Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de "anders Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 aan TR), "Innovatieve Medizinische Forschung (IMF) Münster" (I-RU211811 aan TR) en Duitse Research Foundation (DFG INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 en ME 3283/6-1 tot SGM). Geïllustreerde knopvlakken door Heike Blum.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten en uitgevoerd volgens de Duitse dierenwelzijn wet (84-02.05.20.13.097).
1. algemene opmerkingen over dierproeven
<ol><li>Uitvoeren van alle muis experimenten overeenkomstig de richtsnoeren van de respectieve institutionele dierenverzorgers en gebruik van de Commissie.</li>
	<li>Houden van muizen onder gestandaardiseerde condities en volgens internationale richtlijnen zoals de Federatie voor Laboratory Animal Science verenigingen...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Microvasculaire endotheliale cellen bieden barrière functies in alle weefsels en hun resultaten van de disfunctie bij ziekte van de bijbehorende organen 3. Bovendien, orgel-specifieke studies van microvasculaire EG kunnen de weg vrijmaken voor nieuwe therapeutische strategieën. Daarom is een dieper begrip van microvasculaire EG functie onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden van wetenschappelijke belangstelling. Modulatie van leukocyten/endotheel interactie is met succes gebruik...

Via de bloedbaan, cellen en organen zijn voorzien van zuurstof, substraten en andere noodzakelijke moleculen. Deze uitwisseling vindt plaats in de haarvaten, de kleinste vaartuigen. Haarvaten worden gevormd door een cellaag van de innerlijke endothelial (EG) waarvan de integriteit een voorwaarde voor succesvolle regulering van de homeostase van de spier tussen de intravasculaire en interstitiële ruimte blijft. Om te zorgen voor een selectieve overgang van oplosbare factoren en cellen, EG vormen een enkelgelaagde onderling verbonden door strak en adherens kruispunten 1. Naast haar rol als barrière voor voedingsstoffen of stofwisselingsproducten, EG regelen de aanwerving van leukocyten in inflammatoire processen. Ontsteking of weefsel schade leidt tot een up-regulatie van celadhesie-moleculen op het oppervlak van de EG en de productie van chemokines leukocyte bijlage en transmigratie in de target weefsel 2te vergemakkelijken. Bijgevolg zijn de EG kritisch betrokken bij de regulatie van inflammatoire processen zoals de verdediging tegen ziekteverwekkers of weefselherstel.
Een dysfunctie van de EG is direct gekoppeld aan vasculaire ziekten, chronisch nierfalen, veneuze trombose ernstige pathogen infecties. Bovendien EG zijn bijna altijd betrokken bij orgaan-specifieke autoimmuniteit zoals diabetes mellitus of multiple sclerose 3. De functie als barrière tussen bloed en organen wordt daarom beheerd door een gezamenlijke samenspel van verschillende celtypes. In de skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen (MMEC) samen met de spiercellen, fibroblasten en pericytes vormen een functionele eenheid, de "eenheid van de myovascular" (MVU). Daarom kan een dysfunctie van de MVU een cruciale rol spelen in de pathofysiologie van myopathieën. Echter een dieper begrip van deze regulerende mechanismen ontbreekt nog steeds en momenteel verzet zich tegen de identificatie van nieuwe, therapeutische en dringend noodzakelijke doelen in myopathieën.
Om te onderzoeken het complex fysiologische en pathofysiologische mechanismen, worden dierlijke modellen vaak gebruikt. Echter, in vitro modellen bieden het voordeel te concentreren op het onderwerp van belang door een scala aan storende factoren uit te sluiten. Om te onderzoeken processen in vitro er moet zuiver en levensvatbare primaire cellen isoleren. In tegenstelling tot de cellijnen toelaten primaire cellen geïsoleerd van transgene dieren om de gevolgen van genetische modificaties in vitro onderzoeken.
