Name: lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Yazarlar, Amerikan Eczacılık Derneği'nin 2017 Yeni Araştırmacı Ödülü, Duquesne Üniversitesi'nden Hunkele Dreaded Disease ödülü ve Manickam laboratuvarı için Eczacılık Fakültesi'nin başlangıç fonlarından gelen mali destek için müteşekkirler. Biz sızıntı laboratuvarı (Duquesne Üniversitesi) batı bloting yardım ve onların Odyssey 16-bit görüntüleyici kullanımına izin için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Batı blotting ile ilgili yardım için Kandarp Dave (Manickam laboratuvarı) için takdir özel bir not eklemek istiyorum.

1.Genel hCMEC/D3 hücre kültürü
<ol><li>Dondurulmuş hücrelerin resüsitasyonu NOT: Tüm hücre kültürü bakım ve deneyleri steril bir biyogüvenlik başlığı içinde yapılmıştır. Kültür ortamı, takviyeleri ve reaktifleri ya steril ürünler olarak satın alındı ya da mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için 0.22 μm membran filtre kullanılarak filtrasyon yoluyla sterilize edildi.<ol>
<li>Bir doku kültürü şişesine 8,5 mL kollajen çözeltisi (0,15mg/mL) ekleyin (75 cm2 <...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Camos, S., Mallolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+assaying+microvascular+endothelial+cell+pathophysiology+in+stroke.">Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke.</a> Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).</li><li>Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Blood-Brain+Barrier+Models-An+Overview+of+Established+Models+and+New+Microfluidic+Approaches.">In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Ohtsuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+targeted+absolute+proteomic+analysis+of+transporters,+receptors+and+junction+proteins+for+validation+of+human+cerebral+microvascular+endothelial+cell+line+hCMEC/D3+as+a+human+blood-brain+barrier+model.">Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).</li><li>Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+and+Drug+Delivery--In+vitro+Models+of+the+Ischemic+Blood-Brain+Barrier.">Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Llombart, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+secretomes+from+a+human+blood+brain+barrier+endothelial+cells+in-vitro+model+after+ischemia+by+stable+isotope+labeling+with+aminoacids+in+cell+culture+(SILAC).">Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC).</a> Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Avdeef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+can+in+vitro+brain+microcapillary+endothelial+cell+models+predict+rodent+in+vivo+blood-brain+barrier+permeability?.">How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).</li><li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+A+systematic+review.">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells.">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).</li><li>Shao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+blood-brain+barrier+model+in+a+membrane-based+microchip+for+characterization+of+drug+permeability+and+cytotoxicity+for+drug+screening.">Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening.</a> Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).</li><li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+lab-on-a-chip+tool+for+modeling+biological+barriers.">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+evaluating+drug+transport+across+the+blood&#8211;brain+barrier.">In vitro model for evaluating drug transport across the blood&#8211;brain barrier.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).</li><li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+the+blood&#8211;brain+barrier+in+drug+discovery+and+development.">Modelling of the blood&#8211;brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).</li><li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).</li><li>Deli, M. A., &#193;brah&#225;m, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+Studies+on+In+vitro+Blood&#8211;Brain+Barrier+Models:+Physiology,+Pathology,+and+Pharmacology.">Permeability Studies on In vitro Blood&#8211;Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li><li>Ren, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+General+Method+To+Increase+Stokes+Shift+by+Introducing+Alternating+Vibronic+Structures.">A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Oupick&#253;, D., Kon&#225;k, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+delivery+systems+based+on+complexes+of+DNA+with+synthetic+polycations+and+their+copolymers.">DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers.</a> Journal of Controlled Release. 65, (2000).</li><li>Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).</li><li>Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trans-monolayer+permeability+calculations:+often+forgotten+assumptions.">In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions.</a> research focus reviews. 8, (2003).</li><li>Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li><li>Balda, M. S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+tight+junctions+are+revealed+by+ZO-1+isoforms.">Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms.</a> The American Physiological Society. , (1992).</li><li>Brown, R. C., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Modulation+of+Adherens+and+Tight+Junction+Function:+A+Potential+Mechanism+for+Blood-Brain+Barrier+Disruption+After+Stroke.">Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke.</a> Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).</li><li>Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Ca2++directly+regulates+tight+junctional+permeability+in+the+human+cervical+cell+line+CaSki.">Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).</li><li>Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+lntracellular+Calcium+in+Tight+Junction+Biogenesis.">Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).</li><li>Tobey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).</li><li>Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium.">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).</li><li>Posimo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+assays+for+cells+in+culture.">Viability assays for cells in culture.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+transport+as+a+mechanism+of+blood-brain+barrier+disruption+during+stroke.">Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke.</a> Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).</li><li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+surface+properties+on+nanoparticle-mediated+transport+of+drugs+to+the+brain.">Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.</a> Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).</li><li>Markoutsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+permeability+studies+of+BBB-targeting+immunoliposomes+using+the+hCMEC/D3+cell+line.">Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).</li></ol>

