Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo "mais Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 a TR), "Inovador Medizinische pesquisa (FMI) Münster" (I-RU211811 a TR) e Fundação de pesquisa alemã (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 e ME 3283/6-1 para SGM). Ilustrado imagens fornecidas por Heike Blum.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelas autoridades locais e realizados de acordo com a lei alemã de bem-estar animal (84-02.05.20.13.097).
1. general observações sobre experimentação Animal
<ol><li>Executar todos os experimentos de rato em conformidade com as orientações dos respectivos cuidados institucionais animais e usar o Comité.</li>
	<li>Manter os ratos sob condições padronizadas e de acordo com as diretrizes internacionais, como a Federação de associaçõ...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Células endoteliais microvasculares fornecem funções de barreira em todos os tecidos e seus resultados de disfunção na doença dos órgãos associados 3. Além disso, estudos de órgãos específicos da CE microvascular podem pavimentar o caminho para novas estratégias terapêuticas. Portanto, uma compreensão mais profunda da função microvascular de CE sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é de grande interesse científico. Modulação da interação dos leucócitos/endotéli...

Via corrente sanguínea, células e órgãos são fornecidos com oxigênio, substratos e outras moléculas necessárias. Este intercâmbio ocorre em capilares, vasos menores. Os capilares são formados por uma camada interna de células endoteliais (CE) cuja integridade continua a ser um pré-requisito para o sucesso regulação da homeostase do músculo entre o espaço intravascular e intersticial. Para garantir uma transição seletiva de células e fatores solúveis, CE constituem uma monocamada interligados por firme e aderente junções 1. Além de seu papel como barreira para nutrientes ou produtos metabólicos, CE regula o recrutamento de leucócitos em processos inflamatórios. Danos no tecido ou inflamação leva a uma regulação de moléculas de adesão na superfície do CE e produção de quimiocinas, facilitando a fixação dos leucócitos e transmigração no tecido alvo 2. Por conseguinte, CE criticamente estão envolvidos na regulação de processos inflamatórios, tais como a defesa contra patógenos ou reparação dos tecidos.
Uma disfunção da CE está diretamente associado com doenças vasculares, insuficiência renal crônica, infecções de patógeno grave de trombose venosa. Além disso, a CE praticamente sempre estão envolvidos em auto-imunidade órgão-específicas, tais como diabetes mellitus ou esclerose múltipla 3. A função de barreira entre o fluxo de sangue e órgãos, portanto, é controlada por uma interação concertada de diferentes tipos de células. As músculo esquelético microvascular células endoteliais (MMEC) juntamente com células musculares, fibroblastos e pericitos formam uma unidade funcional, a unidade de"myovascular" (MVU). Portanto, uma disfunção do MVU pode desempenhar um papel crítico na fisiopatologia de miopatias. No entanto, uma compreensão mais profunda desses mecanismos regulatórios ainda está desaparecida e atualmente impede a identificação dos alvos novos, urgentes, terapêuticos em miopatias.
Para investigar os complexos mecanismos fisiológicos e fisiopatológicos, modelos animais são comumente usados. No entanto, em vitro modelos oferecem a vantagem de focar o assunto de interesse, excluindo uma variedade de fatores de confundimento. Para investigar processos in-vitro é necessário isolar as células primárias puras e viáveis. Em contraste com linhas de células, as células primárias isoladas de animais transgénicos permitem para investigar as consequências das modificações genéticas in vitro.
Aqui, um método para isolar MMEC murino primário é descrito usando dissociação mecânica e enzimática, seguida por magnético celular ativado classificação técnicas (MCS) para a purificação. Para este efeito, grânulos magnéticos contra marcadores de superfície específicos são utilizados. Plaquetas células endoteliais adesão molécula-1 (PECAM1, CD31) manifesta-se principalmente na CE e pode ser usado para enriquecer este tipo de célula. Para garantir a pureza elevada célula, células de origem hematopoiética são excluídas por uma seleção negativa para proteína tirosina fosfatase receptor tipo C (PTPRC, CD45). Além disso, são apresentados os controles de qualidade, cultivo de primário MMEC murino, aplicações potenciais e limitações, bem como considerações especiais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

As células endoteliais dos capilares do músculo esquelético (músculo microvascular em células endoteliais, MMEC) construir a barreira entre a corrente sanguínea e músculos esqueléticos, regulamenta a troca de fluidos e nutrientes, bem como a resposta imune contra infecciosas agentes, controlando a migração celular imune. Para essas funções, MMEC formam um funcional "unidade de myovascular" (MVU), com mais tipos de células, como fibroblastos, pericitos e células do músculo esquelético. Por conseguinte, uma disfunção do MMEC e, portanto, o MVU contribui para uma vasta variedade de miopatias. No entanto, mecanismos reguladores do MMEC na saúde e na doença permanecem insuficientemente compreendidos e sua elucidação precede a tratamentos mais específicos para miopatias. O isolamento e a investigação aprofundada das principais funções do MMEC no contexto do MVU podem facilitar uma melhor compreensão destes processos.
Este artigo fornece um protocolo para isolar MMEC murino primária do músculo esquelético por dissociação mecânica e enzimática, incluindo a purificação e etapas de manutenção da cultura.

