Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la « Else Kröner-Fresenius-Stiftung » (2018_A03 tr), « Novateur Medizinische Forschung (FMI) Münster » (I-RU211811 à TR) et fondation de recherche allemande (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 et ME 3283/6-1 à SGM). Illustré d’images fournies par Heike Blum.

Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par les autorités locales et menées conformément à la loi allemande de protection animale (84-02.05.20.13.097).
1. Généralités sur l’expérimentation animale
<ol><li>Effectuer toutes les expériences de souris conformément aux directives de la protection des animaux institutionnelle respectif et utiliser le comité.</li>
	<li>Gardez la souris dans des conditions normalisées et conformément aux directives internationales ...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Les cellules endothéliales microvasculaires fournissent des fonctions de barrière dans tous les tissus et leurs résultats de dysfonctionnement dans les maladies des organes connexes 3. En outre, des études spécifiques d’organes de EC microvasculaire pourraient ouvrir la voie pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, une meilleure compréhension de la fonction d’EC microvasculaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est d’un grand intérêt sci...

Via la circulation sanguine, les cellules et les organes sont fournis avec l’oxygène, de substrats et d’autres molécules nécessaires. Cet échange se déroule dans les capillaires, les vaisseaux plus petits. Capillaires forment une couche intérieure de cellules endothéliales (EC) dont l’intégrité est une condition préalable au règlement réussi d’homéostasie musculaire entre l’espace intravasculaire et interstitiel. Afin d’assurer une transition sélective des cellules et des facteurs solubles, EC constituent une monocouche reliés entre eux par serrés et de jonctions adherens 1. Outre son rôle de barrière pour les nutriments ou les produits métaboliques, EC régissent le recrutement des leucocytes dans le processus inflammatoire. Dommages d’inflammation ou d’un tissu conduit à une régulation des molécules d’adhérence sur la surface de l’EC et la production des chimiokines facilitant l’attachement de leucocytes et de la transmigration dans les tissus de cible 2. Par conséquent, EC sont gravement impliqués dans la régulation des processus inflammatoires telles que la défense contre les agents pathogènes ou de la réparation des tissus.
Un dysfonctionnement de l’EC est directement associée à des maladies vasculaires, insuffisance rénale chronique, les infections graves pathogène thrombose veineuse. En outre, EC sont pratiquement toujours impliqués dans certains organes auto-immunité telles que diabète ou une sclérose en plaques 3. La fonction de barrière entre la circulation sanguine et les organes est donc contrôlée par une interaction concertée des différents types de cellules. Dans les muscle squelettique cellules endothéliales microvasculaires (CEMG) ainsi que de cellules musculaires, fibroblastes et péricytes forment une unité fonctionnelle, l’unité « myovascular » (MVU). Par conséquent, un dysfonctionnement de la MVU pourrait jouer un rôle essentiel dans la physiopathologie des myopathies. Toutefois, une meilleure compréhension de ces mécanismes de régulation est toujours porté disparue et s’oppose actuellement à l’identification d’objectifs nouveaux, urgentes, thérapeutiques dans les myopathies.
Afin d’étudier les mécanismes physiologiques et physiopathologiques complexes, des modèles animaux sont couramment utilisés. Cependant, en vitro modèles offrent l’avantage de se concentrer sur le sujet d’intérêt en excluant une variété de facteurs de confusion. Pour étudier les processus in vitro, il est nécessaire d’isoler les cellules primaires pures et viables. Contrairement aux lignées cellulaires, piles isolées d’animaux transgéniques permettent d’enquêter sur les conséquences des modifications génétiques in vitro.
Ici, une méthode pour isoler le CEMG murine primaire est décrite à l’aide de dissociation mécanique et enzymatique suivie magnétique cellulaire activé techniques (MCS) pour la purification de tri. À cette fin, des billes magnétiques contre des marqueurs de surface spécifiques sont utilisés. Plaquettes cellules endothéliales molécule d’adhésion-1 (PECAM1, CD31) est principalement exprimée sur le EC et peut être utilisé pour enrichir ce type de cellule. Pour justifier une pureté élevée de cellules, les cellules d’origine hématopoïétique sont exclues par une sélection négative pour la protéine tyrosine phosphatase du récepteur de type C (PTPRC, CD45). En outre, les contrôles de qualité, culture du primaire CEMG murine, applications potentielles et limitations ainsi que des considérations particulières sont présentés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

Les cellules endothéliales des capillaires du muscle squelettique (cellules endothéliales microvasculaires musculaires, CEMG) mettre en place la barrière entre la circulation sanguine et les muscles squelettiques régissant l’échange de fluides et de nutriments ainsi que la réponse immunitaire contre infectieuses agents en contrôlant la migration des cellules immunitaires. Pour ces fonctions, le CEMG forment une fonctionnelle « myovascular unit » (MVU), avec d’autres types de cellules, telles que les fibroblastes, les péricytes et les cellules musculaires squelettiques. Par conséquent, un dysfonctionnement du CEMG et, par conséquent, le MVU contribue à une grande variété de myopathies. Cependant, les mécanismes régulateurs du CEMG en santé et la maladie restent insuffisamment compris et leur élucidation précède des traitements plus spécifiques pour les myopathies. L’isolement et une enquête approfondie des principales fonctions de CEMG dans le contexte de la MVU pourraient permettre une meilleure compréhension de ces processus.
Cet article fournit un protocole visant à isoler les primaire CEMG murin du muscle squelettique par dissociation mécanique et enzymatique, y compris la purification et les mesures de maintien de la culture.