BBB'nin önemli bir rolü, sinirsel mikroortamın hemostazını korumak için sistemik dolaşım ve beyin arasında gerekli olmayan iyonların ve toksik maddelerin değişimini önlemektir. BBB'nin karakteristik özelliklerinden biri, kapiller endotel hücrelerinin parasellüler taşıma rotasını etkili bir şekilde kapatan sıkı kavşaklar (TJs) oluşturabilme yeteneğidir. Kültürlü hCMEC/D3 monolayers TJ bariyer oluşumunun görünür kinetik belirlemek için nicel bir yöntem olarak bir LY Puygulaması</sub...

Kan-beyin bariyeri (BBB) beyin dokusuna plazma bileşenlerinin akını sınırlayan koruyucu bariyer ve perisitler gibi destekleyici hücreler ile birlikte beyin endotel hücrelerinden oluşur. BBB'nin ana rolü, nöral mikroçevrenin hemostazını korumak için periferik kan ve merkezi sinir sistemi (CNS) arasındaki boşluğu kapatan bir bariyer görevigörmektir. Beyin kapiller endotel hücreleri etkili hücreler arası sıkı kavşakoluşumu yoluyla parasellüler yolu mühür (TJs)1. Bu koruyucu bariyer, glikoz ve seçilmiş besinlerin beyne girmesini sağlarken, iyonların, toksik maddelerin ve ilaçların çoğunun bu sıkı bariyerden geçmesini engeller. Koruyucu rolünün yanı sıra, BBB'nin doğal bariyer işlevi CNS'yi hedef alan ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde ciddi bir sorun teşkil etmektedir.
BBB in vitro hücre kültürü modelleri biyolojisini incelemek ve ilaç tedavisinin TJ bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini anlamak için yararlı araçlardır. İnsan beyin endotel 3'ün kabul edilen bir modeli olduğu ve bbb'nin birçok fonksiyonlarını özetlediğinden, insan serebral mikrovasküler endotel hücre hattını (hCMEC/D3) in vitro model olarak kullandık. hCMEC/D3is bbb in vitro modelleme için en sık kullanılan hücre hatlarından biridir4,5,6,7,8,9. Bariyer sıkılığının bir ölçüsü olan transendotel elektrikdirencinin (TEER) nispeten düşük değerlerine rağmen, bu hücre hattı beyin endotel hücrelerinin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin çoğunu korur. cokültürd glial hücreler6,7. hCMEC/D3 hücre hattı, kararsız fenotiplere defarklılaşma geçirmeden yaklaşık 35 geçişine kadar aktif taşıyıcılar ve reseptörler de dahil olmak üzere birden fazla BBB belirteçlerini ifade eder6,7,9 ,10,11. Bir in vitro BBB modeli olarak hCMEC/D3 hücre hattının en çarpıcıözelliği TJs 5,9,11,12oluşturmak için yeteneğidir. Kök hücre kaynaklı BBB modellerinin hCMEC/D3 hücre hattı ile karşılaştırıldığında birçok çalışmada daha yüksek geçirgenlik gösterdiği ve bazı BBB belirteçlerini ifade ettikleri unutulmamalıdır, ancak en yaygın BBB hücre modeli13olarak gelişmemiştir. Daha da önemlisi, kök hücre türetilmiş BBB modelleri hücrelerin kararlı BBB fenotipleri korumakiçin izin maksimum geçiş sayıları ile ilgili olarak karakterize olmaya devam 14 .
Teer ölçümü, sakaroz, inulin, Lucifer Sarı gibi küçük hidrofilik tracermoleküllerinin görünür geçirgenlik katsayısının (P uygulaması) ölçümü de dahil olmak üzere TJ bariyer bütünlüğünü belirlemek için üç ana yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. vb. ve claudin-5, ZO-1, oklüdin, vb5gibi TJs bilinen moleküler belirteçleri immunostaining . TEER, gözenekli membran substrat5üzerinde kültürlenmiş hücre monolayers arasındaki elektrikdirencini ölçen nispeten basit ve nicel bir yöntemdir. Ancak TEER değerleri, kültür ortamının bileşimi ve ölçüm aletinin türü gibi deneysel değişkenlerden etkilenebilir. Bu faktörlerin olası bir kombinasyonu, hCMEC/D3 hücre hattında 2-21 gün 13'te 2 ila 1150 Ωcm2 arasında değişen TEER değerlerinin geniş bir dağılımına yol açar. İmmünoboyama, hedeflenen proteini antikorlar kullanarak etiketleyerek TJ proteinlerinin varlığını belirlemek için kullanılan görsel bir yöntemdir. Ancak, immünboyama deneysel eserler ve floresan sinyalleri zaman içinde kaybolabilir neden olabilir hücreleri düzeltmek / permeabilize ihtiyacı da dahil olmak üzere deneysel adımlar, bir dizi içerir. Yukarıdaki etkenler veri kalitesini etkileyen öznel hatalara yol açabilir.
Bu çalışmanın temel odak noktası, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde enfluent monolayer oluşumunun kinetiklerini belirleyen LY tabanlı belirgin geçirgenlik testini sunmaktır. Co-kültür sistemleri, mikroakışkan sistemler gibi diğer gelişmiş in vitro BBB sistemleri, fizyolojik olarak daha uygun mimikler önemli ölçüde geliştirilmiş bariyer fonksiyonu15,16,17, hCMEC/D3 ile transwell kurulumu, TJ oluşumunun kinetiklerini tahmin etmek ve farklı ilaç formülasyonlarının bariyer fonksiyonu üzerindeki etkisini hızla taramak için basit ve güvenilir bir modeldir. Genel olarak, Puygulama değerleri hCMEC/D3 monokatmanlarında çeşitli hidrofilik soluteler için tutarlıdır. Örneğin, farklı in vitro BBB modellerinde çeşitli düşük moleküler kütleli soluteler (sakaroz, mannitol, LY, vb. gibi) için bildirilen Puygulama değerleri 10-4 cm/dk5,18,19 , 20- Deneysel kurulumumuzda beyin endotel hücreleri in vivo bariyerini taklit etmek için hücre eki ve monolayer oluşumu için kollajen kaplı mikrogözenekli membran üzerine seri olarak eklenir. Apikal tarafa eklenen LY'nin hücreler arası sıkı kavşaklardan geçmesi ve basolateral tarafta birikmesi beklenmektedir. Basolateral tarafta ki LY konsantrasyonlarının daha fazla olması olgunlaşmamış, tam olarak işlevsel olmayan bir bariyeri gösterirken, daha düşük konsantrasyonlar olgun bir bariyerle sonuçlanan fonksiyonel TJ'lerin varlığı nedeniyle sınırlı taşımayı yansıtır.
