Name: lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

著者らは、米国薬学会の2017年新研究者賞、デュケイン大学のハンケル恐れ病賞、マニッカム研究所の薬学部のスタートアップファンドからの財政的支援に感謝しています。私たちは、リーク研究所(デュケスネ大学)の西洋のブロッティング支援とオデッセイ16ビットイメージャーの使用を許可してくれたことに感謝します。また、カンダルプ・デイブ(マニッカム研究所)に対する感謝の気持ちを、西洋のブロッティングの助けを借りておきたい。

1.一般的なhCMEC/D3細胞培養
<ol><li>凍結細胞の蘇生 注:すべての細胞培養維持および実験は無菌バイオセーフティフード内で行われた。培養培養剤、サプリメントおよび試薬は、無菌製品として購入するか、または微生物汚染を防止するために0.22 μm膜フィルターを用いて濾過を介して殺菌された。<ol>
<li>組織培養フラスコ(75cm2成長面積、今後はT75と呼ばれる)にコラーゲ?...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Camos, S., Mallolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+assaying+microvascular+endothelial+cell+pathophysiology+in+stroke.">Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke.</a> Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).</li><li>Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Blood-Brain+Barrier+Models-An+Overview+of+Established+Models+and+New+Microfluidic+Approaches.">In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Ohtsuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+targeted+absolute+proteomic+analysis+of+transporters,+receptors+and+junction+proteins+for+validation+of+human+cerebral+microvascular+endothelial+cell+line+hCMEC/D3+as+a+human+blood-brain+barrier+model.">Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).</li><li>Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+and+Drug+Delivery--In+vitro+Models+of+the+Ischemic+Blood-Brain+Barrier.">Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Llombart, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+secretomes+from+a+human+blood+brain+barrier+endothelial+cells+in-vitro+model+after+ischemia+by+stable+isotope+labeling+with+aminoacids+in+cell+culture+(SILAC).">Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC).</a> Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Avdeef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+can+in+vitro+brain+microcapillary+endothelial+cell+models+predict+rodent+in+vivo+blood-brain+barrier+permeability?.">How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells.">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).</li><li>Shao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+blood-brain+barrier+model+in+a+membrane-based+microchip+for+characterization+of+drug+permeability+and+cytotoxicity+for+drug+screening.">Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening.</a> Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).</li><li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+lab-on-a-chip+tool+for+modeling+biological+barriers.">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+evaluating+drug+transport+across+the+blood&#8211;brain+barrier.">In vitro model for evaluating drug transport across the blood&#8211;brain barrier.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+the+blood&#8211;brain+barrier+in+drug+discovery+and+development.">Modelling of the blood&#8211;brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).</li><li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).</li><li>Deli, M. A., &#193;brah&#225;m, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+Studies+on+In+vitro+Blood&#8211;Brain+Barrier+Models:+Physiology,+Pathology,+and+Pharmacology.">Permeability Studies on In vitro Blood&#8211;Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li><li>Ren, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+General+Method+To+Increase+Stokes+Shift+by+Introducing+Alternating+Vibronic+Structures.">A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Oupick&#253;, D., Kon&#225;k, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+delivery+systems+based+on+complexes+of+DNA+with+synthetic+polycations+and+their+copolymers.">DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers.</a> Journal of Controlled Release. 65, (2000).</li><li>Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).</li><li>Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trans-monolayer+permeability+calculations:+often+forgotten+assumptions.">In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions.</a> research focus reviews. 8, (2003).</li><li>Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li><li>Balda, M. S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+tight+junctions+are+revealed+by+ZO-1+isoforms.">Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms.</a> The American Physiological Society. , (1992).</li><li>Brown, R. C., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Modulation+of+Adherens+and+Tight+Junction+Function:+A+Potential+Mechanism+for+Blood-Brain+Barrier+Disruption+After+Stroke.">Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke.</a> Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).</li><li>Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Ca2++directly+regulates+tight+junctional+permeability+in+the+human+cervical+cell+line+CaSki.">Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).</li><li>Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+lntracellular+Calcium+in+Tight+Junction+Biogenesis.">Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).</li><li>Tobey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).</li><li>Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).</li><li>Posimo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+assays+for+cells+in+culture.">Viability assays for cells in culture.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+transport+as+a+mechanism+of+blood-brain+barrier+disruption+during+stroke.">Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke.</a> Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).</li><li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+surface+properties+on+nanoparticle-mediated+transport+of+drugs+to+the+brain.">Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.</a> Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).</li><li>Markoutsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+permeability+studies+of+BBB-targeting+immunoliposomes+using+the+hCMEC/D3+cell+line.">Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).</li></ol>

