Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af "anden Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 til TR), "Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster" (I-RU211811 til TR) og tyske Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, mig 3283/5-1, og mig 3283/6-1 til SGM). Illustreret billeder leveres af Heike Blum.

Alle dyreforsøg blev godkendt af de lokale myndigheder og gennemføres i henhold til den tyske animalske velfærd opføre (84-02.05.20.13.097).
1. generelle bemærkninger om dyreforsøg
<ol><li>Udføre alle mus eksperimenter efter retningslinjerne i de respektive institutionelle dyrs pleje og bruge udvalget.</li>
	<li>Holde mus under standardiserede betingelser og i overensstemmelse med internationale retningslinjer som Federation for Laboratory Animal Science foreninger (FELASA). <stron...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Mikrovaskulære endotelceller give barriere funktioner i alle væv og deres dysfunktion resulterer i sygdom af tilknyttede organer 3. Desuden, orgel-specifikke undersøgelser af mikrovaskulære EF kunne bane vejen for nye terapeutiske strategier. En dybere forståelse af mikrovaskulære EF funktion under fysiologiske og patofysiologiske forhold er derfor af stor videnskabelig interesse. Graduering af leukocyt/endotelet interaktion bruges med succes til behandling af multipel sklerose patienter med...

Via blodbanen, celler og organer leveres med ilt, substrater og andre nødvendige molekyler. Denne udveksling foregår i kapillærer, de mindste fartøjer. Kapillærer er dannet af en indre endotel (EF) cellelag hvis integritet er fortsat en forudsætning for vellykket regulering af muskel homøostase mellem det intravaskulære og interstitielle rum. For at sikre en selektiv overgang af opløselige faktorer og celler, EF udgør en éncellelag forbundet af stram og adherens vejkryds 1. Ud over sin rolle som barriere for næringsstoffer eller stofskifteprodukter regulere EF ansættelse af leukocytter i inflammatoriske processer. Betændelse eller væv skader fører til en op-regulering af adhæsionsmolekyler på EF overflade og produktion af kemokiner lette leukocyt vedhæftet fil og transmigration i target væv 2. EF er derfor kritisk involveret i reguleringen af inflammatoriske processer som forsvar mod patogener eller væv reparation.
En dysfunktion i EF er direkte forbundet med Vaskulære sygdomme, kronisk nyresvigt, venøs trombose svær patogen infektioner. Derudover EF er næsten altid involveret i orgel-specifikke autoimmunitet såsom diabetes mellitus eller multipel sklerose 3. Funktionen barriere mellem blodet og organer er derfor styret af et samordnet samspil af forskellige celletyper. I skeletmuskulaturen mikrovaskulære endotelceller (MMEC) samt muskelceller, fibroblaster og pericytes udgør en funktionel enhed, "myovascular enhed" (MVU). Derfor kan en dysfunktion af MVU spiller en afgørende rolle i Patofysiologi af myopatier. Dog en dybere forståelse af disse reguleringsmekanismer stadig mangler og i øjeblikket er til hinder for identifikation af nye, presserende, terapeutiske mål i myopatier.
For at undersøge de komplicerede fysiologiske og patofysiologiske mekanismer, er dyremodeller almindeligt anvendt. Men, in vitro- modeller tilbyder fordel fokusere på emne af interesse ved at udelukke en række forstyrrende faktorer. For at undersøge processer in vitro-det er nødvendigt at isolere ren og levedygtige primærelementer. I modsætning til cellelinjer aktiverer primærelementer isoleret fra transgene dyr for at undersøge konsekvenserne af genetiske modifikationer i vitro.
Her, er en metode til at isolere primære murine MMEC beskrevet ved hjælp af mekaniske og enzymatiske dissociation efterfulgt af magnetisk aktiveret celle sortering teknikker (MCS) for rensning. Til dette formål anvendes magnetiske perler mod specifikke overflade markører. Trombocyttal endotel celle vedhæftning molekyle-1 (PECAM1, CD31) er hovedsagelig udtrykt på EF og kan bruges til at berige denne celletype. For at garantere høj celle renhed, er hæmatopoietisk celler udelukket af en negativ selektion for protein tyrosin phosphatase receptor type C (PTPRC, CD45). Yderligere, kvalitetskontrol, dyrkning af primære murine MMEC, potentielle anvendelsesmuligheder og begrænsninger samt særlige overvejelser præsenteres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

