Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

この作品によって、「他 Kröner ・ フレゼニウス財団」を受けました (TR に 2018_A03)、"革新的なこの上海虹橋 (IMF) ミュンスター"(私-RU211811 TR) とドイツ研究振興協会 (DFG、INST 2105/27-1、私 3283/5-1、と私 3283/6-1 SGM に).イラスト画像は、平家 Blum によって提供されます。

すべての動物実験は自治体によって承認され、ドイツの動物福祉法 (84-02.05.20.13.097) に従って実施します。
1. 動物実験に関する総論
<ol><li>それぞれの施設の動物ケアのガイドラインに従ってすべてのマウスの実験を行い、委員会を使用します。</li>
	<li>実験動物科学連合 (FELASA) のための連合などの国際ガイドラインによると標準化された条件下でマウスを維持します。<b...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

微小血管内皮細胞は、すべての組織にバリア機能と関連臓器3疾患における機能不全成果を提供します。また、微小血管の EC の器官特定研究は新しい治療戦略の道を開く可能性があります。したがって、生理学的および病態生理学的条件下での微小血管の EC 機能のより深い理解は、偉大な科学的な関心です。白血球/血管内皮細胞の相互作用の変調はナタリズマブ、リンパ球...

酸素、基板、その他の必要な分子血流を介して細胞や臓器を納入します。このインターチェンジは、毛細血管、最小の容器で行われます。毛細血管は、その整合性のまま血管内と間質性スペース間筋恒常性の正常な調節の前提条件内部内皮細胞 (EC) レイヤーによって形成されます。可溶性因子や細胞の選択的な移行を確保するため、EC はタイトで相互接続された単分子膜と単接合1を構成します。栄養素や代謝産物のための障壁としての役割のほか、EC は白血球炎症のプロセスの募集を調節します。炎症や組織の損傷は、EC の表面と白血球の添付ファイルとターゲット組織2に移住を促進するケモカインの製造接着分子のアップレギュレーションにつながります。その結果、EC 批判的に病原体または組織の修復に対する防御など炎症性プロセスの調節に関与しています。
EC の機能不全は直接血管疾患、慢性腎機能障害、静脈血栓症深刻な病原体感染症に関連付けられています。さらに、EC 事実上常に糖尿病や多発性硬化症3など臓器特異免疫に関与しています。血流や臓器間バリア機能したがって、異なる種類の細胞の協調的相互作用によって制御されます。骨格筋血管内皮細胞 (MMEC) 一緒に筋細胞、線維芽細胞と血管形成機能ユニット、「myovascular ユニット」(MVU).したがって、機能不全、MVU は筋疾患の病態に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、これらの機構のより深い理解は依然行方不明、現在 myopathies の新しい、緊急に必要な治療標的の同定を排除します。
複雑な生理学的および病態生理学的メカニズムを調べるためには、動物モデルがよく使用されます。ただし、体外モデルは、さまざまな交絡因子を除外することによって関心の対象に焦点を当てることの利点を提供します。プロセスを調査するには、体外必要だ純粋な実行可能な一次電池を分離します。細胞株と対照をなしてトランスジェニック動物由来初代培養細胞は体外遺伝の修正の結果を調査する有効にします。
ここでは、プライマリ マウス MMEC を分離する方法は、機械と酵素の解離を磁気活性化細胞の浄化のための技術 (MCS) の並べ替え順を使用して説明します。この目的のため特定の表面マーカーに対して磁気ビーズを使用します。血小板内皮細胞接着分子-1 (PECAM1、CD31) EC の発現は、この型のセルを豊かに使用することができます。高い細胞純度を保証するには、造血起源の細胞は (PTPRC, CD45) 型受容体蛋白のチロシン脱燐酸化酵素 C の負の淘汰によって除外されます。さらに、品質管理、栽培プライマリ マウス MMEC、潜在的なアプリケーションの制限事項と注意事項が掲載されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

(筋微小血管内皮細胞、MMEC) 骨格筋毛細血管の内皮細胞が血流や水分、栄養素、感染に対する免疫応答の交換を規制する骨格筋の間の障壁を構築します。免疫細胞の移動を制御することによってエージェント。これらの関数を MMEC 形成機能「myovascular ユニット」(MVU) さら細胞の種類、線維芽細胞、血管、骨格筋細胞などと。その結果、MMEC したがって、MVU の機能不全は様々 な myopathies に貢献します。しかし、MMEC の健康および病気の制御機構の理解が不十分なまま、その解明 myopathies より特定の処置の前に。分離と、MVU のコンテキストでプライマリ MMEC 関数の詳細な調査は可能性がありますこれらのプロセスのよりよい理解を促進します。
この記事は、浄化と文化保守手順などを含む機械と酵素の解離によって骨格筋のプライマリ マウス MMEC を分離するプロトコルを提供します。

分離、プライマリ マウス MMEC と残留後 1 日他のセル コングロマリットを形成し、培養皿 (図 1 a 1 日目) の下部に付着します。7 日から平らで細長い細胞が観察できます。しかし、他、大抵回転楕円体セルの汚染はまだ目に見える (図 1 aの 7 日目)。したがって、CD31 正の選択を介してMCS は必要の別のサイクル。以下、...