BBBの重要な役割は、神経微小環境の無血症を維持するために、全身循環と脳との間の非必須イオンおよび有害物質の交換を防止することです。BBBの特徴の一つは、毛細血管内皮細胞が輸送の準細胞経路を効果的に密封するタイトジャンクション(TJ)を形成する能力である。培養hCMEC/D3単層におけるTJバリア形成の明らかな動態を決定する定量的方法としてのLY Pアプリアッセイを実証し?...

血液脳関門(BBB)は、脳組織への血漿成分の流入を制限する保護障壁であり、脳内皮細胞とペリサイトなどの支持細胞からなる。BBBの主な役割は、神経微小環境1、2の血球を維持するために末梢血と中枢神経系(CNS)の間の空間を密封する障壁として機能する。脳毛細血管内皮細胞は、細胞間タイトジャンクション(TJs)1の形成を介して細胞間経路を効果的にシールする。この保護バリアは、ブドウ糖と選択された栄養素が脳に入ることを可能にする一方で、イオン、有毒物質、薬物の大部分がこのタイトな障壁を通過するのを防ぎます。その保護的役割とは別に、BBBの自然なバリア機能は、CNSを標的とする薬物送達システムの開発において深刻な課題を提起する。
BBBのインビトロ細胞培養モデルは、その生物学を研究し、TJバリア完全性に対する薬物治療の影響を理解するのに役立つツールです。ヒト脳内皮細胞株(hCMEC/D3)をインビトロモデルとして用いたのは、ヒト脳内皮3の受け入れモデルであり、ヒトBBBの多くの機能を要約する。hCMEC/D3は、インビトロ4、5、6、7、8、9でBBBをモデリングするための最も一般的に使用される細胞株の一つです。バリア締めの尺度である経体皮電気抵抗(TEER)の比較的低い値にもかかわらず、この細胞株は脳内皮細胞の形態的および機能的特性のほとんどを保持し、共培養グリア細胞6,7.hCMEC/D3細胞株は、不安定な表現型6、7、9に脱分化を受けることなく、約35経過まで、活性トランスポーターおよび受容体を含む複数のBBBマーカーを発現する 、10、11.インビトロBBBモデルとしてのhCMEC/D3細胞株の最も顕著な特徴は、TJs5、9、11、12を形成する能力です。幹細胞由来BBBモデルは、hCMEC/D3細胞株と比較して多くの研究において高い透過性を示し、いくつかのBBBマーカーを発現するが、それらは最も一般的なBBB細胞モデル13としてまだ進化していない。重要なことに、幹細胞由来BBBモデルは、細胞が安定したBBB現象型14を維持することを可能にする最大通過数に関して特徴付けされたままである。
一般的に、TEERの測定、スクロース、イヌリン、ルシファーイエローなどの小さな親水性トレーサー分子の見かけ透過性係数(Pアプリ)の測定を含む、TJバリアの完全性を決定するために一般的に使用されています。クラウディン-5、ZO-1、オクルージン等のTJの既知の分子マーカーの免疫染色等5.TEERは、多孔質膜基板上で培養された細胞単層全体の電気抵抗を測定する比較的単純で定量的な方法5である。しかし、TEER値は培養培地の組成や測定器の種類などの実験変数の影響を受ける可能性があります。これらの因子の組み合わせは、2〜21日間培養されたhCMEC/D3細胞株において、2~1150 Ω cm2までのTEER値の広範な分布につながる。免疫染色は、抗体を用いて標的タンパク質を標識することによりTJタンパク質の存在を決定する視覚的方法である。しかし、免疫染色は、実験的なアーティファクトをもたらす可能性のある細胞を固定/透過する必要性を含む一連の実験ステップを伴い、蛍光シグナルは時間の経過とともに消えてしまいます。上記の要因は、データ品質に影響を与える主観的なエラーにつながる可能性があります。
本研究の主な焦点は、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定するLYベースの明らかな透過性アッセイを提示することである。共培養システム、マイクロ流体システムなどの他の高度なインビトロBBBシステムは、大幅に改善されたバリア機能15、16、17、hCMEC/D3を有する生理学的に関連性の高い模倣であるトランスウェルセットアップは、TJ形成の動態を推定し、バリア機能に対する異なる薬物製剤の効果を迅速にスクリーニングするためのシンプルで信頼性の高いモデルです。一般に、Pアプリ値は、hCMEC/D3単層における様々な親水性溶媒に対して一貫しています。例えば、インビトロBBBモデルにおける様々な低分子量溶質(スクロース、マンニトール、LYなど)に対する報告されたPアプリ値は、10-4 cm/min 5、18、19の順に示されます。,20.我々の実験セットアップでは、脳内皮細胞は、細胞の付着および単層形成のためのコラーゲンコーティングされた微多孔質膜上に播種され、生体内の障壁を模倣する。頂点側に添加されたLYは、細胞間のタイトジャンクションを横断し、側側に蓄積することが期待される。側側のLYの濃度が高いほど、未熟で完全に機能しない障壁を示し、低濃度は成熟した障壁をもたらす機能的なTJの存在による制限された輸送を反映する。
LYは、明確な励起/発光ピークを有する親水性染料であり、スクロース、マンニトールまたはイヌリンなどの放射ラベルトレーサー分子の必要性を回避します。したがって、LYの蛍光値は、BBB単層全体のその準細胞透過性を直接計算するために使用することができる。また、フルオレセイン21などの小さなストークスシフトに苦しむ生物医学分野で使用される多くの市販の染料と比較して、LYのストークスシフトは、十分なスペクトル分離を有する約108nmであり、したがって、LY蛍光データを細胞細胞透過性を決定するための堅牢な読み出し。我々は、培養時間にわたってタイトジャンクションマーカータンパク質ZO-1の発現の変化を実証するために、直交技術としてウェスタンブロッティングを使用した。ウェスタンブロッティングを介して検出されたZO-1式は、LY Pアプリデータを補完するために使用され、組み合わせることで、これらのデータは、LY Pアプリ値の観察された変化が、徐々に増加する単層の形成を反映していることを示唆している。タイトジャンクションマーカー、ZO-1の表現。
