Name: lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Forfatterne er takknemlige for finansiell støtte fra 2017 New etterforsker Award fra American Association of Pharmacy, en Hunkele fryktede Disease Award fra Duquesne University og School of Pharmacy oppstart midler for Manickam laboratoriet. Vi vil gjerne takke lekkasjen laboratoriet (Duquesne University) for vestlig blotting assistanse og tillater bruk av deres Odyssey 16-bits Imager. Vi vil også gjerne inkludere et spesielt notat av takknemlighet for kandarp Dave (Manickam laboratorium) for hjelp med vestlige blotting.

1. generelt hCMEC/D3 cellekultur
<ol><li>Gjenoppliving av frosne celler Merk: all cellekultur vedlikehold og eksperimenter ble utført i en steril biosafety hette. Kultur Media, kosttilskudd og reagenser ble enten kjøpt som sterile produkter eller sterilisert via filtrering ved hjelp av en 0,22 μm membran filter for å hindre mikrobiell forurensning.<ol>
<li>Tilsett 8,5 mL kollagen oppløsning (0,15 mg/mL) i en vev kultur kolbe (75 cm2 vekstområde; referert heretter som T75) og legg de...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Camos, S., Mallolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+assaying+microvascular+endothelial+cell+pathophysiology+in+stroke.">Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke.</a> Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).</li><li>Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Blood-Brain+Barrier+Models-An+Overview+of+Established+Models+and+New+Microfluidic+Approaches.">In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Ohtsuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+targeted+absolute+proteomic+analysis+of+transporters,+receptors+and+junction+proteins+for+validation+of+human+cerebral+microvascular+endothelial+cell+line+hCMEC/D3+as+a+human+blood-brain+barrier+model.">Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).</li><li>Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+and+Drug+Delivery--In+vitro+Models+of+the+Ischemic+Blood-Brain+Barrier.">Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Llombart, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+secretomes+from+a+human+blood+brain+barrier+endothelial+cells+in-vitro+model+after+ischemia+by+stable+isotope+labeling+with+aminoacids+in+cell+culture+(SILAC).">Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC).</a> Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Avdeef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+can+in+vitro+brain+microcapillary+endothelial+cell+models+predict+rodent+in+vivo+blood-brain+barrier+permeability?.">How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells.">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).</li><li>Shao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+blood-brain+barrier+model+in+a+membrane-based+microchip+for+characterization+of+drug+permeability+and+cytotoxicity+for+drug+screening.">Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening.</a> Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).</li><li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+lab-on-a-chip+tool+for+modeling+biological+barriers.">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+evaluating+drug+transport+across+the+blood&#8211;brain+barrier.">In vitro model for evaluating drug transport across the blood&#8211;brain barrier.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+the+blood&#8211;brain+barrier+in+drug+discovery+and+development.">Modelling of the blood&#8211;brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).</li><li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).</li><li>Deli, M. A., &#193;brah&#225;m, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+Studies+on+In+vitro+Blood&#8211;Brain+Barrier+Models:+Physiology,+Pathology,+and+Pharmacology.">Permeability Studies on In vitro Blood&#8211;Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li><li>Ren, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+General+Method+To+Increase+Stokes+Shift+by+Introducing+Alternating+Vibronic+Structures.">A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Oupick&#253;, D., Kon&#225;k, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+delivery+systems+based+on+complexes+of+DNA+with+synthetic+polycations+and+their+copolymers.">DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers.</a> Journal of Controlled Release. 65, (2000).</li><li>Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).</li><li>Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trans-monolayer+permeability+calculations:+often+forgotten+assumptions.">In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions.</a> research focus reviews. 8, (2003).</li><li>Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li><li>Balda, M. S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+tight+junctions+are+revealed+by+ZO-1+isoforms.">Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms.</a> The American Physiological Society. , (1992).</li><li>Brown, R. C., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Modulation+of+Adherens+and+Tight+Junction+Function:+A+Potential+Mechanism+for+Blood-Brain+Barrier+Disruption+After+Stroke.">Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke.</a> Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).</li><li>Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Ca2++directly+regulates+tight+junctional+permeability+in+the+human+cervical+cell+line+CaSki.">Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).</li><li>Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+lntracellular+Calcium+in+Tight+Junction+Biogenesis.">Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).</li><li>Tobey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).</li><li>Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).</li><li>Posimo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+assays+for+cells+in+culture.">Viability assays for cells in culture.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+transport+as+a+mechanism+of+blood-brain+barrier+disruption+during+stroke.">Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke.</a> Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).</li><li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+surface+properties+on+nanoparticle-mediated+transport+of+drugs+to+the+brain.">Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.</a> Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).</li><li>Markoutsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+permeability+studies+of+BBB-targeting+immunoliposomes+using+the+hCMEC/D3+cell+line.">Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).</li></ol>