Um dia após o isolamento, MMEC murino primário e residual outras células formam conglomerados e aderirem ao fundo de pratos de cultura (figura 1A dia 1). Dia 7 em diante, podem ser observadas células alongadas e planas. No entanto, a contaminação de outras, principalmente as células de esferoide, é ainda visível (figura 1A dia 7). Assim, outro ciclo de CD31 positivo de seleção através de MCS é necessária. D...

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Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos (MMEC) forma a parede interna dos capilares musculares e regular a ambos, troca de fluidos/moléculas e migração de células (imunes) entre o tecido muscular e sangue. Isolamento de MMEC murino primário, conforme descrito aqui, permite investigações in vitro abrangentes da unidade"myovascular".

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Este protocolo descreve uma técnica de plataforma para isolar células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos. Essas células podem ser usadas, por exemplo, para obter mais insights sobre as funções da barreira muscular sanguínea. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que é possível isolar células endoteliais microvasculares primárias com alta pureza.Essa técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de doenças musculares imunomu medianas, como a interação entre células musculares e endoteliais na saúde e na doença. Primeiro, prepare todas as soluções necessárias e placas de seis poços, conforme descrito no protocolo. Para iniciar o procedimento prático, obtenha um par de tesouras cirúrgicas afiadas/contundentes, um par de tesouras cirúrgicas afiadas/afiadas e fórceps retos e curvados.Desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos com 70% de etanol. Posicione um rato macho adulto eutanizado nas costas e umedeça as pernas com 70% de etanol. Usando a tesoura cirúrgica afiada/contundente, corte cada perna inteira cortando a articulação do quadril.Coloque as extremidades em um prato de cultura celular fechada. Transfira o prato para um capô de fluxo laminar estéril. Use tesoura afiada e fórceps curvos para cortar a pele aberta do quadril até a ponta do dedo do dedo do dedo.Use os fórceps retos para segurar o dedo do pé ou a almofada do pé enquanto usa as fórceps curvas para descascar a pele do dedo do pé para o quadril. Para isolar o quadríceps musculus femoris, corte o tendão do joelho e corte o músculo ao longo do fêmur até o quadril. Corte o tendão de Aquiles para isolar o musculos tríceps surae.Em seguida, corte ao longo da tíbia para a fossa popliteal e remova o músculo. Para remover tendões que não podem ser dissociados, segure os músculos com os fórceps curvos e corte cada tendão apropriado. Adicione 2.445 microliters de solução de digestão preparada a um prato de cultura celular fresco e rotulado e determine o peso.Transfira todas as peças musculares para este prato. Então, determine o peso. A diferença de ambos os valores medidos proporciona o peso seco do tecido muscular que não deve exceder um grama.Usando a tesoura afiada cirúrgica, corte todo o tecido muscular em pequenos pedaços. Incubar a suspensão do tecido a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por 1,5 horas, certificando-se de misturar a suspensão cuidadosamente com uma seringa de insulina de um mililitro a cada 20 minutos por aproximadamente cinco minutos. Após a incubação, transfira a suspensão para um filtro de nylon de 70 micrômetros colocado em um tubo rotulado de 50 mililitros e colete o fluxo através.Lave o coador de células com oito mililitros de DMEM e colete o fluxo através. Se as peças estiverem conectando o coador, resuspense a solução dissociada. Descarte o coador de células e centrifugar a suspensão a 300 vezes a gravidade e a 20 graus Celsius por 10 minutos.Remova cuidadosamente o supernascer e resuspense a pelota de célula em um mililitro de um tampão de potássio de cloreto de amônio para a lise dos glóbulos vermelhos. Incubar em temperatura ambiente por 30 segundos. Em seguida, adicione nove mililitros de DMEM contendo 10% de FCS para parar a reação.Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, use uma câmara de contagem de células Neubauer para determinar os números das células. Para começar a esgotar as células CD45 positivas, centrifugar a suspensão a 300 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 10 minutos.Remova o supernatante completamente e resuspenja a pelota da célula em 90 microliters de buffer MCS. Adicione 10 microliters de microesferas CD45 e misture a suspensão. Incubar em uma geladeira a quatro a oito graus Celsius por 15 minutos.Depois disso, adicione um mililitro de buffer MCS. Centrífuga a 300 vezes a gravidade e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante completamente e resuspenja as células em 500 microliters de buffer MCS.Posicione uma grande coluna magnética no campo magnético do separador. Enxágüe o reservatório da coluna com três mililitros de tampão MCS. Em seguida, coloque um tubo cônico de 15 mililitros abaixo da coluna para coletar o fluxo através.Aplique toda a suspensão celular na coluna e deixe-a fluir completamente. Lave a coluna três vezes adicionando três mililitros de tampão MCS no reservatório para cada etapa de lavagem e esperando até que o reservatório da coluna esteja vazio antes de iniciar a próxima etapa de lavagem. Colete as células não rotuladas que passam pela coluna para uso em outras