Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل "آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ" (2018_A03 إلى TR)، "مبتكرة Medizinische Forschung (صندوق النقد الدولي) مونستر" (I-RU211811 إلى TR) ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG أنست 2105/27-1، لي 3283/5-1 ولي 3283/6-1 إلى SGM). الصور مصورة قدمتها هايك بلوم.

جميع التجارب على الحيوانات كانت معتمدة من قبل السلطات المحلية وتجري وفقا للقانون الألماني الرفق بالحيوان (84-02.05.20.13.097).
الملاحظات العامة على التجارب على الحيوانات
<ol><li>إجراء جميع التجارب الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية الخاصة بكل منها واستخدام اللجن...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

خلايا بطانية microvascular توفر وظائف الحاجز في جميع الأنسجة ونتائجها اختلال وظيفي في المرض من الأجهزة المرتبطة بها 3. وعلاوة على ذلك، الدراسات الخاصة بالجهاز للجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار قد يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، فهم أعمق للدالة EC ميكروفاسكولار تحت الظ?...

عبر مجرى الدم والخلايا والأجهزة مزودة بالأكسجين وركائز والجزيئات الضرورية الأخرى. ويجري هذا التبادل في الشعيرات الدموية، سفن أصغر. الشعيرات الدموية تتشكل من طبقة خلايا بطانية داخلية (EC) سلامتها يظل شرطا أساسيا للتنظيم الناجح للعضلات التوازن بين المساحة داخل الأوعية والمتداخلة. لضمان انتقال انتقائية من العوامل القابلة للذوبان والخلايا، تشكل الجماعة الأوروبية أحادي الطبقة مترابطة بضيق و تقاطعات أدهيرينس 1. وإلى جانب دورها كحاجز للمواد الغذائية أو المنتجات الأيضية، تنظيم المفوضية الأوروبية تجنيد الكريات البيضاء في عمليات الالتهابات. أضرار التهاب أو الأنسجة يؤدي إلى أعلى لائحة جزيئات الالتصاق على السطح EC وإنتاج المستقطبات تيسير مرفق الكريات البيض والتهجير في الأنسجة المستهدفة 2. ونتيجة لذلك، تشارك المفوضية الأوروبية حاسمة في تنظيم عمليات تحريضية مثل الدفاع ضد العوامل الممرضة أو إصلاح الأنسجة.
خلل من المفوضية الأوروبية مباشرة المرتبطة بأمراض الأوعية الدموية والفشل الكلوي المزمن وتجلط وريدي مسببات المرض شديد العدوى. وعلاوة على ذلك، تشارك المفوضية الأوروبية تقريبا دائماً في الخاصة بجهاز المناعة الذاتية مثل السكري أو التصلب المتعدد 3. وظيفة الحاجز بين مجرى الدم والأجهزة ولذلك تسيطر تفاعل متضافرة من أنواع مختلفة من الخلايا. في الهيكل العظمى والعضلات microvascular غشائي الخلايا (مك) جنبا إلى جنب مع خلايا العضلات، الليفية وبيريسيتيس تشكل وحدة وظيفية، ووحدة "ميوفاسكولار" (مفو). ولذلك، اختلال وظيفي مفو قد دور حاسم في الفسيولوجيا المرضية ميوباثيس. ومع ذلك، فهم أعمق لهذه الآليات التنظيمية لا يزال مفقوداً وحاليا يحول دون تحديد أهداف جديدة، وهناك حاجة ماسة إليها، والعلاجية في ميوباثيس.
للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية المعقدة، ويشيع استخدام نماذج حيوانية. ومع ذلك، ميزة نماذج في المختبر التركيز على هذا موضوع اهتمام باستثناء مجموعة متنوعة من العوامل المؤثرة الأخرى. للتحقيق في العمليات في المختبر من الضروري عزل الخلايا الابتدائية نقية وقابلة للحياة. وعلى النقيض من خطوط الخلايا، تمكين الخلايا الأولية المعزولة من الحيوانات المحورة وراثيا بالتحقيق في آثار التعديلات الوراثية في المختبر.
هنا، يتم وصف طريقة لعزل مك مورين الأولية باستخدام التفكك الميكانيكية والانزيميه متبوعاً بخلية تنشيط مغنطيسية الفرز تقنيات (MCS) لتنقية. وتستخدم لهذا الغرض، حبات مغناطيسية ضد علامات سطح معين. الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء-1 (PECAM1, CD31) هو أساسا عن المفوضية الأوروبية ويمكن استخدامها لإثراء هذا النوع الخلية. لتبرير خلية عالية النقاء، مستبعدة خلايا المنشأ المكونة للدم بتحديد سلبي لبروتين تيروزين الفوسفاتيز مستقبلات نوع ج (بتبرك، CD45). علاوة على ذلك، يتم عرض عمليات مراقبة الجودة، وزراعة مك مورين الأولية، والتطبيقات المحتملة والقيود، فضلا عن اعتبارات خاصة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