Endotelceller af skeletmuskulatur kapillærer (muskel mikrovaskulære endotelceller, MMEC) opbygge barriere mellem blodet og skeletmuskulatur regulerer udvekslingen af væsker og næringsstoffer samt immunrespons mod smitsomme agenter ved at kontrollere immun celle migration. For disse funktioner, MMEC danne en funktionel "myovascular enhed" (MVU), med yderligere celletyper, som fibroblaster, pericytes og skeletmuskulatur celler. Derfor bidrager en dysfunktion af MMEC og derfor MVU til en lang række myopatier. Men reguleringsmekanismer af MMEC i sundhed og sygdom forbliver utilstrækkeligt forstået og deres udredning forud for mere specifikke behandlinger for myopatier. Isolation og tilbundsgående undersøgelse af primær MMEC funktioner i forbindelse med MVU kunne fremme en bedre forståelse af disse processer.
Denne artikel indeholder en protokol for at isolere primære murine MMEC af skeletmuskulatur af mekanisk og enzymatiske dissociation herunder rensning og kultur vedligeholdelse skridt.

En dag efter isolation, primære murine MMEC og resterende andre celler danner konglomerater og overholde bunden af kultur retter (figur 1A dag 1). Fra dag 7, kan fladt og langstrakt celler observeres. Men forurening af andre, for det meste klumpformet celler, er stadig synlige (figur 1A dag 7). Således, en anden cyklus af CD31 positive valg via MCS er påkrævet. Herefter primære murine MMEC formere sig til en tæthed...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Mikrovaskulære endotelceller af skeletmuskulatur (MMEC) form indersiden af muskel kapillærer og regulere både, udvekslingen af væsker/molekyler og migration af (immunceller) mellem muskelvæv og blod. Isolering af primære murine MMEC, som beskrevet her, giver mulighed for omfattende in vitro-undersøgelser af "myovascular enhed".