etapas de separação.Para começar a acumular células CD31 positivas, use uma câmara de contagem de células Neubauer para determinar os números de células. Depois, centrifugar as células sem rótulo a 300 vezes a gravidade e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante completamente e resuspenja a pelota em 90 microliters de buffer MCS.Adicione 10 microliters de microesferas CD31 e misture toda a suspensão. Incubar em uma geladeira a quatro a oito graus Celsius por 15 minutos. Depois disso, adicione um mililitro de tampão MCS e centrífuga a 300 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 10 minutos.Remova o supernatante e resuspenja as células em 500 microliters de buffer MCS. Posicione a coluna magnética média no campo magnético do separador. Enxágüe a coluna com 500 microliters de buffer MCS.Em seguida, coloque um tubo cônico de 15 mililitros abaixo da coluna para coletar o fluxo através. Aplique toda a suspensão celular na coluna e deixe fluir completamente. Lave a coluna três vezes adicionando 500 microliters de tampão MCS no reservatório para cada etapa de lavagem, e espere até que o reservatório da coluna esteja vazio antes de iniciar a próxima etapa de lavagem.As células sem rótulo que passam pela coluna representam a fração CD31-negativo cd31-negativo. Armazená-los para mais controles de qualidade. Em seguida, retire a coluna do separador e coloque-a em um tubo de coleta adequado.Pipeta dois mililitros de tampão MCS na coluna. Empurre imediatamente o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células magneticamente rotuladas. Esta fração CD45-negativa, CD31-positive representa as ECs murinas primárias enriquecidas.Centrifugar a suspensão celular a 350 vezes a gravidade e a 20 graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernatante completamente e resuspenque as células em um mililitro de meio celular endotelial. Transfira as células para um único poço de uma placa de cultura revestida de seis poços contendo um mililitro de meio celular endotelial.Para o cultivo, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora estéril, certificando-se de refrescar o meio a cada dois ou três dias. Quando as células estiverem em confluência de 80 a 90%, enxágue cada poço contendo células duas vezes com dois mililitros de PBS em duas etapas de lavagem consecutivas. Em seguida, adicione 800 microliters de solução EDTA de trippsina a cada poço e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora estéril por três a cinco minutos.Depois disso, adicione 1.200 microliters de DMEM contendo pelo menos 10% de FCS para parar a atividade enzimática. Centrífuga a 350 vezes a gravidade e a 20 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, acumule as células CD31 como descrito anteriormente para aumentar a pureza.Use um microscópio de contrato de campo brilhante ou fase padrão com ampliação de 20% e abertura numérica de 0,35 lentes para observar a confluência celular. Neste estudo, as células endoteliais microvasculares do músculo esquelético primário são isoladas. Um dia após o isolamento, mmecs murine primários e outras células residuais formam conglomerados e aderem ao fundo dos pratos culturais.A partir do sétimo dia, podem ser observadas células planas e alongadas, no entanto, a contaminação de outras células esferoides ainda é visível. Assim, é necessário outro ciclo de seleção cd31-positiva via MCS. A partir de agora, os MMECs murinos primários proliferam a uma densidade de aproximadamente 80 a 90% Após a confluência, eles normalmente formam uma monocamada não sobreposta de células longitudinaismente alinhadas.A proliferação pára na confluência devido à inibição do contato. O controle de qualidade via citometria de fluxo mostra valores para viabilidade e pureza que variam em torno de 70% cada para células imediatamente após o isolamento. As células cultivadas após outra seleção de CD31 positivo via MCS mostram valores satisfatórios para a pureza, bem como para a viabilidade, variando até 95% cada.As células obtidas são então investigadas para a expressão genética dos genes marcadores de células de satélite muscular emparelhados proteína caixa 7 e M-cadherin no nível mRNA por PCR quantitativo. Como esperado, apenas a fração CD45-negativa, CD31-negativo, bem como as células musculares murinas primárias diferenciadas expressas proteína da caixa 7 e M-cadherin, enquanto CD45-negativo, CD31-positivo e os MMECs murine primários são negativos para esses marcadores. Após a segunda etapa do CD31 MCS, o qPCR é usado para avaliar a expressão de proteínas de junção apertadas em MMECs murinas primárias confluentes.Os MMECs murine primários são vistos para expressar altos níveis de claudin-5, occludin e zonula occludens-1, enquanto o PMMC apenas mostra uma baixa expressão de oclludens de zonula-1. Esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas. Seguindo este protocolo, outros métodos, como ensaios migratórios ou experimentos de estresse de baixa tesoura podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar células endoteliais microvasculares primárias dos músculos esqueléticos por dissociação mecânica e enzimática e classificação de células magnéticas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Neurociência

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

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Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

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