Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
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这项工作得到了 "else kröner-fre舍enius-stibtung" (2018_A03 到 tr) 的支持, "创新 medizinische forschung (基金组织) münster" (i-ru2001 1811 to tr) 和德国研究基金会 (dfg, inst 2105/27-1--, me 328---1, me 3281-1-1 至 sgm)。黑克·布鲁姆提供的插图图片。

所有动物实验都得到了地方当局的批准, 并根据德国《动物福利法》 (84-02.05.20.13.097) 进行。
1. 动物实验的一般意见
<ol><li>按照各自机构动物护理和使用委员会的指导方针进行所有老鼠实验。</li>
	<li>根据实验动物科学协会联合会 (felasa) 等国际准则, 使小鼠处于标准化状态。 请注意:一般来说, 这种隔离技术可用于不受年龄、性别或遗传背景影响的小鼠。为了获?...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. 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C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

微血管内皮细胞在所有组织中提供屏障功能, 其功能障碍导致相关器官的疾病3。此外, 针对器官的微血管 ec 研究可以为新的治疗策略铺平道路。因此, 深入了解生理和病理生理条件下的微血管 ec 功能具有重要的科学意义。白细胞与内皮细胞相互作用的调节成功地用于治疗多发性硬化症患者与纳珠单抗, 一种抗体, 防止淋巴细胞粘附, 从而转染 6. 然而, 包括炎症亚?...

通过血液, 细胞和器官提供氧气、底物和其他必要的分子。这种交换发生在毛细血管中, 是最小的船只。毛细血管是由内皮细胞 (ec) 内层形成的, 其完整性仍然是成功调节血管内和间质间隙之间肌肉稳态的先决条件。为了确保可溶性因子和细胞的选择性过渡, ec 构成了一个单层连接的紧密和粘附连接 1. 除了作为营养或代谢产物的屏障的作用外, ec 还调节炎症过程中白细胞的吸收。炎症或组织损伤导致 ec 表面粘附分子的上调, 并产生促进白细胞附着和转移到目标组织2的趋化因子.因此, ec 严格参与炎症过程的调节, 如防御病原体或组织修复。
ec 功能障碍与血管疾病、慢性肾功能衰竭、静脉血栓形成严重的病原体感染直接相关。此外, ec 几乎总是参与器官特异性自身免疫, 如糖尿病或多发性硬化症3。因此, 血液和器官之间的屏障功能是由不同细胞类型的协同相互作用控制的。在骨骼肌微血管内皮细胞 (mmec) 与肌肉细胞、成纤维细胞和周细胞形成一个功能单元, 即 "myovascular 单位" (mvu)。因此, mvu 功能障碍可能在肌病的病理生理学中起着至关重要的作用。然而, 对这些监管机制的更深入了解仍然缺失, 目前无法确定肌病中新的、急需的治疗目标。
为了研究复杂的生理和病理生理机制, 动物模型是常用的。然而,体外模型通过排除各种混淆因素, 提供了关注感兴趣的主题的优势。为了研究体外过程, 有必要分离出纯和有活力的原代细胞。与细胞系不同的是, 从转基因动物身上分离出的原代细胞能够研究体外基因修饰的后果。
本文介绍了一种利用机械和酶解分离的方法, 然后采用磁性活化细胞分选技术 (mcs) 进行纯化。为此, 使用了针对特定表面标记的磁珠。血小板内皮细胞粘附分子-1 (pecam1, cd31) 主要在 ec 上表达, 可用于丰富这种细胞类型。为了保证高细胞纯度, 对蛋白酪氨酸磷酸酶受体 c 型 (ptprc, cd45) 的否定选择排除了造血源细胞。此外, 还介绍了质量控制、原生小鼠 mmec 的培养、潜在的应用和局限性以及特殊注意事项。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

骨骼肌毛细血管内皮细胞 (肌肉微血管内皮细胞, mmec) 在调节液体和营养物质的交流以及对感染的免疫反应之间建立了障碍通过控制免疫细胞迁移的代理。对于这些功能, mmec 形成一个功能性的 "肌血管单位" (mvu), 具有更多的细胞类型, 如成纤维细胞、周细胞和骨骼肌细胞。因此, mmec 的功能障碍, 因此 mvu 有助于各种各样的肌病。然而, mmec 在健康和疾病方面的监管机制仍然没有得到充分的了解, 它们的阐明先于治疗肌病的更具体的方法。在 mvu 的背景下对主要 mmec 功能进行隔离和深入调查, 可能有助于更好地了解这些过程。
本文提供了一种通过机械和酶解分离分离骨骼肌原生小鼠 mmec 的方案, 包括纯化和培养维持步骤。

隔离一天后, 原生小鼠 mmec 和残留的其他细胞形成企业集团, 并坚持到培养的培养物的底部 (图 1a天 1)。从第7天开始, 就可以观察到扁平和拉长的细胞。然而, 其他主要是球状细胞的污染仍然是可见的 (图 1 a 第7天)。因此, 需要通过mcs 进行 cd31 阳性选择的另一个周期。此后, 原生小鼠 mmec 扩散到约80–90% 的密度。在融合时, ?...