Isolering af primære Murine skeletmuskulatur mikrovaskulære Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Denne protokol beskriver en platform teknik til at isolere mikrovaskulære endotelceller fra skeletmuskulatur. Disse celler kan bruges, for eksempel, at få yderligere indsigt i blod muskel barriere funktioner. Den største fordel ved denne teknik i forhold til eksisterende metoder er, at det er muligt at isolere primære mikrovaskulære endotelceller med høj renhed.Denne teknik kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål inden for immun-medieret muskelsygdomme såsom samspillet mellem muskel-og endotelceller i sundhed og sygdom. Først forberede alle nødvendige løsninger og seks-brønd plader som beskrevet i protokollen. For at begynde den praktiske procedure, få et par kirurgiske skarpe / stumpe saks, et par kirurgiske skarpe / skarpe saks, og lige og buede scer.Desinficere alle kirurgiske instrumenter med 70% ethanol. Placer en aflivet voksen mandlig mus på ryggen og fugt benene med 70% ethanol. Brug den skarpe / stumpe kirurgiske saks, afskære hele benet ved at skære på hofteleddet.Placer ekstremiteterne i en lukket cellekulturskål. Overfør skålen til en steril laminar flow hætte. Brug skarpe saks og buede kraftbånd til at skære huden åben fra hoften til spidsen af tåen.Brug de lige kraftbefædre til at holde tå eller fod pad, mens du bruger de buede kraftbefædel til at skrælle huden ud fra tåen til hoften. For at isolere muskulus quadriceps femoris, skære senen fra knæet, og afskære musklen langs lårbenet til hoften. Sever akillessenen for at isolere muskculus triceps surae.Dernæst skæres langs skinnebenet til popliteal fossa og fjern musklen. For at fjerne sener, som ikke kan adskilles, holde musklerne med de buede snævlinger og afbrød hver passende sene. Tilføj 2, 445 mikroliter af tilberedt fordøjelsesopløsning til en frisk, mærket cellekultur skål og bestemme vægten.Overfør alle de muskel stykker til denne parabol. Derefter bestemme vægten. Forskellen mellem begge målte værdier giver den tørre vægt af muskelvæv, som ikke må overstige et gram.Brug den kirurgiske skarpe saks, skære hele muskelvæv i små stykker. Vævssuspensionen skal inkuberes ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid i 1,5 timer, og sørg for at blande suspensionen omhyggeligt med en insulinsprøjt med en milliliter hver 20. Efter inkubationen overføres suspensionen til en 70-mikrometer nylons si, der er anbragt på et 50 millilitermærket rør, og strømmen opsamles igennem.Vask cellesting med otte milliliter DMEM og opsaml strømmen igennem. Hvis stykkerne tilslutter semældet, skal den dissocierede opløsning opspjævs igen. Kassér celles si og centrifuge suspensionen ved 300 gange tyngdekraften og ved 20 grader Celsius i 10 minutter.Fjern forsigtigt supernatanten og opsbrug cellepellet i en milliliter af en ammoniumchlorid kaliumlysingbuffer for lysis af røde blodlegemer. Inkuber ved stuetemperatur i 30 sekunder. Derefter tilsættes ni milliliter DMEM indeholdende 10% FCS for at stoppe reaktionen.Overfør cellesuspensionen til et 15-milliliterrør. Brug derefter et Neubauer celletællingskammer til at bestemme cellenumrene. For at begynde at nedbryde cd45-positive celler, centrifuge suspensionen ved 300 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 10 minutter.Fjern supernatanten helt og opslæm cellepellet i 90 mikroliter MCS buffer. Tilsæt 10 mikroliter CD45 mikroperler og bland suspensionen. Inkuberes i et køleskab ved fire til otte grader Celsius i 15 minutter.Derefter skal du tilføje en milliliter MCS-buffer. Centrifuge ved 300 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Fjern supernatanten helt og opslæm cellerne i 500 mikroliter MCS buffer.Placer en stor magnetisk søjle i separatorens magnetfelt. Skyl kolonnens beholder med tre milliliter MCS-buffer. Derefter placeres et 15-milliliter konisk rør under kolonnen for at samle strømmen igennem.Påfør hele cellesuspensionen på kolonnen, og lad den flyde helt igennem. Kolonnen vaskes tre gange ved at lægge tre milliliter MCS-buffer i beholderen for hvert vasketrin og vente, indtil kolonnens reservoir er tom, før du begynder det næste vasketrin. De ikke-mærkede celler, der passerer gennem kolonnen, opsamles til brug i yderligere adskillelsestrin.Hvis du vil begynde at akkumulere CD31-positive celler, skal du bruge et Neubauercelletællingskammer til at bestemme cellenumrene. Bagefter centrifuger de umærkede celler ved 300 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Fjern supernatanten helt og opslæm pellet i 90 mikroliter af MCS buffer.Tilsæt 10 mikroliter CD31 mikroperler og bland hele suspensionen. Inkuberes i et køleskab ved fire til otte grader Celsius i 15 minutter. Efter dette, tilsæt en milliliter MCS buffer og centrifuge ved 300 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 10 minutter.Fjern supernatanten, og opslæm cellerne igen i 500 mikroliter MCS-buffer. Placer den mellemstore magnetiske kolonne i