خلايا بطانية للهيكل العظمى والعضلات الشعيرات الدموية (العضلات خلايا بطانية ميكروفاسكولار، مك) بناء الحاجز بين مجرى الدم وعضلات الهيكل العظمى التي تنظم تبادل السوائل والمواد الغذائية، فضلا عن الاستجابة المناعية ضد المعدية وكلاء بمراقبة الهجرة الخلية المناعية. لأداء هذه المهام، تشكل مك وظيفية "وحدة ميوفاسكولار" (مفو)، مع زيادة أنواع الخلايا، مثل الخلايا الليفية، وبيريسيتيس، وخلايا الهيكل العظمى والعضلات. ونتيجة لذلك، يسهم خلل وظيفي مك ومن ثم مفو مجموعة متنوعة واسعة من ميوباثيس. ومع ذلك، آليات تنظيمية من مك في الصحة والمرض تظل مفهومة غير كاف وعلى توضيح تسبق علاجات أكثر تحديداً ميوباثيس. عزلة والتحقيق المتعمق في وظائف مك الأولية في سياق مفو قد تيسر فهم أفضل لهذه العمليات.
توفر هذه المقالة بروتوكول لعزل مك مورين الأولية من الهيكل العظمى والعضلات بالتفكك الميكانيكية والانزيميه بما في ذلك تنقية وخطوات الحفاظ على الثقافة.

يوم واحد بعد عزلة، مك مورين الأولية وبقايا الخلايا الأخرى تشكيل التكتلات والتقيد بالجزء السفلي من ثقافة الأطباق (اليوم 1 منالشكل 1A ). من يوم 7، يمكن ملاحظة خلايا مسطحة وممدود. ومع ذلك، لا تزال واضحة تلوث أخرى، معظمها خلايا كروي، (الشكل 1A يوم ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Microvascular خلايا بطانية لعضلات الهيكل العظمى (مك) شكل الجدار الداخلي للعضلات الشعيرات الدموية وتنظم على حد سواء، تبادل السوائل/الجزيئات والهجرة من الخلايا (المناعية) بين أنسجة العضلات والدم. عزل مك مورين الأولية، كما هو موضح هنا، يتيح إجراء تحقيقات شاملة في المختبر لوحدة "ميوفاسكولار".