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Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

骨骼肌微血管内皮细胞 (mmec) 塑造了肌肉毛细血管的内壁, 并调节两者, 流体分子的交换和 (免疫) 细胞在肌肉组织和血液之间的迁移。分离原生小鼠 mmeec, 如下所述, 使 "我的血管单位" 能够进行全面的体外调查。

原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞的分离

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

该协议描述了一种将微血管内皮细胞与骨骼肌分离的平台技术。例如，这些细胞可用于进一步深入了解血液肌肉屏障功能。与现有方法相比，该技术的主要优点是能够分离出纯度高的原发性微血管内皮细胞。这项技术可以帮助回答免疫促进肌肉疾病领域的关键问题，如肌肉和内皮细胞在健康和疾病中的相互作用。首先，准备协议中描述的所有所需的解决方案和六孔板。要开始实际程序，请获得一双手术锋利的/钝剪刀、一把手术锋利的/锋利的剪刀以及笔直和弯曲的钳子。用70%乙醇消毒所有手术器械。将安乐死成年雄性小鼠放在其背部，用70%乙醇滋润腿部。使用锋利的/钝器手术剪刀，通过切割臀部关节切断每条整个腿。将四肢放在封闭的细胞培养盘中。将菜转移到无菌层流罩上。使用锋利的剪刀和弯曲的钳子将皮肤从臀部切开到脚趾尖。使用直钳握住脚趾或脚垫，同时使用弯曲钳子将皮肤从脚趾剥到臀部。要分离肌肉四头肌，切下膝盖的肌腱，将股骨的肌肉切断至臀部。切断跟腱，以隔离三头肌。接下来，沿着头骨切到罂粟花，并去除肌肉。要去除无法分离的肌腱，请用弯曲的钳子握住肌肉，并切断每个合适的肌腱。将2，445微升的准备好的消化液加入新鲜、有标签的细胞培养皿中，并确定重量。将所有肌肉碎片转移到这道菜上。然后，确定重量。两个测量值的差值提供肌肉组织的干重，不能超过一克。使用手术锋利的剪刀，将整个肌肉组织切成小块。在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育组织悬浮液1.5小时，确保每20分钟将悬浮液与一毫升胰岛素注射器小心地混合约5分钟。孵育后，将悬浮液转移到放置在50毫升标签管上的70微米尼龙过滤器上，然后收集流经。用8毫升DMEM清洗细胞过滤器，并收集流经。如果碎片堵塞了过滤器，则重新暂停分离溶液。丢弃细胞过滤器，在重力 300 倍和 20 摄氏度下将悬浮液离心机 10 分钟。小心地去除上流剂，将细胞颗粒重新在一毫升氯化铵钾解液中，用于红血球的解液。在室温下孵育30秒。然后，加入含有10%FCS的9毫升DMEM，以停止反应。将电池悬浮液转移到15毫升管。然后，使用 Neubauer 细胞计数室来确定细胞数。为了开始消耗CD45阳性细胞，在重力300倍和4摄氏度下将悬浮液离心10分钟。完全去除上流液，将细胞颗粒重新在90微升的MCS缓冲液中。加入 10 微升 CD45 微珠并混合悬浮液。在4至8摄氏度的冰箱中孵育15分钟。在此之后，添加一毫升的 MCS 缓冲液。在重力300倍和4摄氏度下离心10分钟。完全去除上流液，将细胞重新填充在500微升的MCS缓冲液中。在分离器的磁场中放置一个大磁柱。用三毫升的 MCS 缓冲液冲洗柱的储液罐。然后，在柱子下方放置一个 15 毫升的圆锥管，以收集流通过。将整个单元格悬浮液应用于列，并让它完全流过。将三毫升 MCS 缓冲液添加到每个洗涤步骤的储液罐中，然后等待柱的储液罐是空的，然后开始下一个洗涤步骤，从而将柱式缓冲液洗涤三次。收集通过列的未标记单元格，以执行进一步的分离步骤。要开始积累CD31阳性细胞，请使用纽鲍尔细胞计数室来确定细胞数。之后，在重力的300倍和摄氏4度的下将未标记的细胞离心10分钟。完全去除上流液，将颗粒重新在 90 微升 MCS 缓冲液中。添加 10 微升 CD31 微珠，混合整个悬浮液。在4至8摄氏度的冰箱中孵育15分钟。在此之后，加入一毫升的MCS缓冲液，并在300倍的重力下和4摄氏度下离心10分钟。取出上流液，在500微升MCS缓冲液中重新填充细胞。将中磁柱定位在分离器的磁场中。用 500 微升 MCS 缓冲液冲洗柱。接下来，在柱子下方放置一个 15 毫升的圆锥形管，以收集流通过。将整个单元悬浮液应用到列上，让它完全流过。在每个洗涤步骤的储液罐中加入 500 微升 MCS 缓冲液，将柱中三次清洗，然后等待柱的储液罐为空，然后开始下一个洗涤步骤。通过列的未标记单元格表示 CD45 负数、CD31 负分数。将它们存储以进行进一步的质量控制。然后，从分离器上取出柱子，并将其放在合适的收集管上。