En nøkkelrolle BBB er å hindre utveksling av ikke-essensielle ioner og giftige stoffer mellom systemisk sirkulasjon og hjernen for å opprettholde hemostase av nevrale mikromiljøet. En av de karakteristiske trekk ved BBB er evnen til kapillær endothelial cellene til å danne tette veikryss (TJs) som effektivt forsegle paracellular ruten for transport. Vi demonstrerte en LY Papp analysen som en kvantitativ metode for å fastslå den tilsynelatende KINETICS av TJ barriere formasjon i kultivert HCMEC/D3 monol...

Blood-Brain barriere (BBB) er den beskyttende barriere som begrenser tilstrømningen av plasma komponenter inn i hjernevevet og består av hjerne endothelial celler sammen med støtte celler som pericytes. Den viktigste rollen BBB er å tjene som en barriere som sel mellomrommet mellom perifert blod og sentralnervesystemet (CNS) for å opprettholde hemostase av Neural mikromiljøet1,2. Hjernen kapillær endothelial celler effektivt forsegle paracellular veien via dannelse av intercellulære stramme kryss (TJs)1. Denne beskyttende barriere gjør at glukose og utvalgte næringsstoffer å gå inn i hjernen mens den hindrer flertallet av ioner, giftige stoffer og legemidler fra passerer gjennom denne stramme barriere. Bortsett fra sin beskyttende rolle, den naturlige barrierefunksjon av BBB utgjør en alvorlig utfordring i utviklingen av stoffet leveringssystemer rettet mot CNS.
In vitro cellekultur modeller av BBB er nyttige verktøy for å studere sin biologi og å forstå virkningene av narkotikabehandling på TJ barriere integritet. Vi brukte den menneskelige cerebral mikrovaskulær endothelial cellelinje (hCMEC/D3) som en in vitro-modell siden det er en akseptert modell av menneskelig hjerne endotelet3 og viser mange funksjoner av den menneskelige BBB. hCMEC/D3is en av de mest brukte cellelinjer for modellering av BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Til tross for sin forholdsvis lave verdier av transendothelial elektrisk motstand (frivillig), et mål på barriere tetthet, beholder denne cellelinjen de fleste morfologiske og funksjonelle egenskaper av hjernen endothelial celler, selv som en monokultur i fravær av cocultured gliacellene Cells6,7. Den hCMEC/D3 cellelinjen uttrykker flere BBB markører inkludert aktive transportører og reseptorer til ca passasje 35 uten gjennomgår dedifferentiation til ustabil fenotyper6,7,9 ,10,11. Det mest slående karakteristisk for hCMEC/D3 cellelinje som en in vitro BBB-modellen er dens evne til å danne TJs5,9,11,12. Det bør bemerkes at selv om stammen celle-avledet BBB-modeller viste høyere permeabilitet i mange studier sammenlignet med hCMEC/D3 cellelinje og de gjør uttrykke noen BBB markører, de er ennå å utvikle seg som den vanligste BBB celle modell13. Viktigere, stilk-cellen avledet BBB modeller gjenstår å være preget med hensyn til maksimal passasje tall som tillater cellene å opprettholde stabile BBB fenotyper14.
Tre primære metoder er vanligvis brukes til å bestemme TJ barriere integritet, inkludert måling av frivillig, måling av tilsynelatende permeabilitet koeffisient (Papp) av små hydrofile Tracer molekyler som sukrose, inulin, Lucifer Yellow, etc. og immunostaining av kjente molekylære markører av TJs som claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. FRIVILLIG er en relativt enkel og kvantitativ metode som måler den elektriske motstanden over cellen monolagere kultivert på en porøs membran substrat5. Imidlertid kan frivillig verdier bli påvirket av eksperimentelle variabler som sammensetningen av kulturen medium og type måleinstrument. En sannsynlig kombinasjon av disse faktorene fører til en bred fordeling av frivillig verdier som spenner fra 2 til 1150 Ω cm2 i HCMEC/D3 cellelinjen kultivert for 2-21 dager13. Immunostaining er en visuell metode for å bestemme tilstedeværelsen av TJ proteiner ved å merke det målrettede proteinet ved hjelp av antistoffer. Imidlertid innebærer immunostaining en rekke eksperimentelle trinn, inkludert behovet for å fikse/permeabilize celler som kan resultere i eksperimentelle gjenstander og de fluorescerende signalene kan falme over tid. De ovennevnte faktorene kan føre til subjektive feil som påvirker datakvaliteten.
Hovedfokuset i dette arbeidet er å presentere en LY-basert tilsynelatende permeabilitet analysen bestemme Kinetics av en confluent monolag formasjon i kultivert hCMEC/D3 celler. Selv om andre avanserte in vitro BBB-systemer, slik som co-kultur systemer, mikrovæskebasert systemer, er fysiologisk mer relevant etterligner med betydelig forbedret barrierefunksjon15,16,17, hCMEC/D3 transwell oppsett er en enkel og pålitelig modell for å anslå Kinetics av TJ formasjon og raskt skjermen effekten av ulike legemiddel formuleringer på barrierefunksjon. Generelt er P-app -verdiene konsekvente for ulike hydrofile-oppløsninger i HCMEC/D3-monolagere. For eksempel, de rapporterte Papp verdier for ulike lav molekylær masse oppløsninger (som sukrose, mannitol, ly, etc.) i ulike in vitro BBB-modeller er i rekkefølgen av 10-4 cm/min5,18,19 , 20. i vår eksperimentelle oppsett, hjernen endothelial celler er sådd på en kollagen-belagt mikroporøse membran for celle vedlegg og monolag formasjon for å etterligne in vivo barriere. Den LY lagt i apikale side er ventet å krysse intercellulære stramt veikryss og akkumuleres i basolateral side. Større konsentrasjoner av LY i basolateral side indikerer en umoden, ikke-fullt funksjonell barriere mens lavere konsentrasjoner reflekterer begrenset transport på grunn av tilstedeværelsen av funksjonelle TJs resulterer i en moden barriere.