separatorens magnetfelt. Skyl kolonnen med 500 mikroliter MCS-buffer.Dernæst skal du placere et 15-milliliter konisk rør under kolonnen for at samle strømmen igennem. Påfør hele cellesuspensionen på kolonnen, og lad den flyde helt igennem. Vask kolonnen tre gange ved at tilføje 500 mikroliter MCS-buffer i beholderen for hvert vasketrin, og vent, indtil kolonnens reservoir er tom, før du begynder det næste vasketrin.Ikke-mærkede celler, der passerer kolonnen, repræsenterer den CD45-negative, CD31-negative brøk. Opbevar dem til yderligere kvalitetskontrol. Fjern derefter kolonnen fra separatoren og læg den på et passende opsamlingsrør.Pipette to milliliter MCS-buffer på kolonnen. Skub straks stemplet ind i kolonnen for at skylle de magnetisk mærkede celler. Denne CD45-negative, CD31-positive brøk repræsenterer de berigede primære murine-EC'er.Centrifuge cellen suspension ved 350 gange tyngdekraften og ved 20 grader Celsius i fem minutter. Fjern supernatanten helt og resuspend cellerne i en milliliter endotelcellemedium. Overfør cellerne til en enkelt brønd af en belagt seks-brønds kulturplade, der indeholder en milliliter endotelcellemedium.Til dyrkning inkuberes cellerne ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid i en steril inkubator, og sørg for at opdatere mediet hver anden til tredje dag. Når cellerne er ved 80 til 90%sammenløb, skyl hver brønd, der indeholder celler to gange med to milliliter PBS i to på hinanden følgende vasketrin. Derefter tilsættes 800 mikroliter trypsin EDTA opløsning til hver brønd og inkuberes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i en steril inkubator i tre til fem minutter.Derefter tilsættes 1,200 mikroliter DMEM, der indeholder mindst 10% FCS, for at stoppe den enzymatiske aktivitet. Centrifuge ved 350 gange tyngdekraften og ved 20 grader Celsius i fem minutter. Derefter akkumuleres CD31 celler som tidligere beskrevet for at øge renheden.Brug et lyst felt eller standard fase kontrakt mikroskop med 20% forstørrelse og 0,35 linse numerisk blænde for at observere cellen sammenløb. I denne undersøgelse, primære murine skeletmuskulatur mikrovaskulære endotelceller er isoleret. En dag efter isolation, primære murine MME'er og resterende andre celler danner konglomerater og holde sig til bunden af kultur retter.Fra dag syv og fremefter kan flade og aflange celler observeres, men forurening af andre, for det meste sfæroide celler er stadig synlig. Således er en anden cyklus af CD31-positiv udvælgelse via MCS påkrævet. Herefter formerer primære murine MMECs sig til en massetæthed på ca. 80 til 90% Ved sammenløbet danner de typisk et ikke-overlappende monolag af langsgående justerede celler.Spredning stopper ved sammenløbet på grund af kontakthæmning. Kvalitetskontrol via flow cytometri viser værdier for både levedygtighed og renhed spænder omkring 70%hver for celler umiddelbart efter isolation. Celler dyrket efter en anden CD31-positiv udvælgelse via MCS viser tilfredsstillende værdier for renhed samt for levedygtighed, der spænder op til 95%hver.Opnåede celler undersøges derefter for genekspression af muskel satellit celle markør gener parret box protein 7 og M-cadherin på mRNA-niveau ved kvantitativ PCR. Som forventet er det kun cd45-negative, CD31-negative fraktion samt de differentierede primære murine muskelceller udtrykt kasseprotein 7 og M-cadherin, mens CD45-negative, CD31-positive og de primære murine MME'er er negative for disse markører. Efter det andet CD31 MCS-trin bruges qPCR til at evaluere ekspressionen af stramme samlingsproteiner i sammenløbets primære murine MME'er.Primære murine MMECs ses at udtrykke høje niveauer af claudin-5, okcludin, og zonula occludens-1, mens pmMC kun viser et lavt udtryk for zonula okcludens-1. Denne teknik kan udføres i fem til seks timer. Efter denne protokol, andre metoder såsom migration analyser eller lav-forskydning stress eksperimenter kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål.Efter at have set denne video, bør du være i stand til at isolere primære mikrovaskulære endotelceller fra skeletmuskulatur af mekaniker og enzymatisk dissociation og magnetisk celle sortering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generering af en immortaliseret murin Brain mikrovaskulær endotel cellelinie som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering og dyrkning af endotelceller fra embryonale forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering af Primary Murine Brain mikrovaskulære endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Evaluering af bioenergetic Funktion i cerebrale vaskulære endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Funktionel isolering af enkeltmotoriske enheder af Rotte Mediale Gastrocnemius Muskel

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissektion af enkelt skeletmuskelfibre til immunfluorescerende og morfometriske analyser af hele mount neuromuskulære vejkryds

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...