, कोलेजन समाधान को हटा दें और धीरे-धीरे 1X पीबीएस बफर के 0.4 मिलीलीटर के साथ माइक्रोपोरस झिल्ली को धोएं। अब, सेल आवेषण में प्रति वर्ग सेंटीमीटर 50, 000 कोशिकाओं के घनत्व के साथ एचसीएमईसी/डी3 कोशिकाओं की प्लेट करें।सेल लगाव और प्रसार की अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर में ऊतक संस्कृति सेटअप के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेट रखें। कोशिकाओं को 100% तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए सात दिनों तक प्लेट को इनक्यूबेट करें। हर दूसरे दिन विकास माध्यम निकालें और ऊतक संस्कृति आवेषण में पूर्व गर्म ताजा मीडिया के 0.5 मिलीलीटर स्थानांतरित करें।डीएनए नैनोपार्टिकल ट्रांसफैक्शन के लिए ZO-1 अभिव्यक्ति में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए चढ़ाना प्रक्रिया दोहराएं, और एटीपी परख के लिए संक्रमित कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए। लूसिफ़ेर पीला स्पष्ट पारमशीलता का निर्धारण करने के लिए, प्रत्येक दिन के बाद बोने पर, विकास माध्यम को हटा दें और अच्छी तरह से बेसोलाटरियल पक्ष में पूर्व-गर्म परिवहन बफर के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। अब प्रत्येक ट्रांस-वेल डालने के एपिकल साइड में 20-माइक्रोमोलर लूसिफ़ेर येलो सॉल्यूशन के 58.3 माइक्रोलीटर जोड़ें।फ्लोरेसेंस मापन के लिए समाधान के 50 माइक्रोलीटर बचाएं। अपिकल साइड से अवशिष्ट पीबीएस बफर को पूरी तरह से हटाने के बाद, कोशिकाओं को सुखाने से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके लूसिफ़ेर पीला समाधान जोड़ें। एपिकल साइड में लूसिफ़ेर येलो सॉल्यूशन की सटीक मात्रा सुनिश्चित करें।सभी आवेषण में लूसिफ़ेर येलो सॉल्यूशन की समान और सटीक मात्रा जोड़ना सुनिश्चित करें। कोशिकाओं को सुखाने से बचने के लिए जल्दी से काम करें। 100 आरपीएम पर रोटरी प्लेट शेकर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।इसके बाद प्रत्येक एपिकल डिब्बे से लूसिफ़ेर येलो सैंपल के 30 माइक्रोलीटर निकालें। 20 माइक्रोमोलर लूसिफ़ेर येलो सॉल्यूशन और एपिकल साइड सैंपल को प्री-लेबल वाली ट्यूब्स में ट्रांसफर करें । अब परिवहन बफर का उपयोग करके नमूना दस गुना पतला करें।प्रत्येक बेसोल्टेरल डिब्बे से 500 माइक्रोलीटर निकालें, और नमूना को पूर्व-लेबल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। मानक वक्र के लिए लूसिफ़ेर पीले मानकों की एक श्रृंखला तैयार करें। प्रत्येक मानक एपिकल और बेसोटेरल नमूने के 100 माइक्रोलीटर डुप्लिकेट में एक काले 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ें।लूसिफ़ेर येलो फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने और पांडुलिपि पाठ में वर्णित स्पष्ट पारगम्यता की गणना करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करें। लूसिफ़ेर येलो पारगम्यता पर समय की खेती के प्रभाव का उपयोग तंग जंक्शन गठन के स्पष्ट गतिज को निर्धारित करने के लिए किया गया था। स्पष्ट पारमशीलता मूल्यों में काफी एक दिन की तुलना में सात दिन पर कमी आई, सुझाव है कि बाधा सख्त हो गया ।स्पष्ट पारमशीलता मूल्यों तो 10 दिन तक स्थिर । यह निहित बाधा गठन पूरा और कार्यात्मक था, जिसके परिणामस्वरूप लूसिफ़ेर पीला पैरासेलुलर परिवहन कम हो गया। समय के साथ टाइट जंक्शन प्रोटीन जेडओ-1 की अभिव्यक्ति में बदलाव का पता लगाने के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग का इस्तेमाल किया गया ।दो बैंड दो जेडओ-1 आइसोफॉर्म का प्रतिनिधित्व करते हैं। घनत्व विश्लेषण से पता चला है कि ZO-1 के पिक्सेल मूल्य तीन दिनों से सात पोस्ट सीडिंग के माध्यम से वृद्धि हुई है, सुझाव है कि तंग जंक्शन प्रोटीन ZO-1 लगातार तीन दिनों से सात के माध्यम से गठन किया । सात दिन के बाद बोने पर कैल्शियम घट उपचार के बाद, ZO-1 के बैंड लगभग अज्ञेय था, यह दर्शाता है कि ZO-1 कैल्शियम आयनों के अभाव में फार्म में असमर्थ था ।जैसा कि परिणामों में दिखाया गया है, जेडओ-1 प्रोटीन के पश्चिमी ब्लॉटिंग को टाइट जंक्शन प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जो लूसिफ़ेर येलो-आधारित कार्यात्मक गतिविधि डेटा के पूरक हैं। हमने यह भी पता लगाया कि मानव मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं में तंग जंक्शनों की कार्यात्मक गतिविधि डीएनए नैनोपार्टिकल ट्रांसफैक्शन से प्रभावित नहीं थी।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

प्रोटीन और सेल बन्दिश के लिए दो आयामी नमूनों Substrates बनाना

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

मानव सेल संस्कृति घूर्णन सेल संस्कृति सिस्टम: एक मॉडल के रूप में मानव ट्रोफोब्लास्ट कक्ष

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

विधि रक्त मस्तिष्क बाधा के एक मानव कोशिका आधारित, संपर्क माडल की तैयारी के लिए बेहतर

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

एक मजबूत, microfluidic intracellular वितरण मंच के रूप में सेल फैलाएंगे

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

एक चूहा रक्त मस्तिष्क बाधा पार FITC से भरी हुई Ferritins की इन विट्रो पारगमन में: एक मॉडल का अध्ययन करने के लिए nanoformulated अणु की डिलिवरी

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

मैट्रिक्स-सेल मेटाबोलिक क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक मानव 3 डी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडिंग का उपयोग करके मानव क्यूटिनियस हाइपरट्रोफिक स्कैरिंग के विट्रो मॉडल में

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

वास्तविक समय Intravital Multiphoton माइक्रोस्कोपी केंद्रित अल्ट्रासाउंड और Microbubble उपचार की कल्पना करने के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता बढ़ाने के लिए

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

महाधमनी दीवार में बायोमेकेनिकल स्ट्रेन को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिका अंग-ऑन-ए-चिप मॉडल का निर्माण

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

चूहे के मॉडल में कम तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके रक्त-रीढ़ की हड्डी की बाधा का विघटन

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...