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Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular ユニット」の包括的な生体外の調査。

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

このプロトコルは、骨格筋から微小血管内皮細胞を分離するプラットフォーム技術を記述する。これらの細胞は、例えば、血液筋関門機能に関するさらなる洞察を得るために使用することができる。既存の方法よりもこの技術の主な利点は、一次微小血管内皮細胞を高純度で単離することができるということです。この技術は、健康と病気における筋肉と内皮細胞との相互作用などの免疫媒介性筋疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立つ。まず、プロトコルに記載されているとおり、必要なすべてのソリューションと6ウェルプレートを準備します。実用的な手順を開始するには、外科的に鋭い/鈍いはさみ、外科用鋭い/鋭いはさみのペア、およびまっすぐおよび湾曲した鉗子のペアを得る。70%エタノールですべての手術器具を消毒します。背中に安楽死させた成人男性マウスを置き、70%エタノールで脚を湿らせた。鋭い/鈍い外科用はさみを使用して、股関節で切断することによって各脚全体を切断する。四肢を閉じた細胞培養皿に入れます。皿を無菌層流れフードに移します。鋭いはさみと湾曲した鉗子を使用して、腰からつま先の先端まで開いた皮膚を切り取ります。湾曲した鉗子を使用してつま先から股関節まで皮膚を剥がしながら、ストレート鉗子を使用してつま先または足パッドを保持します。筋骨格系の四頭筋を分離するには、膝から腱を切り、大腿骨に沿って筋肉を股関節に切断する。筋肉性三頭筋スラエを分離するためにアキレス腱を切断します。次に、脛素に沿って大きな窩に切り、筋肉を取り除きます。解離できない腱を取り除くために、湾曲した鉗子で筋肉を保持し、それぞれの適切な腱を切り落とす。2,445マイクロリットルの調製された消化液を新鮮なラベル付けされた細胞培養皿に加え、重量を決定します。この皿にすべての筋肉片を移します。次に、重量を決定する。両方の測定値の差は、1グラムを超えてはならない筋肉組織の乾燥重量を提供する。外科的な鋭いはさみを使用して、筋肉組織全体を小さく切る。37°Cで組織懸濁液を5%の二酸化炭素で1.5時間インキュベートし、20分ごとに1ミリリットルのインスリン注射器を約5分間慎重に混合します。インキュベーション後、50ミリリットルのラベル付きチューブに置かれた70マイクロメートルのナイロンストレーナーにサスペンションを移し、流れを通して集める。8ミリリットルのDMEMで細胞ストレーナーを洗い、流れを通して集める。破片がストレーナーを差し込んでいる場合は、解体溶液を再中断します。セルストレーナーを捨て、サスペンションを300倍の重力で、摂氏20度で10分間遠心分離します。上清を慎重に除去し、赤血球のリシスのための塩化アンモニウムカリウムライジングバッファーの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。室温で30秒間インキュベートします。次いで、反応を停止するために10%FCSを含むDMEMの9ミリリットルを加える。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。次に、ノイバウアー細胞計数チャンバーを使用して、細胞数を決定します。CD45陽性細胞の枯渇を開始するには、懸濁液を300倍の重力で、摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を完全に取り除き、90マイクロリットルのMCSバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。10マイクロリットルのCD45マイクロビーズを加え、懸濁液を混ぜます。冷蔵庫で摂氏4~8度で15分間インキュベートします。その後、1 ミリリットルの MCS バッファを追加します。300倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を完全に取り除き、500マイクロリットルのMCSバッファーで細胞を再懸濁します。大きな磁気カラムをセパレータの磁場に配置します。カラムの貯留部を3ミリリットルのMCSバッファーでリンスします。次に、15ミリリットルの円錐チューブを柱の下に置き、流れを集めます。列に全細胞懸濁液を塗布し、完全に流れてみましょう。各洗浄ステップの貯留層に3ミリリットルのMCSバッファーを加え、次の洗浄ステップを開始する前にカラムの貯蔵所が空になるまで待つことによって、カラムを3回洗浄します。さらに分離手順で使用するために、列を通過するラベルのないセルを収集します。CD31陽性細胞の蓄積を開始するには、Neubauer細胞計数チャンバーを使用して細胞数を決定します。