Un jour après l’isolement, primaire CEMG murin et résiduelle autres cellules forment des conglomérats et adhèrent au fond des récipients de culture (jour 1 dela Figure 1 a ). Du jour 7, cellules plates et allongées peuvent être observés. Toutefois, la contamination des autres, pour la plupart des cellules de sphéroïde, est encore visible (Figure 1 a jour 7). Ainsi, un nouveau cycle de CD31 positive sélection via<...

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Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Ce protocole décrit une technique de plate-forme pour isoler les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques. Ces cellules peuvent être utilisées, par exemple, pour obtenir d’autres informations sur les fonctions de la barrière musculaire du sang. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’il est possible d’isoler les cellules endothéliales microvasculaires primaires d’une grande pureté.Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies musculaires à base immunitaire telles que l’interaction entre les cellules musculaires et endothéliales dans la santé et la maladie. Tout d’abord, préparez toutes les solutions nécessaires et les plaques de six puits décrites dans le protocole. Pour commencer la procédure pratique, obtenez une paire de ciseaux pointus/émoussés chirurgicaux, une paire de ciseaux pointus/pointus chirurgicaux, et des forceps droits et incurvés.Désinfecter tous les instruments chirurgicaux avec 70% d’éthanol. Placez une souris mâle adulte euthanasié sur le dos et humidifiez les jambes avec 70% d’éthanol. À l’aide des ciseaux chirurgicaux pointus/contondants, couper chaque jambe entière en coupant à l’articulation de la hanche.Placer les extrémités dans un plat de culture cellulaire fermée. Transférer le plat dans une hotte stérile d’écoulement laminaire. Utilisez des ciseaux pointus et des forceps incurvés pour couper la peau ouverte de la hanche à l’extrémité de l’orteil.Utilisez les forceps droits pour tenir l’orteil ou la garniture de pied tout en utilisant les forceps incurvés pour peler la peau de l’orteil à la hanche. Pour isoler le musculus quadriceps femoris, couper le tendon du genou, et couper le muscle le long du fémur à la hanche. Couper le tendon d’Achille pour isoler le musculus triceps surae.Ensuite, couper le long du tibia à la fossa popliteal et enlever le muscle. Pour enlever les tendons qui ne peuvent pas être dissociés, maintenez les muscles avec les forceps incurvés et coupez chaque tendon approprié. Ajouter 2 445 microlitres de solution de digestion préparée à un plat frais et étiqueté de culture cellulaire et déterminer le poids.Transférez tous les morceaux musculaires dans ce plat. Ensuite, déterminez le poids. La différence des deux valeurs mesurées fournit le poids sec du tissu musculaire qui ne doit pas dépasser un gramme.À l’aide des ciseaux pointus chirurgicaux, couper tout le tissu musculaire en petits morceaux. Incuber la suspension tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 1,5 heure, en s’assurant de mélanger soigneusement la suspension avec une seringue à insuline d’un millilitre toutes les 20 minutes pendant environ cinq minutes. Après l’incubation, transférer la suspension dans une passoire en nylon de 70 micromètres placée sur un tube étiqueté de 50 millilitres et recueillir le débit à travers.Lavez la passoire cellulaire avec huit millilitres de DMEM et recueillez le flux à travers. Si les pièces branchent la passoire, réutilisez la solution dissociée. Jetez la passoire cellulaire et centrifugeuse la suspension à 300 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre d’un tampon de lysage de potassium de chlorure d’ammonium pour la lyse des globules rouges. Incuber à température ambiante pendant 30 secondes. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de DMEM contenant 10%FCS pour arrêter la réaction.Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une chambre de comptage des cellules Neubauer pour déterminer les numéros de cellule. Pour commencer à épuiser les cellules CD45 positives, centrifugez la suspension à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 90 microlitres de tampon MCS. Ajouter 10 microlitres de microbilles DE CD45 et mélanger la suspension. Incuber au réfrigérateur à 4 à 8 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après cela, ajouter un millilitre de tampon MCS. Centrifugeuse à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez complètement le supernatant et résuspendez les cellules dans 500 microlitres de tampon MCS.Placez une grande colonne magnétique dans le champ magnétique du séparateur. Rincez le réservoir de la colonne avec trois millilitres de tampon MCS. Ensuite, placez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne pour recueillir le flux à travers.Appliquez la suspension cellulaire entière sur la colonne et laissez-la couler complètement. Lavez la colonne trois fois en ajoutant trois millilitres de tampon MCS dans le réservoir pour chaque étape de lavage et en attendant que le réservoir de la colonne soit vide avant de commencer la prochaine étape de lavage. Recueillir les cellules non étiquetées en passant par la colonne pour une utilisation dans d’autres étapes de séparation.Pour commencer à accumuler des cellules CD31 positives, utilisez une chambre de comptage cellulaire Neubauer pour déterminer les numéros de cellules. Ensuite, centrifuger