将两毫升 MCS 缓冲液移到柱子上。立即将柱塞推入柱中，以冲洗磁性标记的电池。此 CD45 负数，CD31 阳性分数表示富集的主要 murine 2。在重力 350 倍和 20 摄氏度下将电池悬浮液离心 5 分钟。完全去除上一提液，将细胞重新在一毫升内皮细胞培养中。将细胞转移到一个涂层的六井培养板的单一井，该井含有一毫升内皮细胞培养基。在培养过程中，在37摄氏度下用5%的二氧化碳在无菌培养箱中孵育细胞，确保每两三天刷新一次培养基。当细胞在80%至90%的汇合时，用两毫升PBS在两个连续的洗涤步骤中冲洗每个包含的细胞两次。然后，在每井中加入800微升的三辛EDTA溶液，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳在无菌培养箱中孵育3至5分钟。在此之后，添加 1，200 微升的 DMEM，包含至少 10%FCS，以停止酶活性。在重力350倍和20摄氏度下离心5分钟。然后，如前所述，累积 CD31 细胞以提高纯度。使用具有 20% 放大倍率和 0.35 镜头数值光圈的明亮场或标准相收缩显微镜来观察细胞汇合。在这项研究中，原发性穆林骨骼肌微血管内皮细胞被分离。隔离一天后，原发性MMECs和残余的其他细胞形成联合体，并坚持培养皿的底部。从第七天开始，可以观察到扁平和拉长的细胞，但是，其他，主要是球状细胞的污染仍然可见。因此，需要通过 MCS 进行另一个 CD31 阳性选择周期。此后，原发性杂音MMEC在汇合时扩散到大约80至90%的密度，它们通常形成纵向对齐细胞的非重叠单层。由于接触抑制，增殖在汇合时停止。通过流式细胞学进行质量控制，显示分离后立即对细胞的生存能力和纯度值，每个值约为 70%。通过 MCS 进行另一个 CD31 阳性选择后培养的细胞显示纯度和生存能力的满意值，每个值高达 95%。然后通过定量PCR对获得细胞进行肌肉卫星细胞标记基因配对盒蛋白7和M-cadherin的基因表达。正如预期的那样，只有CD45阴性、CD31阴性分数以及分化的原发性穆林肌肉细胞表示盒蛋白7和M-cadherin，而CD45阴性、CD31阳性和原发性杂物对于这些标记物是负数。在第二个CD31 MCS步骤之后，qPCR用于评估汇合原麦地干中紧密结蛋白的表达。初级穆林 MMECs 被看到表达高水平的克劳丁-5，奥克鲁丁，和分区遮挡-1，而pmMC只显示一个低表达的区黄素-1。此技术可以在五到六个小时内执行。按照此协议，可以执行其他方法，如迁移分析或低剪切应力实验，以回答其他问题。看完这段视频后，您应该能够通过机械和酶分离和磁细胞分选，将原发性微血管内皮细胞从骨骼肌中分离。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

配对补丁钳从电机神经元和斑马鱼的目标骨骼肌

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

科研

神经科学

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

代的永生化小鼠脑微血管内皮细胞株作为<em在体外</em血脑屏障型号

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

从小鼠胚胎神经管的神经嵴细胞的分离和培养

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

从胚胎前脑内皮细胞的分离和培养

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

原代鼠脑微血管内皮细胞的分离

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

在脑血管内皮细胞生物能量功能的评价

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

小鼠初级少突胶质的快速特异磁分离

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

大鼠中胃肌肉单运动单元的功能隔离

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

人类诱导多能干细胞脑微血管内皮细胞的衍生、扩张、冷冻保存和特征化

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

单骨骼肌肉纤维解剖，用于全山神经肌肉结的免疫荧光和形态分析

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...