Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана, «еще Kröner-Fresenius-Stiftung» (2018_A03 TR), «Инновационные Medizinische Тюрингия (МВФ) Münster» (I-RU211811 для TR) и Немецкий исследовательский фонд (DFG, INST 2105/27-1, меня 3283/5-1 и меня 3283/6-1 к SGM). Иллюстрированный изображения, предоставляемые Хайке Blum.

Все эксперименты на животных были утверждены местными властями и проведены согласно закону о немецких животных (84-02.05.20.13.097).
1. Общие замечания на эксперименты на животных
<ol><li>Выполните все мыши экспериментов в соответствии с руководящими принципами соответствующих ин...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Микроваскулярная эндотелиальные клетки обеспечивают барьерные функции во всех тканях и результаты их дисфункции в болезни ассоциированных органов 3. Кроме того орган конкретных исследования микрососудистой ЕС может проложить путь для новых терапевтических стратегий. Т?...

С кислородом, субстратов и других необходимых молекул поставляются через кровоток, клеток и органов. Этот обмен происходит в капиллярах, мельчайших сосудов. Капилляров образуются слоя внутренний эндотелиальных клеток (EC), целостность которого остается необходимым условием для успешного регуляции гомеостаза мышц между внутрисосудистого и интерстициального пространства. Для обеспечения выборочной переход клеток и растворимых факторов, ЕС составляют монослоя, плотно соединены и adherens соединения 1. Помимо своей роли как барьер для питательных веществ или продуктов метаболизма EC регулируют набор лейкоцитов при воспалительных процессах. Воспаление или ткани повреждение приводит к вверх регулирование молекул адгезии на поверхности EC и производство chemokines, содействия лейкоцита привязанность и переселение в целевой ткани 2. Следовательно ЕС критически участвуют в регуляции воспалительных процессов, таких как обороны против патогенов или восстановления тканей.
Дисфункция ЕС, непосредственно связанные с сосудистые заболевания, хроническая почечная недостаточность, тромбоз тяжелой возбудителя инфекции. Кроме того ЕС практически всегда участвуют в орган конкретных аутоиммунных заболеваний таких, как сахарный диабет или рассеянный склероз 3. Поэтому функцию барьера между поток крови и органов контролируется согласованного взаимодействия различных типов клеток. В скелетных мышцах микрососудистой эндотелиальных клеток (MMEC) вместе с мышечных клеток, фибробластов и pericytes образуют функциональный блок, «myovascular» (МВУ). Таким образом дисфункции МВУ может играть решающую роль в патофизиологии миопатий. Однако более глубокое понимание этих механизмов регулирования все еще отсутствует и в настоящее время препятствует выявлению новых, срочно необходимых, терапевтических целей в миопатий.
Для расследования сложных физиологических и патофизиологических механизмов, обычно используются Животные модели. Однако в пробирке модели предлагают преимущество сосредоточиться на предмет интереса, исключив различных смешанных факторов. Чтобы исследовать процессы в пробирке это необходимо изолировать чистой и жизнеспособных первичных элементов. В отличие от клеточных линий первичные элементы изолированы от трансгенных животных позволяют исследовать последствия генетических модификаций в пробирке.
Здесь метод, чтобы изолировать первичной мышиных MMEC описан с помощью механических и ферментативные диссоциации, следуют магнитные активированных клеток, сортировка методов (MCS) для очистки. Для этой цели используются магнитные шарики против конкретных поверхностных маркеров. Тромбоцитов эндотелиальных клеток адгезии молекулы-1 (PECAM1, CD31) выражается главным образом на ЕС и может использоваться для обогащения этого типа ячейки. Чтобы оправдать высокие ячейки чистоты, клеток кроветворных происхождения исключены негативный выбор для белка тирозинкиназы фосфатазы рецептор типа C (PTPRC, CD45). Кроме того контроль качества, культивирование первичного мышиных MMEC, потенциальные применения и ограничения, а также особые соображения представлены.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