LY farklı uyarma / emisyon zirveleri ile bir hidrofilik boya ve sakaroz, mannitol veya inulin gibi radyolabel tracer molekülleri ihtiyacını önler. Böylece LY'nin floresan değerleri, BBB monokatmanları arasında parasellüler geçirgenliğini doğrudan hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, floresan21gibi küçük Stokes vardiya muzdarip biyomedikal alanlarda kullanılan birçok ticari boyaile karşılaştırıldığında, LY Stokes kayması yeterli spektral ayırma ile yaklaşık 108 nm, böylece LY floresan veri olarak izin parasellüler geçirgenliği belirlemek için sağlam okuma. Biz sıkı kavşak marker protein, ZO-1, kültür zaman içinde ifade değişiklikleri göstermek için bir ortogonal teknik olarak Batı lekeleme kullanılır. Batı lekeleme yoluyla saptanan ZO-1 ekspresyonu LY Puygulama verilerini tamamlamak için kullanılır ve bu veriler LY Puygulama değerlerinde gözlenen değişikliklerin kademeli olarak sıkı kavşak işareti, ZO-1 ifadesi.
Daha önce de belirtildiği gibi, bu çalışmanın odak noktası, fonksiyonel sıkı kavşaklara sahip bir tek tabakanın oluşumunu izlemek için basit bir teknik olarak LY tözünü göstermektir. Ancak, geliştirilen testin ek bir faydasını göstermek için, LY Puygulamasını DNA nanopartikül enine hCMEC/D3 monolayers cinsinden ölçtük. Nükleik asitler polimerlerin pozitif yüklü grupları ve nükleik asitlerin negatif yüklü fosfat grupları arasında elektrostatik etkileşim yoluyla 100-200 nm çapında polielektrolit nano tanecikleri içine yoğunlaşmış olabilir22, 23. Bu kompleksleri çalışmamızda DNA nano tanecikleri (DNA NPs) olarak adlandırıyoruz. Amacımız hücreleri transfect ve istenilen proteinifade etmek iken, biz hCMEC / D3 monolayers bariyer özellikleri ödün olmadığından emin olmalısınız. Verilerimiz, standart 4 saat luciferase gen transfeksiyon rejiminin, LY P uygulamasının yararını gösteren LY geçirgenliğini, TJ bariyer bütünlüğündeki değişiklikleri belirlemek için ölçülebilir bir şekilde değiştirmediğini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">hCMEC/D3 cell line</td>
			<td style="width:195px;">Cedarlane Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">102114.3C-P25</td>
			<td style="width:172px;">human cerebral microvascular endothelial cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gWizLuc</td>
			<td>Aldevron&#160;</td>
			<td>5000-5001</td>
			<td>Plasmid DNA encoding luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lucifer yellow CH dilithium salt&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>155267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Flat Bottom&#160;</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-Well Immuno Plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>437111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-MEM 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1951695</td>
			<td>Spinner-minimum essential medium (S-MEM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBM-2</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I&#160;</td>
			<td>Discovery Labware, Inc.</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Lysis 5X Reagent&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beetle Luciferin, Potassium Salt&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">SpectraMax i3&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Fluorescence Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">ZO-1 Polyclonal Antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">61-7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:195px;">abcam</td>
			<td style="width:123px;">ab8245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:545px;">Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td style="width:123px;">128817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">12-well, Flat Bottom</td>
			<td style="width:195px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:123px;">25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">RIPA buffer (5X)</td>
			<td style="width:195px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">J62524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:545px;">Odyssey CLx imager</td>
			<td style="width:195px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for scanning western blot membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lucifer yellow - a robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier

Kan-beyin bariyeri BBB, gerekli olmayan iyonlar ve toksik maddelerin değişimini önlemek için sistemik dolaşım ve beyin arasında bir bariyer oluşturan endotel hücrelerinden oluşur. Sıkı kavşaklar (TJ) etkili bir bozulmamış bariyer sonuçlanan monolayers parasellüler alanı mühür. Bu çalışmada, görünür geçirgenlik katsayısını (P uygulaması) belirlemek için kullanılabilen LYtabanlı floresan titreci açıklanır ve buna karşılık konjenital monolayers oluşumunun kinetik ve ortaya çıkan sıkı kavşak hCMEC/D3 monokatmanlarında bariyer bütünlüğü. Transfected hücrelerde TJ fonksiyonel bütünlüğünü belirlemek için bu tispatın ek bir yararını da gösteriyoruz. LY Puygulama analizinden elde edilen veriler, transwell kurulumunda tohumlanan hCMEC/D3 hücrelerinin LY parasellüler taşımayı 7 gün sonra kültürünü etkili bir şekilde sınırladığını göstermektedir. Sunulan çıktının ek bir faydası olarak, DNA nanopartikül transfeksiyonunun hCMEC/D3 monokatmanlarında LY parasellüler aktarımını değiştirmediğini de gösteriyoruz.