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

يصف هذا البروتوكول تقنية منصة لعزل الخلايا البطانية الدقيقة من العضلات العظمية. يمكن استخدام هذه الخلايا، على سبيل المثال، للحصول على مزيد من الرؤى في وظائف حاجز عضلة الدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الموجودة هي أنه من الممكن عزل الخلايا البطانية الدقيقة الأولية ذات النقاوة العالية.هذه التقنية يمكن أن تساعد على الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض العضلات التي تتوسطها المناعة مثل التفاعل بين العضلات والخلايا البطانية في الصحة والمرض. أولاً، إعداد جميع الحلول اللازمة ولوحات الستة الآبار كما هو موضح في البروتوكول. لبدء الإجراء العملي، والحصول على زوج من مقص حاد / حادة الجراحية، وزوج من مقص حاد / حاد الجراحية، والملقط مستقيم ومنحني.تطهير جميع الأدوات الجراحية مع 70٪ الإيثانول. وضع فأر ذكر بالغ القتل الرحيم على ظهره وترطيب الساقين مع 70٪ الإيثانول. باستخدام مقص حاد / حادة الجراحية، وقطع كل ساق كاملة عن طريق قطع في مفصل الورك.ضع الأطراف في طبق ثقافة الخلية المغلقة. نقل الطبق إلى غطاء تدفق لارينار العقيمة. استخدم مقصًا حادًا وملقطًا منحنيًا لقطع الجلد من الورك إلى طرف إصبع الظهر.استخدام ملقط مستقيم لعقد القدم أو القدم وسادة أثناء استخدام ملقط منحني لقشر الجلد من القدم إلى الورك. لعزل العضلات رباعية الفخذ، وقطع وتر من الركبة، وقطع العضلات على طول عظم الفخذ إلى الورك. قطع وتر أخيل لعزل surae العضلة الثلاثية.المقبل، وقطع على طول الساق إلى فوسا popliteal وإزالة العضلات. لإزالة الأوتار التي لا يمكن فصلها، عقد العضلات مع ملقط منحنية وقطع كل وتر المناسبة. إضافة 2، 445 ميكرولترات من حل الهضم المعدة إلى الطازجة، وصفت طبق ثقافة الخلية وتحديد الوزن.نقل كل من القطع العضلية لهذا الطبق. ثم، تحديد الوزن. الفرق بين القيم المقاسة على حد سواء يوفر الوزن الجاف للأنسجة العضلية التي يجب ألا تتجاوز غرام واحد.باستخدام مقص حاد الجراحية، وقطع الأنسجة العضلية كلها إلى قطع صغيرة. احتضان تعليق الأنسجة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 1.5 ساعة، مع التأكد من خلط التعليق بعناية مع حقنة الأنسولين ملليلتر واحد كل 20 دقيقة لمدة خمس دقائق تقريبا. بعد الحضانة، نقل التعليق إلى مصفاة نايلون 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب 50 ملليلتر المسمى وجمع تدفق من خلال.غسل مصفاة الخلية مع ثمانية ملليلتر من DMEM وجمع من خلال تدفق. إذا كانت القطع هي سد مصفاة، resuspend الحل المنفصلة. تخلص من مصفاة الخلية والطرد المركزي التعليق في 300 مرة الجاذبية وعند 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.إزالة بعناية عظمى وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من كلوريد البوتاسيوم الأمونيوم lysing العازلة لتحلل من خلايا الدم الحمراء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. ثم، إضافة تسعة ملليلتر من DMEM تحتوي على 10٪ FCS لوقف رد الفعل.نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم، استخدم غرفة جرد خلية Neubauer لتحديد أرقام الخلايا. للبدء في استنزاف الخلايا إيجابية CD45، الطرد المركزي تعليق في 300 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.إزالة supernatant تماما وإعادة ربط بيليه الخلية في 90 ميكرولترات من العازلة MCS. إضافة 10 ميكروليتر من الميكروبات CD45 وخلط التعليق. احتضان في ثلاجة في أربع إلى ثماني درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت MCS. جهاز طرد مركزي في 300 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة عظمى تماما وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من العازلة MCS.ضع عمود مغناطيسي كبير في المجال المغناطيسي للفاصل. شطف خزان العمود مع ثلاثة ملليلترات من العازلة MCS. ثم، ضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر أسفل العمود لجمع التدفق من خلال.تطبيق تعليق الخلية بأكملها إلى العمود والسماح لها من خلال تدفق تماما. اغسل العمود ثلاث مرات عن طريق إضافة ثلاثة ملليلترات من العازلة MCS في الخزان لكل خطوة الغسيل والانتظار حتى خزان العمود فارغة قبل البدء في الخطوة الغسيل التالية. جمع الخلايا غير التي تم تصنيفها التي تمر عبر العمود لاستخدامها في خطوات فصل إضافية.لبدء تراكم الخلايا إيجابية CD31، استخدم غرفة العد خلية Neubauer لتحديد أرقام الخلايا. وبعد ذلك، تعمل أجهزة الطرد المركزي على الخلايا غير المُوَجَّهة بجاذبية 300 مرة وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant تماما وإعادة فرض بيليه في 90 ميكرولترات من العازلة MCS.إضافة 10 ميكروليتر من الميكروبات CD31 وخلط التعليق كله. احتضان في ثلاجة في أربع إلى ثماني درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد هذا، يضاف ملليلتر واحد من العازلة MCS والطرد المركزي في 300 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من العازلة MCS. ضع العمود المغناطيسي المتوسط في المجال المغناطيسي للفاصل. شطف العمود مع 500 ميكروليترس من العازلة MCS.