LY er et hydrofile fargestoff med distinkte eksitasjon/utslipps topper og unngår behovet for å radiolabel Tracer molekyler som sukrose, mannitol eller inulin. Dermed kan fluorescens verdiene av LY brukes til å beregne direkte sin paracellular permeabilitet over BBB-monolagere. Også, sammenlignet med mange kommersielt tilgjengelige fargestoffer som brukes i biomedisinsk felt som lider av små Stokes-Skift som fluorescein21, er Stokes-skiftet i LY ca 108 NM med tilstrekkelig Spectral separasjon, og DERMED gir ly fluorescens data som en robust avlesning for å bestemme paracellular permeabilitet. Vi brukte vestlige blotting som en ortogonale teknikk for å demonstrere endringer i uttrykk for den stramme krysset markør protein, ZO-1, over kultur tid. ZO-1-uttrykket som oppdages via vestlig blotting brukes til å supplere data fra LY P-appen og i kombinasjon disse dataene tyder på at de observerte endringene i ly-p-app -verdier gjenspeiler dannelsen av en monolag med gradvis økning i uttrykk for den stramme krysset markør, ZO-1.
Som påpekt tidligere, er det sentrale fokuset i dette arbeidet å demonstrere en LY-analysen som en enkel teknikk for å overvåke dannelsen av en confluent monolag med funksjonell stramt veikryss. Men for å demonstrere en ekstra nytte av den utviklede analysen, målte vi LY Papp i DNA nanopartikkel-transfekterte HCMEC/D3 monolagere. Nukleinsyre syrer kan bli kondensert inn polyelectrolyte nanopartikler med en diameter på 100-200 NM via elektrostatisk interaksjon mellom positivt ladet grupper av polymerer og negativt ladet fosfat grupper av nukleinsyre syrer22, 23. vi refererer til disse KOMPLEKSER som DNA NANOPARTIKLER (DNA NPs) i vårt arbeid. Mens vår intensjon er å transfect celler og uttrykke ønsket protein, må vi sørge for at barriere egenskapene til hCMEC/D3 monolagere ikke er kompromittert. Våre data tyder på at en standard 4 h luciferase gen transfeksjoner regime ikke målbart endre LY permeabilitet demonstrere nytten av LY Papp analysen for å avgjøre endringer i TJ barriere integritet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">hCMEC/D3 cell line</td>
			<td style="width:195px;">Cedarlane Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">102114.3C-P25</td>
			<td style="width:172px;">human cerebral microvascular endothelial cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gWizLuc</td>
			<td>Aldevron&#160;</td>
			<td>5000-5001</td>
			<td>Plasmid DNA encoding luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lucifer yellow CH dilithium salt&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>155267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Flat Bottom&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-Well Immuno Plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>437111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-MEM 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1951695</td>
			<td>Spinner-minimum essential medium (S-MEM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I&#160;</td>
			<td>Discovery Labware, Inc.</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Lysis 5X Reagent&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beetle Luciferin, Potassium Salt&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">SpectraMax i3&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Fluorescence Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ZO-1 Polyclonal Antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">61-7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:195px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">ab8245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:545px;">Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td style="width:123px;">128817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">12-well, Flat Bottom</td>
			<td style="width:195px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:123px;">25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">RIPA buffer (5X)</td>
			<td style="width:195px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">J62524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Odyssey CLx imager</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for scanning western blot membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier

Blod-hjerne barriere BBB består av endothelial celler som danner en barriere mellom systemisk sirkulasjon og hjernen for å hindre utveksling av ikke-essensielle ioner og giftige stoffer. Tette veikryss (TJ) effektivt forsegle paracellular plass i monolagere resulterer i en intakt barriere. Denne studien beskriver en LY-basert fluorescens analysen som kan brukes til å bestemme dens åpenbare permeabilitet koeffisient (Papp) og i sin tur kan brukes til å bestemme Kinetics av dannelsen av confluent monolagere og den resulterende stramt veikryss barriere integritet i hCMEC/D3 monolagere. Vi viser ytterligere en ekstra nytte av denne analysen for å fastslå TJ funksjonell integritet i transfekterte celler. Våre data fra LY Papp analysen viser at HCMEC/D3 cellene seeded i en transwell oppsett effektivt begrense ly paracellular transport 7 dager-post kultur. Som en ekstra nytte av den presenterte analysen, viser vi også at DNA nanopartikkel transfeksjoner ikke endrer LY paracellular transport i hCMEC/D3 monolagere.

Først bestemte vi effekten av dyrking tid på LY permeabilitet å bestemme den tilsynelatende Kinetics av TJ formasjon. Verdiene fra dag 1 til 10-post seeding er vist i figur 2a. På dag 1, var gjennomsnittlig P-app 4,25 x 10-4 cm/min og litt droppet til 3,32 x 10-4 cm/min på dag 2. Gjennomsnittlig P-app -verdi økte litt til 3,93 x 10-4 cm/min på dag 3 og svingt uten vesentlige endringer f?...

Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust paracellular permeabilitet markør i en celle modell av Human Blood-Brain Barrier

Vi presenterer en fluorescens analysen for å demonstrere at Lucifer Yellow (LY) er en robust markør for å fastslå den tilsynelatende paracellular permeabilitet av hCMEC/D3 celle monolagere, en in vitro modell av den menneskelige blod-hjerne-barriere. Vi brukte denne analysen for å bestemme Kinetics av en confluent monolag formasjon i kultivert hCMEC/D3 celler.