İlk olarak, TJ oluşumunun görünür kinetiklerini belirlemek için zaman diliminin LY geçirgenliği üzerindeki etkisini belirledik. 1. günden 10'a kadar olan ortalama LY Puygulama değerleri Şekil 2a'dagösterilmiştir. 1. günde, ortalama Puygulaması 4.25 x 10-4 cm/dk idi ve 2. Ortalama Puygulama değeri 3. Puygulama değerleri, 7. Puygulama değerle...

Watch this Scientific Journal Video about Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

Biz Lucifer Sarı (LY) hCMEC / D3 hücre monolayers, insan kan-beyin bariyerinin bir in vitro modeli görünür parasellüler geçirgenlik belirlemek için sağlam bir belirteç olduğunu göstermek için bir floresan tahlili salıyoruz. Bu analizi, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde etkili bir monolayer oluşumunun kinetiklerini belirlemek için kullandık.

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Bu protokol, insan kan-beyin bariyerinin bir hücre modelinde hücreler arası sıkı kavşakların işlevsel bütünlüğünü belirlemek için sağlam bir tekniktir. Bu daha uzun bir kinetik tsömede çalışan yerine daha kısa bir süre içinde görünür geçirgenlik hesaplanmasısağlayan basit ve oldukça ucuz bir protokoldür. Bu yöntem aynı zamanda polimer DNA nano tanecikleri ile transfected beyin endotel hücrelerinde sıkı kavşakların fonksiyonel bütünlüğünü belirlemek için kullanılabilir.Hücre kaplamasına başlamak için, 24 kuyulu bir kültür plakası içine mikro gözenekli membranlar ile doku kültürü ekler yerleştirin. Her doku kültürü eklemek 0.15 miligram-mililitre başına kollajen tip bir 400 mikrolitre ekleyin. Sonra 37 derece santigrat, %5 karbondioksit kuvözde bir saat kuluçkaya yat.Doku kültürü ekler mikro gözenekli membran üzerinde kollajen çözeltisi bile yayılmasını sağlamak için 24-iyi plaka yavaşça rock. Bir saat sonra, kollajen çözeltisini çıkarın ve mikro gözenekli membranı 0,4 mililitre 1X PBS tamponuyla nazikçe yıkayın. Şimdi, plaka hCMEC/D3 hücreleri yoğunluğu 50, 000 hücre kare başına hücre ekler.Hücre bağlanmasıve çoğalması için 24 kuyulu plakayı kuvöze doku kültürü kurulumu ile yerleştirin. Hücrelerin %100 biraraya gelmesi için tabağı yedi gün kuluçkaya yatırın. Her gün büyüme ortamını çıkarın ve 0,5 mililitre önceden ısıtılmış taze medyayı doku kültürü uçlarına aktarın.DNA nanopartikül transfeksiyonu için ZO-1 ekspresyonundaki değişiklikleri belirlemek ve transfected hücrelerde hücre canlılığını belirlemek için ATP testi için Batı lekeleme için kaplama prosedürünü tekrarlayın. Lucifer Sarı belirgin geçirgenliği belirlemek için, her gün tohumlama sonrası, büyüme ortamı kaldırmak ve kuyunun bazolateral tarafına önceden ısıtılmış taşıma tampon 1.5 mililitre ekleyin. Şimdi her trans-iyi eklemek apikal tarafına 20 mikromolar Lucifer Sarı çözelti 58,3 mikrolitre ekleyin.Floresan ölçümleri için çözeltinin 50 mikrolitresini saklayın. Apikal taraftan artık PBS tampon tamamen çıkardıktan sonra, hücreleri kurutmaönlemek için mümkün olduğunca çabuk Lucifer Sarı çözüm ekleyin. Apikal tarafta Lucifer Sarı çözeltisinin doğru hacimlerini sağlayın.Tüm eklere Lucifer Yellow çözeltisinin aynı ve doğru hacmini eklediğinizden emin olun. Hücrelerin kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. Hücreleri 100 RPM ve 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca bir döner plaka shaker'da kuluçkaya yatırın.Daha sonra her apikal bölmeden Lucifer Sarı örnek 30 mikrolitre çıkarın. 