les cellules non étiquetées à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille dans 90 microlitres de tampon MCS.Ajouter 10 microlitres de microbilles DE CD31 et mélanger toute la suspension. Incuber au réfrigérateur à 4 à 8 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cela, ajouter un millilitre de tampon MCS et centrifugeuse à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Enlevez le supernatant et réutilisez les cellules dans 500 microlitres de tampon MCS. Placez la colonne magnétique moyenne dans le champ magnétique du séparateur. Rincez la colonne avec 500 microlitres de tampon MCS.Ensuite, placez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne pour recueillir le flux à travers. Appliquez toute la suspension cellulaire sur la colonne et laissez-la couler complètement à travers. Lavez la colonne trois fois en ajoutant 500 microlitres de tampon MCS dans le réservoir pour chaque étape de lavage, et attendez que le réservoir de la colonne soit vide avant de commencer la prochaine étape de lavage.Les cellules non étiquetées passant la colonne représentent la fraction CD45-négative, CD31-négative. Conservez-les pour d’autres contrôles de qualité. Ensuite, retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de collecte approprié.Pipette deux millilitres de tampon MCS sur la colonne. Poussez immédiatement le piston dans la colonne pour rincer les cellules étiquetées magnétiquement. Cette fraction CD45-négative, CD31-positive représente les CE murines primaires enrichies.Centrifuger la suspension cellulaire à 350 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez complètement le supernatant et résuspendez les cellules en un millilitre de milieu cellulaire endothélial. Transférer les cellules dans un seul puits d’une plaque de culture enduite de six puits contenant un millilitre de milieu cellulaire endothélial.Pour la culture, incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur stérile, en s’assurant de rafraîchir le milieu tous les deux à trois jours. Lorsque les cellules sont à 80 à 90% confluent, rincer chaque puits contenant des cellules deux fois avec deux millilitres de PBS en deux étapes consécutives de lavage. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de trypsine EDTA solution à chaque puits et couvez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur stérile pendant trois à cinq minutes.Après cela, ajouter 1200 microlitres de DMEM contenant au moins 10% FCS pour arrêter l’activité enzymatique. Centrifugeuse à 350 fois la gravité et à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, accumulez les cellules CD31 comme décrit précédemment pour augmenter la pureté.Utilisez un champ lumineux ou un microscope à contrat de phase standard avec grossissement de 20 % et ouverture numérique de l’objectif de 0,35 pour observer la confluence cellulaire. Dans cette étude, les cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires primaires de muscle squelettique de murine sont isolées. Un jour après l’isolement, les MOC murines primaires et les autres cellules résiduelles forment des conglomérats et adhèrent au fond des plats de culture.À partir du septième jour, on peut observer des cellules plates et allongées, mais la contamination d’autres cellules, principalement sphéroïdes, est encore visible. Ainsi, un autre cycle de sélection CD31-positif via MCS est nécessaire. Par la suite, les MOC murines primaires prolifèrent à une densité d’environ 80 à 90 % à la confluence, elles forment généralement un monocouche non superposé de cellules alignées longitudilement.La prolifération s’arrête à la confluence en raison de l’inhibition du contact. Le contrôle de la qualité par cytométrie de débit montre des valeurs à la fois pour la viabilité et la pureté allant d’environ 70% chacune pour les cellules immédiatement après l’isolement. Les cellules cultivées après une autre sélection CD31-positive via MCS montrent des valeurs satisfaisantes pour la pureté ainsi que pour la viabilité, allant jusqu’à 95% chacune.Les cellules obtenues sont ensuite étudiées pour l’expression génétique des gènes marqueurs cellulaires satellites musculaires jumelés protéine boîte 7 et M-cadhérine au niveau de l’ARNm par PCR quantitatif. Comme prévu, seules la fraction CD45-négative, CD31-négative ainsi que les cellules musculaires murines primaires différenciées ont exprimé la protéine de boîte 7 et M-cadhérine, tandis que CD45-négatif, CD31-positif et les MMC murines primaires sont négatifs pour ces marqueurs. Après la deuxième étape cd31 MCS, qPCR est utilisé pour évaluer l’expression des protéines de jonction serrées dans les MOC murines primaires confluentes.On voit des MMECs murines primaires exprimer des niveaux élevés de claudin-5, d’occludin, et d’occludens-1 de zonula, tandis que pmMC montrent seulement une faible expression de zonula occludens-1. Cette technique peut être effectuée en cinq à six heures. Suivant ce protocole, d’autres méthodes telles que des analyses de migration ou des expériences de stress à bas cisaillement peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler les cellules endothéliales microvasculaires primaires des muscles squelettiques par la mécanique et la dissociation enzymatique et le tri des cellules magnétiques.

Research

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Neuroscience

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