Эндотелиальные клетки скелетной мускулатуры капилляров (микрососудистой эндотелиальных клеток мышц, MMEC) создать барьер между поток крови и скелетных мышц, регулирующий обмен жидкости и питательных веществ, а также иммунный ответ против инфекционных агенты, контролируя иммунные клетки миграции. Для выполнения этих функций, MMEC формируют функциональные «группа myovascular» (МВУ), с дальнейшей типов клеток, фибробластов, pericytes и скелетных мышечных клеток. Следовательно дисфункция MMEC и, следовательно, МВУ способствует разнообразие миопатий. Однако механизмы регулирования MMEC в здоровье и болезни по-прежнему недостаточно понятны и их разъяснение предшествует более конкретные лечения миопатии. Изоляции и углубленного исследования первичного MMEC функций в контексте МВУ может способствовать лучшему пониманию этих процессов.
Эта статья предоставляет протокол изолировать первичной мышиных MMEC скелетных мышц, механических и ферментативные диссоциации, включая очистки и культура обслуживания шаги.

Один день после изоляции, первичный мышиных MMEC и остаточного другие клетки образуют конгломераты и придерживаться нижней части культуры блюд (день 1рис. 1A ). С дня 7 могут наблюдаться плоские и удлиненные клетки. Однако, до сих пор виден загрязнением друг...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Микроваскулярная эндотелиальных клеток скелетных мышц (MMEC) форма внутренней стенки капилляров мышц и регулировать так, обмен жидкости/молекул и миграции клеток (иммунитет) между мышечной ткани и крови. Изоляция первичного мышиных MMEC, как описано здесь, позволяет всеобъемлющего в пробирке исследования группы «myovascular».

Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Этот протокол описывает технику платформы для изоляции микрососудистых эндотелиальных клеток от скелетных мышц. Эти клетки могут быть использованы, например, для получения дополнительной информации о функциях геммокбарьера. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами является то, что можно изолировать первичные микрососудистые эндотелиальные клетки с высокой чистотой.Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунной опосредованные заболевания мышц, такие как взаимодействие между мышцами и эндотелиальных клеток в области здравоохранения и болезней. Во-первых, подготовить все необходимые решения и шесть пластин, как описано в протоколе. Чтобы начать практическую процедуру, получить пару хирургических острых / тупые ножницы, пара хирургических острых / острых ножниц, и прямые и изогнутые типсы.Дезинфицировать все хирургические инструменты 70%этанолом. Распоить усыпанную взрослую мышеловку на спине и смочить ноги 70%этанолом. Используя острые / тупые хирургические ножницы, разорвать каждую всю ногу, разрезая на тазобедренном суставе.Поместите конечности в закрытом блюде клеточной культуры. Перенесите блюдо в стерильный ламинарный капюшон. Используйте острые ножницы и изогнутые типсы, чтобы разрезать кожу открытой от бедра до кончика носа.Используйте прямые типсы, чтобы держать ногу или ногу площадку при использовании изогнутых типсов, чтобы очистить кожу от ног до бедра. Чтобы изолировать мускул четырехглавой бедренной кости, вырезать сухожилие от колена, и разорвать мышцы вдоль бедренной кости до бедра. Разорвать ахиллово сухожилие, чтобы изолировать musculus трицепс суры.Далее, вырезать вдоль голени к popliteal fossa и удалить мышцы. Чтобы удалить сухожилия, которые не могут быть разобщены, удерживайте мышцы изогнутыми мипсами и отрежьте каждое соответствующее сухожилие. Добавьте 2, 445 микролитров подготовленного раствора пищеварения в свежее, помеченное блюдо клеточной культуры и определите вес.Перенесите все кусочки мышц на это блюдо. Затем определите вес. Разница обоих измеренных значений обеспечивает сухой вес мышечной ткани, который не должен превышать одного грамма.Используя хирургические острые ножницы, разрежьте всю мышечную ткань на мелкие кусочки. Инкубировать подвеску ткани при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 1,5 часов, убедившись, что тщательно смешивать суспензию с одноми миллилитровым инсулиновым шприцем каждые 20 минут в течение примерно пяти минут. После инкубации перенесите подвеску на 70-микрометровый нейлоновый ситечко, помещенное на 50-миллилитровую помеченную трубку, и соберите поток.Вымойте клеточный ситечко с восемью миллилитров DMEM и собирать поток до конца. Если части подключаются к ситечко, resuspend диссоциированный раствор. Отбросьте клеточный ситечко и центрифугу подвески при 300-м раз большей тяжести и при 20 градусах по Цельсию в течение 10 минут.Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в один миллилитр хлористого хлорида аммония для лиза для лиза красных кровяных телец. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 секунд. Затем добавьте девять миллилитров DMEM, содержащих 10%FCS, чтобы остановить реакцию.Перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку. Затем используйте камеру подсчета клеток Нойбауэра для определения номеров клеток. Чтобы начать истощать CD45-положительные клетки, центрифуга подвески при 300-м раз гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.Удалите супернатант полностью и повторно основой клеточной гранулы в 90 микролитров буфера MCS. Добавьте 10 микролитров микробаз CD45 и смешайте подвеску. Инкубировать в холодильнике при 4-8 градусах по Цельсию в течение 15 минут.После этого добавьте один миллилитр буфера MCS. Центрифуга при 300-времени гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант полностью и повторно наполнить клетки в 500 микролитров буфера MCS.Распоить большую магнитную колонку в магнитном поле сепаратора. Промыть резервуар колонны тремя миллилитров буфера MCS. Затем поместите 15-миллилитровую коническую трубку под столбец, чтобы собрать поток через.Нанесите всю ячейку подвески на колонку и дайте ей пройти полностью. Вымойте столбец три раза, добавив три миллилитров буфера MCS в резервуар для каждого шага стирки и ожидая, пока резервуар колонны пуст перед началом следующего шага стирки. Соберите неоцеличные ячейки, проходящие через столбец для использования в дальнейших шагах разделения.Чтобы начать накапливать CD31-положительные клетки, используйте камеру подсчета клеток Neubauer для определения числа клеток. После этого центрифугает неоцеличные клетки при 300-м раз большей гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант полностью и повторно помесить гранулы в 90 микролитров буфера MCS.Добавьте 10 микролитров микробаз CD31 и смешайте всю подвеску. Инкубировать в холодильнике при 4-8 градусах по Цельсию в течение 15 минут. После этого добавьте один миллилитр буфера MCS и центрифуги при 300-м раз большей гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в 500 микролитров буфера MCS. Распоить средний магнитный столб в магнитном поле сепаратора. Промыть столбец 500 микролитров буфера MCS.