Een methode om te isoleren van de primaire lymfkliertest MMEC wordt hier beschreven met behulp van mechanische en enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische geactiveerde cel Sorteren technieken (MCS) voor de zuivering. Voor dit doel, worden magnetische kralen tegen specifieke oppervlakte markers gebruikt. Bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul-1 (PECAM1, CD31) wordt vooral uitgedrukt op EG en kan worden gebruikt voor het verrijken van dit celtype. Om te rechtvaardigen hoge cel zuiverheid, zijn cellen van hematopoietische oorsprong uitgesloten door een negatieve selectie voor proteïne tyrosine fosfatase receptor type C (PTPRC, CD45). Verder, kwaliteitscontroles, teelt van primaire lymfkliertest MMEC, toepassingsmogelijkheden en beperkingen, alsmede speciale overwegingen worden gepresenteerd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

De endotheliale cellen van skeletspieren haarvaten (microvasculaire endothelial spiercellen, MMEC) opbouwen van de barrière tussen de bloedstroom en debeenderspieren regulering van de uitwisseling van vloeistoffen en voedingsstoffen, evenals de immuunrespons tegen besmettelijke agenten door immuun cel migratie te beheren. Voor deze functies, MMEC vormen een functionele "myovascular eenheid" (MVU), met verdere celtypen, zoals pericytes, fibroblasten en cellen van de skeletspieren. Bijgevolg een dysfunctie van MMEC en dus de MVU draagt bij aan een grote verscheidenheid van myopathieën. Echter regulerende mechanismen van MMEC bij gezondheid en ziekte blijven onvoldoende begrepen en hun opheldering voorafgaat aan meer specifieke behandelingen voor myopathieën. De isolatie en diepgaand onderzoek van de primaire functies van de MMEC in het kader van de MVU zou kunnen vergemakkelijken een beter inzicht in deze processen.
Dit artikel bevat een protocol om te isoleren van primaire lymfkliertest MMEC van de skeletspieren door mechanische en enzymatische dissociatie, met inbegrip van de zuivering en cultuur onderhoud stappen.

Een dag na isolatie, primaire lymfkliertest MMEC en resterende andere cellen vormen van conglomeraten en zich houden aan de onderkant van cultuur gerechten (figuur 1A dag 1). Vanaf dag 7, kunnen plat en langgerekte cellen worden waargenomen. Besmetting van andere, meestal sferoïde cellen, is echter nog steeds zichtbaar (figuur 1A dag 7). Dus, een andere cyclus van CD31 positieve selectie via MCS is vereist. Hierna, prim...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Microvasculaire endotheliale cellen van skeletspieren (MMEC) vorm van de binnenwand van de spier haarvaten en reguleren beide, uitwisseling van vloeistoffen/moleculen en migratie van (afweercellen) tussen spierweefsel en bloed. Isolatie van primaire lymfkliertest MMEC, kunt zoals hier beschreven, u uitgebreide in vitro onderzoeken van de "myovascular-eenheid".

Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Dit protocol beschrijft een platformtechniek om microvasculaire endotheelcellen te isoleren van skeletspieren. Deze cellen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de functies van de bloedspierbarrière. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het mogelijk is om primaire microvasculaire endotheelcellen met een hoge zuiverheid te isoleren.Deze techniek kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van immuungemedieerde spierziekten te beantwoorden, zoals de interactie tussen spier- en endotheelcellen in gezondheid en ziekte. Bereid eerst alle benodigde oplossingen en zes-goed platen zoals beschreven in het protocol. Om te beginnen met de praktische procedure, het verkrijgen van een paar chirurgische scherpe / stompe schaar, een paar chirurgische scherpe / scherpe schaar, en rechte en gebogen tang.Desinfecteer alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol. Plaats een geëuthanaseerde volwassen mannelijke muis op zijn rug en bevochtig de benen met 70% ethanol. Met behulp van de scherpe / stompe chirurgische schaar, snijd elk hele been door te snijden op het heupgewricht.Plaats de ledematen in een gesloten cel cultuur schotel. Breng de schotel naar een steriele laminaire stroomkap. Gebruik een scherpe schaar en gebogen tangen om de huid open te snijden van de heup tot het puntje van de teen.Gebruik de