20 mikromolar Lucifer Sarı çözeltisini ve apikal yan numuneleri önceden etiketlenmiş tüplere aktarın. Şimdi taşıma tamponkullanarak örnek on kat seyreltin.Her bazolateral bölmeden 500 mikrolitre çıkarın ve numuneyi önceden etiketlenmiş tüplere aktarın. Standart eğri için bir dizi Lucifer Sarı standardı hazırlayın. Yinelenen siyah 96 kuyulu plakanın her kuyuya her standart apikal ve bazolateral numuneden 100 mikrolitre ekleyin.Lucifer Sarı floresan yoğunluğunu ölçmek ve el yazması metinde açıklandığı gibi görünür geçirgenliği hesaplamak için bir floresan mikroplaka okuyucu kullanın. Sıkı kavşak oluşumunun görünür kinetiklerini belirlemek için Lucifer Sarı geçirgenliği üzerindeki kültatifzamanın etkisi kullanılmıştır. Görünen geçirgenlik değerleri ilk güne kıyasla yedinci günde önemli ölçüde azaldı, bu da bariyerin daha sıkı hale geldiğini düşündürüyor.Görünen geçirgenlik değerleri daha sonra 10 güne kadar stabilize. Bu bariyer oluşumu tam ve fonksiyonel olduğunu ima, azalmış Lucifer Sarı parasellüler taşıma ile sonuçlanan. Batı lekeleme zaman içinde sıkı kavşak proteini ZO-1 ifadesinde değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır.İki grup iki ZO-1 İzoformtemsil eder. Densitometri analizi ZO-1 piksel değerinin üç günden yedi tohumlama sonrası güne kadar arttığını ortaya çıkararak, sıkı kavşak proteini ZO-1'in üç günden yedi güne kadar sürekli olarak oluştuğunu düşündürmektedir. Tohumlamasonrası yedinci günde kalsiyum tükenmesi tedavisinden sonra ZO-1 bandı neredeyse tespit edileemedi ve bu da ZO-1'in kalsiyum iyonlarının yokluğunda oluşamadığını gösteriyordu.Sonuçlarda gösterildiği gibi, Sıkı kavşak proteinlerinin ifade düzeyindeki değişiklikleri belirlemek için ZO-1 proteininin Batı'da blotlanması, Lucifer Sarı tabanlı fonksiyonel aktivite verilerini tamamlayarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca insan beyin endotel hücrelerinde sıkı kavşakların fonksiyonel aktivitesinin DNA nanopartikül transfeksiyonundan etkilenmediğini keşfettik.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Kan-Beyin Bariyer Geçirgenliğini Artırmak için Odaklanmış Ultrason ve Mikrobubble Tedavilerini Görselleştirmek için Gerçek Zamanlı Intravital Multifotoğraf Mikroskopisi

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Aort Duvarındaki Biyomekanik Suşu Özetlemek İçin İnsan Aort Düz Kas Hücresi Organ-On-A-Chip Modelinin Yapımı

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

Bir sıçan modelinde düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason kullanılarak kan-omurilik bariyerinin bozulması

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...