先に指摘したように、この研究の中心的な焦点は、機能的なタイトジャンクションを持つコンフルエント単層の形成を監視する簡単な技術としてLYアッセイを実証することです。しかし、開発されたアッセイのさらなる有用性を実証するために、DNAナノ粒子トランスフェクトhCMEC/D3単層におけるLY Pアプリを測定した。核酸は、正に帯電したポリマー群と核酸22の負に帯電したリン酸基との間の静電相互作用を介して、直径100〜200nmのポリ電解質ナノ粒子に凝縮することができる。23.これらの複合体をDNAナノ粒子(DNADNA)と呼んでいます。私たちの意図は、細胞をトランスフェクトし、所望のタンパク質を発現することですが、hCMEC/D3単層のバリア特性が損なわれないようにする必要があります。我々のデータは、標準的な4時間ルシフェラーゼ遺伝子トランスフェクション体制が、TJバリア完全性の変化を決定するためにLY Pアプリアッセイの有用性を実証するLY透過性を測定可能に変化しないことを示唆している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">hCMEC/D3 cell line</td>
			<td style="width:195px;">Cedarlane Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">102114.3C-P25</td>
			<td style="width:172px;">human cerebral microvascular endothelial cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gWizLuc</td>
			<td>Aldevron&#160;</td>
			<td>5000-5001</td>
			<td>Plasmid DNA encoding luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lucifer yellow CH dilithium salt&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>155267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Flat Bottom&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-Well Immuno Plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>437111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-MEM 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1951695</td>
			<td>Spinner-minimum essential medium (S-MEM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I&#160;</td>
			<td>Discovery Labware, Inc.</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Lysis 5X Reagent&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beetle Luciferin, Potassium Salt&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">SpectraMax i3&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Fluorescence Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ZO-1 Polyclonal Antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">61-7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:195px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">ab8245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:545px;">Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td style="width:123px;">128817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">12-well, Flat Bottom</td>
			<td style="width:195px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:123px;">25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">RIPA buffer (5X)</td>
			<td style="width:195px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">J62524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Odyssey CLx imager</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for scanning western blot membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier

血液脳関門BBBは、全身循環と脳の間の障壁を形成する内皮細胞からなる非必須イオンと有毒物質の交換を防ぐ。タイトジャンクション(TJ)は、単層の準細胞空間を効果的にシールし、そのままのバリアを生み出します。本研究では、LYベースの蛍光アッセイを用いて、その明らかな透過性係数(Pアプリ)を決定し、次にコンフルエント単層の形成と得られたタイトジャンクションの動態を決定するために使用することができる。hCMEC/D3単層におけるバリアの完全性。我々はさらに、トランスフェクト細胞におけるTJ機能完全性を決定するために、このアッセイの追加の有用性を実証する。LY Pアプリアッセイからの我々のデータは、トランスウェルセットアップで播種されたhCMEC/D3細胞が効果的にLY細胞輸送7日後培養を制限することを示しています。提示されたアッセイの付加的な有用性として、我々はまた、DNAナノ粒子トランスフェクションがhCMEC/D3単層におけるLY細胞細胞輸送を変化しないことを実証する。

まず、TJ形成の明らかな運動性を決定するために、LY透過性に対する培養時間の効果を決定した。1 日目から 10 ポストシードまでの平均 LY Pアプリの値を図 2aに示します。1日目の平均Pアプリは4.25 x 10-4 cm/minで、2日目は3.32 x 10-4 cm/minにわずかに低下しました。平均Pアプリの値は3日目に3.93 x 10-4 cm/mi...

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Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

我々は、ルシファーイエロー(LY)がヒト血液脳関門のインビトロモデルであるhCMEC/D3細胞単層の明らかな細胞透過性を決定する堅牢なマーカーであることを実証するために蛍光アッセイを提示する。このアッセイを用いて、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定した。