rechte tangen om de teen of voetpad vast te houden tijdens het gebruik van de gebogen tangen om de huid af te pellen van de teen naar de heup. Om de musculus quadriceps femoris te isoleren, snijd de pees van de knie, en snijd de spier langs het dijbeen naar de heup. Verdrijof de achillespees om de musculus triceps surae te isoleren.Snijd vervolgens langs het scheenbeen naar de popliteal fossa en verwijder de spier. Om pezen te verwijderen die niet kunnen worden gescheiden, houd de spieren met de gebogen tangen en afgesneden elke geschikte pees. Voeg 2, 445 microliters van bereide spijsverteringsoplossing toe aan een verse, gelabelde celkweekschotel en bepaal het gewicht.Breng alle spierstukken naar dit gerecht. Bepaal vervolgens het gewicht. Het verschil van beide gemeten waarden zorgt voor het droge gewicht van het spierweefsel dat niet meer mag bedragen dan een gram.Met behulp van de chirurgische scherpe schaar, snijd het hele spierweefsel in kleine stukjes. Broed de weefselsuspensie bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende 1,5 uur, om ervoor te zorgen dat de suspensie zorgvuldig te mengen met een een-milliliter insulinespuit om de 20 minuten gedurende ongeveer vijf minuten. Breng na de incubatie de ophanging over op een nylon zeef van 70 micrometer die op een buis van 50 milliliter is geplaatst en verzamel de stroom door.Was de celzeef met acht milliliter DMEM en verzamel de stroom door. Als de stukken de zeef aansluiten, wordt de gescheiden oplossing opnieuw opgevraagd. Gooi de celzeef weg en vercentrifuge de suspensie bij 300 keer de zwaartekracht en bij 20 graden Celsius gedurende 10 minuten.Verwijder voorzichtig de supernatant en zet de celpellet opnieuw op in één milliliter van een ammoniumchloride kaliumlysing buffer voor de lyse van rode bloedcellen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Voeg vervolgens negen milliliter DMEM met 10% FCS toe om de reactie te stoppen.Breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. Gebruik vervolgens een Neubauer-celtelkamer om de celnummers te bepalen. Om te beginnen met het uitputten van de CD45-positieve cellen, centrifugeren de suspensie bij 300 keer de zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verwijder de supernatant volledig en resuspend de cel pellet in 90 microliter van MCS buffer. Voeg 10 microliter cd45 microbeads toe en meng de suspensie. Incubeer in een koelkast op vier tot acht graden Celsius gedurende 15 minuten.Voeg hierna een milliliter MCS-buffer toe. Centrifuge bij 300 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant volledig en resuspend de cellen in 500 microliter van MCS buffer.Plaats een grote magnetische kolom in het magnetisch veld van de separator. Spoel het reservoir van de kolom met drie milliliter MCS buffer. Plaats vervolgens een 15-milliliter conische buis onder de kolom om de stroom te verzamelen door.Breng de hele celsuspensie aan op de kolom en laat deze volledig doorstromen. Was de kolom drie keer door het toevoegen van drie milliliter MCS buffer in het reservoir voor elke wasstap en wachten tot het reservoir van de kolom leeg is voordat u begint met de volgende wasstap. Verzamel de niet-gelabelde cellen die door de kolom gaan voor gebruik in verdere scheidingsstappen.Gebruik een Neubauer-celtelkamer om de celnummers te bepalen om cd31-positieve cellen te verzamelen om cd31-positieve cellen te verzamelen. Daarna, centrifugeren de niet-gelabelde cellen op 300 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant volledig en resuspend de pellet in 90 microliter van MCS buffer.Voeg 10 microliter cd31 microbeads toe en meng de hele suspensie. Incubeer in een koelkast op vier tot acht graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg hierna een milliliter MCS-buffer en centrifuge toe bij 300 keer zwaartekracht en gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 500 microliter van MCS buffer. Plaats de medium magnetische kolom in het magnetisch veld van de separator. Spoel de kolom af met 500 microliters MCS-buffer.Plaats vervolgens een 15-milliliter conische buis onder de kolom om de stroom te verzamelen door. Breng de hele celsuspensie aan op de kolom en laat deze volledig doorstromen. Was de kolom drie keer door 500 microliters MCS-buffer toe te voegen aan