Затем поместите 15-миллилитровую коническую трубку под столбец, чтобы собрать поток через. Нанесите всю подвеску ячейки на столбец и дайте ей полностью протекать. Вымойте столбец три раза, добавив 500 микролитров буфера MCS в резервуар для каждого шага стирки, и подождите, пока резервуар столба пуст перед началом следующего шага стирки.Неоцеличные ячейки, проходящие мимо столбца, представляют собой CD45-отрицательную, CD31-отрицательную фракцию. Храните их для дальнейшего контроля качества. Затем снимите столбец с сепаратора и поместите его на подходящую трубку сбора.Пипетт два миллилитров буфера MCS на колонну. Немедленно нажмите поршень в столбец, чтобы промыть магнитно помеченные клетки. Эта CD45-отрицательная, CD31-положительная фракция представляет собой обогащенный первичный murine ECs.Центрифуга подвески клетки при 350-времени тяжести и при 20 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Удалить супернатант полностью и повторного перерасхода клеток в один миллилитр эндотелиальной клеточной среды. Перенесите клетки в один колодец покрытой пластиной культуры с шестью колодецами, содержащей один миллилитр эндотелиальной клеточной среды.Для выращивания, инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в стерильном инкубаторе, убедившись, что обновить средний каждые два-три дня. Когда клетки находятся на 80 до 90% слияния, промыть каждый хорошо содержащие клетки в два раза с двумя миллилитров PBS в два последовательных шагов стирки. Затем добавьте 800 микролитров раствора трипсина EDTA в каждую колодец и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%-ным углекислым газом в стерильном инкубаторе в течение трех-пяти минут.После этого добавьте 1200 микролитров DMEM, содержащих не менее 10% FCS, чтобы остановить энзиматические действия. Центрифуга при 350-времени гравитации и при 20 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем аккумулировать клетки CD31, как описано ранее, чтобы увеличить чистоту.Используйте яркое поле или стандартный фазовый контрактный микроскоп с 20%-ным увеличением и численной диафрагмой 0,35 объектива для наблюдения за слиянием клеток. В этом исследовании, первичные murine скелетных мышц микрососудистых эндотелиальных клеток изолированы. На следующий день после изоляции первичные мурин-ММЕКи и остаточные другие клетки образуют конгломераты и придерживаются дна культурных блюд.С седьмого дня можно наблюдать плоские и удлиненные клетки, однако, загрязнение других, в основном сфероидных клеток все еще видно. Таким образом, требуется еще один цикл CD31-положительного отбора через MCS. В дальнейшем первичные murine MMECs размножаются до плотности от 80 до 90%После слияния они обычно образуют некрывающийся монослой продольно выровненных клеток.Распространение прекращается при слиянии из-за ингибирования контакта. Контроль качества с помощью цитометрии потока показывает значения как жизнеспособности, так и чистоты в диапазоне около 70% для клеток сразу после изоляции. Клетки, культивируемые после другого CD31-положительного отбора через MCS, показывают удовлетворяющие значения для чистоты, а также для жизнеспособности, в диапазоне до 95%каждый.Полученные клетки затем исследованы для экспрессии генов маркера клеток мышцы спутниковых клеток в паре белка коробки 7 и M-кадерин на уровне мРНК по количественным ПЦР. Как и ожидалось, только CD45-отрицательный, CD31-отрицательная фракция, а также дифференцированные первичные мышечные клетки мурина выразили коробку белка 7 и M-кадерин, в то время как CD45-отрицательный, CD31-положительный и первичный мурин MMECs являются отрицательными для этих маркеров. После второго шага CD31 MCS, qPCR используется для оценки экспрессии плотных белков соединения в стечении первичных ММЕЦ.Первичные murine MMECs, как видно, выражают высокий уровень claudin-5, occludin, и zonula occludens-1, в то время как pmMC показывает только низкое выражение zonula occludens-1. Этот метод может быть выполнен в течение пяти-шести часов. Следуя этому протоколу, для ответа на дополнительные вопросы могут быть проведены другие методы, такие как анализ миграции или эксперименты с низким уровнем стресса.После просмотра этого видео, вы должны быть в состоянии изолировать первичные микрососудистые эндотелиальные клетки от скелетных мышц механика и энзиматической диссоциации и магнитной сортировки клеток.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Парные Patch Clamp Recordings от Мотор-нейрон и целевые скелетных мышц в данио рерио

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Генерация увековечен мышиного мозга микрососудистой эндотелиальной клеточной линии, как<em&gt; In Vitro</em&gt; Гематоэнцефалический барьер модели

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Выделение Первичная мышиный Brain Микрососудистой эндотелиальных клеток

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Оценка Биоэнергетической функции в церебральный эндотелиальных клеток сосудов

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Функциональная изоляция однодвигательных агрегатов крысиных медиальных мышц гастроконемиуса

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Вывод, Расширение, Криоконсервация и Характеристика микрососудистых эндотелиальных клеток мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Рассечение волокон одиночных скелетных мышц для иммунофлуоресцентного и морфометрического анализа цельномышечных соединений

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...