その後、ラベルなしの細胞を重力の300倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を完全に取り除き、90マイクロリットルのMCSバッファーにペレットを再懸濁します。10マイクロリットルのCD31マイクロビーズを加え、懸濁液全体を混ぜます。冷蔵庫で摂氏4~8度で15分間インキュベートします。その後、300倍の重力でMCSバッファーと遠心分離機を1ミリリットル、摂氏4度で10分間加えます。上清を取り除き、500マイクロリットルのMCSバッファーで細胞を再懸濁します。セパレータの磁場に中磁気カラムを配置します。500マイクロリットルのMCSバッファでカラムをすすいでください。次に、15ミリリットルの円錐チューブを柱の下に置き、流れを集めます。セル全体の懸濁液を列に塗布し、完全に流れ込ませます。各洗浄工程のために500マイクロリットルのMCSバッファーをリザーバに加えてカラムを3回洗浄し、カラムの貯蔵所が空になるまで待ってから次の洗浄ステップを開始します。列を通過するラベルのないセルは、CD45 マイナス、CD31-負の分数を表します。さらに品質管理のためにそれらを保存します。次に、セパレータからカラムを取り出し、適切なコレクションチューブの上に置きます。柱にMCSバッファーのピペット2ミリリットル。すぐにプランジャーをカラムに押し込み、磁気標識されたセルをフラッシュします。この CD45 陰性、CD31 陽性の分数は、濃縮されたプライマリマウス IC を表します。細胞懸濁液を重力350倍、摂氏20度で5分間遠心分離する。上清を完全に取り除き、内皮細胞培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。1ミリリットルの内皮細胞培地を含むコーティングされた6ウェル培養プレートの単一のウェルに細胞を移す。培養の場合、無菌インキュベーターで5%の二酸化炭素を摂氏37度で培養し、2~3日ごとに培地をリフレッシュしてください。細胞が80〜90%合流のとき、2回連続した洗浄工程で2ミリリットルのPBSで細胞を2回含む各ウェルを洗い流す。その後、各ウェルに800マイクロリットルのトリプシンEDTA溶液を加え、3〜5分間無菌インキュベーターに5%の二酸化炭素を加えて摂氏37度でインキュベートします。この後、少なくとも10%FCSを含むDMEMの1,200マイクロリットルを加えて酵素活性を停止する。350倍の重力で遠心分離機、摂氏20度で5分間。次いで、先に述べたようにCD31細胞を蓄積し、純度を高める。20%倍率、0.35レンズの数値絞りを持つ明視野または標準位相収縮顕微鏡を使用して、細胞の合流を観察します。本研究では、原発性マウス骨格筋微小血管内皮細胞が単離されている。単離の翌日、原生マウスMMECsおよび残留細胞はコングロマリットを形成し、培養皿の底に付着する。7日目以降、平らで細長い細胞が観察されるが、他の大部分のスフェロイド細胞の汚染はまだ見える。したがって、MCSを介したCD31陽性選択の別のサイクルが必要である。以下、原生マウスMMECは、合流時に約80〜90%の密度に増殖し、それらは通常、縦方向に整列した細胞の非重なり合う単層を形成する。接触阻害により合流すると増殖が止まる。フローサイトメトリーによる品質管理は、分離直後の細胞に対してそれぞれ約70%の生存率と純度の両方の値を示しています。MCSを介して別のCD31陽性選択の後に培養された細胞は、純度と生存率に対する満足度を示し、それぞれ95%まで及ぶ。得られた細胞は、次に、mRNAレベルでのボックスプロテイン7およびM-カドヘリンを組み合わせた筋衛星細胞マーカー遺伝子の遺伝子発現について定量的PCRにより調べる。予想通り、CD45陰性、CD31陰性分数、ならびに分化した一次マウス筋細胞のみがボックスプロテイン7およびMカドヘリンを発現し、CD45陰性、CD31陽性および一次マウスMMECはこれらのマーカーに対して陰性である。第2CD31 MCSステップの後、qPCRはコンフルエントプライマリマウスMMECsにおけるタイトな接合タンパク質の発現を評価するために使用される。原発性マウスMMECは、クローディン-5、オクルジン、ゾヌラオクルデンス-1の高レベルを発現することが見られるのに対し、pmMCはゾヌラオクルデンス-1の低い発現しか示さなく見られる。この技術は5〜6時間で行うことができる。このプロトコルに従って、移行アッセイまたは低せん断応力実験のような他の方法は、追加の質問に答えるために行うことができる。このビデオを見た後, あなたは力学と酵素解離と磁気細胞のソートによって骨格筋から原発性微小血管内皮細胞を分離することができるはずです.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

ラット内側胃腸筋単一運動ユニットの機能的分離

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

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