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

このプロトコルは、ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける細胞間タイトな接合の機能的完全性を決定するための堅牢な技術である。これは、より長い運動アッセイを実行するのではなく、より短い期間で見かけの透過性を計算することを可能にする、シンプルでかなり安価なプロトコルです。この方法は、ポリマーDNAナノ粒子をトランスフェクトした脳内皮細胞における密着接合の機能的完全性を決定するためにも使用することができる。細胞メッキを開始するには、微多孔膜を用いた組織培養挿入物を24ウェル培養プレートに入れる。各組織培養インサートに0.15ミリグラムのコラーゲンタイプ1の400マイクロリットルを加えます。その後、摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターで1時間インキュベートします。24ウェルプレートを穏やかに揺らし、組織培養インサート内の微多孔膜上にコラーゲン溶液を均等に広げます。1時間後、コラーゲン溶液を取り出し、0.4ミリリットルの1X PBSバッファーで微多孔膜を静かに洗います。今度は、セルインサートの1平方センチメートルあたり50,000細胞の密度を有するプレートhCMEC/D3細胞。培養器に組織培養を組み込んだ24ウェルプレートを置き、細胞の付着と増殖を可能にします。プレートを7日間インキュベートし、細胞が100%合流に達するようにします。1日おきに成長培地を取り除き、0.5ミリリットルのプリ温めた新鮮な培地を組織培養インサートに移します。ウェスタンブロッティングのめっき処理を繰り返して、DNAナノ粒子トランスフェクションに対するZO-1発現の変化を決定し、ATPアッセイでトランスフェクトされた細胞の細胞生存率を決定します。ルシファーイエローの透視透過性を決定するために、播種後の毎日の日に、成長培地を取り除き、1.5ミリリットルの予熱輸送バッファーをウェルのバソラテラ側に加える。20マイクロモルルルシファーイエロー溶液の58.3マイクロリットルを各トランスウェルインサートのアペカル側に加えます。50マイクロリットルの溶液を、蛍光測定用に保存します。補助側から残留PBSバッファーを完全に除去した後、細胞の乾燥を避けるために、できるだけ早くルシファーイエロー溶液を添加します。アペカル側のルシファーイエロー溶液の正確な容積を確保する。すべての挿入にルシファーイエロー溶液の同じ、正確なボリュームを追加することを確認してください。細胞の乾燥を避けるために迅速に作業します。100 RPM、摂氏37度で細胞を60分間インキュベートします。次に、各尖文コンパートメントからルシファーイエローサンプルの30マイクロリットルを取り除きます。20マイクロモルルルシファーイエロー溶液とアペカル側サンプルを事前ラベルチューブに移します。次に、輸送バッファーを使用してサンプルを 10 倍希釈します。各バソラテラコンパートメントから500マイクロリットルを取り除き、サンプルを事前ラベル付きチューブに移します。標準曲線の一連のルシファーイエロー規格を用意します。黒い96ウェルプレートの各ウェルに、標準的なアペカルサンプルとバソラショナルサンプルの100マイクロリットルを複製します。蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、ルシファーイエロー蛍光強度を測定し、原稿テキストに記載されているように見かけの透過性を計算します。培養時間がルシファーイエロー透過性に及ぼす影響は、密接点形成の見かけの運動学を決定するために用いられた。見かけの透過性値は、初日と比較して7日目に有意に減少し、障壁がきつくなったことを示唆した。その後、見かけの透過率値は10日目まで安定した。これは、バリア形成が完全かつ機能的であることを暗示し、その結果、ルシファーイエローの細胞内輸送が減少した。ウェスタンブロッティングは、時間の経過に伴う密接接合タンパク質ZO-1の発現の変化を検出するために使用された。2 つのバンドは、2 つの ZO-1 アイソフォームを表します。密度測定法の解析では、ZO-1の画素値が3日目から7日目のシード後まで増加し、タイトな接合タンパク質ZO-1が3日目から7日目まで絶えず形成されることを示唆した。7日目の播種後のカルシウム枯渇処理後、ZO-1のバンドはほとんど検出不能であり、カルシウムイオンが存在しない場合にZO-1が形成できなかったことを示す。結果に示すように、ZO−1タンパク質のウェスタンブロッティングは、密接結合タンパク質の発現レベルの変化を決定し、ルシファーイエローベースの機能活性データを補完する。また、ヒト脳内皮細胞における密接点の機能活性は、DNAナノ粒子トランスフェクションの影響を受けないことを発見した。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

大動脈壁における生体力学的ひずみを再現するためのヒト大動脈平滑筋細胞器官チップモデルの構築

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

ラットモデルにおける低強度集束超音波を用いた脊髄バリアの破壊

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...