بعد ذلك، ضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر أسفل العمود لجمع التدفق من خلال. تطبيق تعليق الخلية بالكامل على العمود والسماح لها تدفق تماما من خلال. اغسل العمود ثلاث مرات عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من العازلة MCS في الخزان لكل خطوة الغسيل، وانتظر حتى خزان العمود فارغة قبل البدء في الخطوة الغسيل التالية.تمثل الخلايا غير التي تم تصنيفها التي تمر بالعمود الكسر CD45 سالب، و CD31 سالب. تخزينها لمزيد من عناصر التحكم في الجودة. ثم، قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب جمع مناسبة.Pipette ملليلتر اثنين من المخزن المؤقت MCS على العمود. دفع فورا المكبس في العمود لطرد الخلايا المغناطيسي المسمى. يمثل هذا الكسر CD45 سالب، و CD31-positive، الـ يورين ECs الأساسي المخصب.جهاز طرد مركزي تعليق الخلية في 350 مرة الجاذبية و 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى تماما وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط الخلية البطانية. نقل الخلايا إلى بئر واحد من لوحة ثقافة ستة جيدا المغلفة التي تحتوي على ملليلتر واحد من متوسطة الخلية البطانية.للزراعة، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة معقمة، مع التأكد من تحديث المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام. عندما تكون الخلايا في 80 إلى 90٪ التقاء، شطف كل خلايا تحتوي على البئر مرتين مع مليلتر من برنامج تلفزيوني في خطوتين متتاليتين الغسيل. ثم، إضافة 800 ميكرولترات من محلول تريبسين EDTA إلى كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة عقيمة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.بعد هذا، إضافة 1، 200 ميكرولترات من DMEM تحتوي على ما لا يقل عن 10٪ FCS لوقف النشاط الأنزيمي. جهاز طرد مركزي في 350 مرة الجاذبية و 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، تتراكم خلايا CD31 كما وصفت سابقا لزيادة النقاء.استخدام حقل مشرق أو مرحلة قياسية المجهر العقد مع 20٪ التكبير والعدسة 0.35 فتحة رقمية لمراقبة التقاء الخلية. في هذه الدراسة، يتم عزل الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة في العضلات العظمية الأولية. بعد يوم واحد من العزلة، تشكل مراكز الـ MMECs الأولية والخلايا الأخرى المتبقية تكتلات وتلتزم بأسفل أطباق الثقافة.من اليوم السابع فصاعدا، يمكن ملاحظة الخلايا المسطحة والممدود، ومع ذلك، تلوث الخلايا الأخرى، ومعظمهم من الخلايا الشعاعية لا يزال مرئيا. وبالتالي ، مطلوب دورة أخرى من CD31 إيجابية الاختيار عبر MCS. وبعد ذلك، تتكاثر مراكز الـMMECs الأولية إلى كثافة تبلغ حوالي 80 إلى 90٪ عند التقاءها، وعادة ما تشكل طبقة أحادية غير متداخلة من الخلايا المنحازة طولياً.ويتوقف الانتشار عند التقاء المنتَط بسبب تثبيط الاتصال. مراقبة الجودة عن طريق تدفق القياسات يظهر قيم لكل من البقاء والنقاء تتراوح بين حوالي 70٪ لكل من الخلايا مباشرة بعد العزل. تظهر الخلايا المزروعة بعد اختيار آخر إيجابي CD31 عبر MCS قيم مرضية للنقاء وكذلك لصلاحية البقاء ، تتراوح إلى 95 ٪ لكل من.ثم يتم التحقيق في الخلايا التي تم الحصول عليها للتعبير الجيني لـ Muscle satellite cell علامة الجينات يقترن البروتين مربع 7 وM-cadherin على مستوى مرنا بواسطة كمية PCR. كما هو متوقع، فقط CD45-سالبة، CD31-السلبية الكسر وكذلك الخلايا العضلية المورين الأولية المتباينة أعرب عن البروتين مربع 7 وM-cadherin، في حين CD45-سالبة، CD31-positive وMMECs المورين الأولية هي سلبية لهذه العلامات. بعد الخطوة الثانية CD31 MCS، يتم استخدام qPCR لتقييم التعبير عن البروتينات تقاطع ضيق في التقاء MMECs المورين الأولية.وينظر إلى MMECs المورين الأولية للتعبير عن مستويات عالية من كلودين-5، occludin، وzonula occludens-1، في حين PMMC تظهر سوى تعبير منخفض من occludens zonula-1. ويمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات. بعد هذا البروتوكول، يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل إجراء عمليات اختبار الترحيل أو تجارب الإجهاد المنخفضة القص للإجابة على أسئلة إضافية.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على عزل الخلايا البطانية الدقيقة الأولية من العضلات الهيكلية بواسطة ميكانيكي وانزيمي تفكك وفرز الخلايا المغناطيسية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

المقترنة تسجيلات المشبك من تصحيح للسيارات ، والخلايا العصبية في العضلات الهيكلية الهدف اسماك الزرد

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

جيل من الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران مخلد الخط الخلية البطانية باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; حاجز الدم في الدماغ الموديل

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

تقييم وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا دماغي الأوعية الدموية غشائي

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

العزل الوظيفي للوحدات الحركية واحدة من الجرذ ميديال Gastrocnemius العضلات

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

تشريح ألياف العضلات الهيكل العظمي واحد للتحليلات Immunofluorescent ومورفومتري من تقاطعات العضلات العصبية جبل كامل

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...