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Denne protokollen er en robust teknikk for å bestemme den funksjonelle integriteten til intercellulære tette veikryss i en cellemodell av den menneskelige blod-hjernebarrieren. Dette er en enkel og ganske billig protokoll som gjør det mulig å beregne den tilsynelatende permeabiliteten i en kortere tidsperiode i stedet for å kjøre en lengre kinetisk analyse. Denne metoden kan også brukes til å bestemme den funksjonelle integriteten til stramme veikryss i hjerneendenotelceller transfisert med polymer DNA nanopartikler.For å begynne celleplating, plasser vevskulturinnlegg med mikroporøs membraner i en 24-brønns kulturplate. Tilsett 400 mikroliter på 0,15 milligram per milliliter kollagen type en i hver vev kultur innsats. Deretter inkuber i en time i en 37 grader Celsius, 5% karbondioksid inkubator.Rock den 24-brønns platen forsiktig for å tillate jevn spredning av kollagenoppløsningen over den mikroporøs membranen i vevskulturinnsatsene. Etter en time fjerner du kollagensoppløsningen og vasker forsiktig den mikroporøs membranen med 0,4 milliliter 1X PBS-buffer. Nå, plate hCMEC / D3 celler med en tetthet på 50,000 celler per kvadratcentimeter i cellen setter inn.Plasser 24-brønnsplaten med vevskulturoppsett i inkubatoren for å tillate cellevedlegg og spredning. Inkuber platen i syv dager slik at cellene kan nå 100% samløpet. Fjern vekstmediet annenhver dag og overfør 0,5 milliliter forhåndsoppvarmede friske medier inn i vevskulturinnsatsene.Gjenta plating prosedyren for vestlig blotting for å bestemme endringer i ZO-1 uttrykk for DNA nanopartikkel transfection, og for ATP analyse for å bestemme celle levedyktighet i trans infiserte celler. For å bestemme Lucifer Yellow tilsynelatende permeabilitet, på hver dag etter såing, fjern vekstmediet og legg til 1,5 milliliter forhåndsoppvarmet transportbuffer til basolateral side av brønnen. Legg nå til 58,3 mikroliter med 20 mikromolar Lucifer Yellow-oppløsning til den a apiske siden av hver transbrønninnsats.Spar 50 mikroliter av oppløsningen for fluorescensmålinger. Etter fullstendig fjerning av gjenværende PBS-buffer fra den a apical siden, legg lucifer gul oppløsning så raskt som mulig for å unngå å tørke cellene. Sikre nøyaktige volumer av Lucifer Yellow-oppløsning på den a apiske siden.Pass på at du legger til det samme og nøyaktige volumet av Lucifer Yellow-oppløsningen i alle innsatser. Arbeid raskt for å unngå å tørke cellene. Inkuber cellene i en roterende plate shaker ved 100 RPM og 37 grader Celsius i 60 minutter.Fjern deretter 30 mikroliter av Lucifer Yellow-prøven fra hvert apical rom. Overfør den 20 mikromolar Lucifer Yellow-løsningen og de a apiske sideprøvene til forhåndsmerkede rør. Nå fortynne prøven tidoblet ved hjelp av transportbuffer.Fjern 500 mikroliter fra hvert basolaterale rom, og overfør prøven til forhåndsmerkede rør. Forbered en rekke Lucifer Yellow standarder for standardkurven. Tilsett 100 mikroliter av hver standard apiske og basolaterale prøve til hver brønn av en svart 96-brønnsplate i duplikat.Bruk en fluorescens mikroplateleser til å måle Lucifer Yellow fluorescensintensiteten og beregne den tilsynelatende permeabiliteten, som beskrevet i manuskriptteksten. Effekten av å kultere tid på Lucifer Yellow permeabilitet ble brukt til å bestemme den tilsynelatende kinetikken til tett veikryssdannelse. De tilsynelatende permeabilitetsverdiene gikk betydelig ned på dag sju sammenlignet med dag én, noe som tyder på at barrieren ble strammere.De tilsynelatende permeabilitetsverdiene stabiliserte seg deretter til dag 10. Dette antydet at barriereformasjonen var komplett og funksjonell, noe som resulterte i redusert Lucifer Yellow paracellulær transport. Vestlig blotting ble brukt til å oppdage endringer i uttrykket av det tette koblingsproteinet ZO-1 over tid.De to båndene representerer de to ZO-1 isoformene. Densitometry analyse viste at pikselverdien av ZO-1 økte fra dag tre til syv post-seeding, noe som tyder på at det tette koblingsproteinet ZO-1 dannet kontinuerlig fra dag tre til syv. Etter kalsiumuttømmingsbehandling på dag sju etter såing var båndet av ZO-1 nesten umulig å oppdage, noe som indikerer at ZO-1 ikke var i stand til å danne seg i fravær av kalsiumioner.Som vist i resultatene, kan vestlig blotting av ZO-1 protein utføres for å bestemme endringer i uttrykksnivået av tette koblingsproteiner, som utfyller Lucifer Yellow-baserte funksjonelle aktivitetsdata. Vi oppdaget også at den funksjonelle aktiviteten til trange veikryss i humane hjerneendeotelceller ikke ble påvirket av DNA nanopartikkeltransfeksjon.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeasjon av FITC-lastet Ferritins over en rotte blod-hjerne-barrieren: en modell for å studere den Levering av Nanoformulated Molekyler

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

I Vitro Modell av Human Kutan Hypertrofisk Arrdannelse ved hjelp av makromolekylær trengsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Intravital multifotonmikroskopi i sanntid for å visualisere fokuserte ultralyd- og mikroboblebehandlinger for å øke blod-hjernebarrierens permeabilitet

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Konstruksjon av en human aorta glatt muskelcelle organ-on-a-chip modell for rekapitulere biomekanisk belastning i aortaveggen

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

Forstyrrelse av blod-ryggmargsbarrieren ved bruk av lavintensitetsfokusert ultralyd i en rottemodell

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...