het reservoir voor elke wasstap en wacht tot het reservoir van de kolom leeg is voordat u aan de volgende wasstap begint.Niet-gelabelde cellen die de kolom passeren, vertegenwoordigen de CD45-negatieve, CD31-negatieve fractie. Bewaar ze voor verdere kwaliteitscontroles. Verwijder vervolgens de kolom uit de scheidingsafscheider en plaats deze op een geschikte opvangbuis.Pipette twee milliliter MCS buffer op de kolom. Duw onmiddellijk de zuiger in de kolom om de magnetisch gelabelde cellen door te spoelen. Deze CD45-negatieve, CD31-positieve fractie vertegenwoordigt de verrijkte primaire murine-ECs.Centrifuge de cel suspensie bij 350 keer zwaartekracht en bij 20 graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant volledig en resuspend de cellen in een milliliter van endotheelcelmedium. Breng de cellen over naar een enkele put van een gecoate zes-put kweekplaat met een milliliter endotheelcelmedium.Voor de teelt, incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide in een steriele incubator, zorg ervoor dat het medium te vernieuwen om de twee tot drie dagen. Wanneer de cellen op 80 tot 90% samenvloeiing, spoel elke put met cellen twee keer met twee milliliter PBS in twee opeenvolgende wasstappen. Voeg vervolgens 800 microliter trypsine EDTA-oplossing toe aan elke put en broeder bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide in een steriele incubator gedurende drie tot vijf minuten.Voeg hierna 1.200 microliter DMEM toe met ten minste 10% FCS om de enzymatische activiteit te stoppen. Centrifuge bij 350 keer zwaartekracht en bij 20 graden Celsius gedurende vijf minuten. Accumuleert vervolgens de CD31-cellen zoals eerder beschreven om de zuiverheid te verhogen.Gebruik een helder veld of standaard fase contract microscoop met 20% vergroting en 0,35 lens numerieke diafragma om de cel samenvloeiing te observeren. In deze studie worden primaire murine skeletspiermicrovasculaire endotheelcellen geïsoleerd. Een dag na isolatie vormen primaire murineMMEC's en restcellen conglomeraten en houden zich aan de onderkant van cultuurgerechten.Vanaf dag zeven kunnen platte en langwerpige cellen worden waargenomen, maar besmetting van andere, meestal sferoïde cellen is nog steeds zichtbaar. Zo is een andere cyclus van CD31-positieve selectie via MCS vereist. Hierna vermenigvuldigen primaire murine-KKK's zich tot een dichtheid van ongeveer 80 tot 90%Bij samenvloeiing vormen ze meestal een niet-overlappende monolaag van langs elkaar uitgelijnde cellen.Proliferatie stopt bij samenvloeiing als gevolg van contactremming. Kwaliteitscontrole via flow cytometrie toont waarden voor zowel levensvatbaarheid als zuiverheid variërend van ongeveer 70% per stuk voor cellen onmiddellijk na de isolatie. Cellen gecultiveerd na een andere CD31-positieve selectie via MCS tonen bevredigende waarden voor zuiverheid en voor levensvatbaarheid, variërend tot 95%.Verkregen cellen worden vervolgens onderzocht op de genexpressie van de spiersatellietcelmarkergenen gekoppeld dooseiwit 7 en M-cadherine op mRNA-niveau door kwantitatieve PCR. Zoals verwacht, alleen de CD45-negatieve, CD31-negatieve fractie evenals de gedifferentieerde primaire murine spiercellen uitgedrukt doos eiwit 7 en M-cadherin, terwijl CD45-negatief, CD31-positief en de primaire murine KMMECs zijn negatief voor deze markers. Na de tweede CD31 MCS-stap wordt qPCR gebruikt om de expressie van strakke verbindingeiwitten in confluent primaire murineMMECs te evalueren.Primaire murine MMECs worden gezien om hoge niveaus van claudin-5, occludin, en zonula occludens-1 uit te drukken, terwijl pmMC slechts een lage uitdrukking van zonula occludens-1 toont. Deze techniek kan worden uitgevoerd in vijf tot zes uur. Volgens dit protocol kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals migratietests of stress-experimenten met lage afschuifspen om aanvullende vragen te beantwoorden.Na het bekijken van deze video, moet u in staat zijn om primaire microvasculaire endotheliale cellen te isoleren van skeletspieren door monteur en enzymatische dissociatie en magnetische cel sorteren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Evaluatie van de Bio-energetische Function in Cerebral vasculaire endotheelcellen

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...