Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el "Else Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 TR), "Innovative Medizinische Forschung (FMI) Münster" (I-RU211811 a TR) y la Fundación alemana de investigación (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 y ME 3283/6-1 a las SGM). Ilustrado imágenes proporcionadas por Heike Blum.

Todos los experimentos en animales eran aprobados por las autoridades locales y llevó a cabo conforme a la ley de bienestar animal alemán (84-02.05.20.13.097).
1. general observaciones en animales de experimentación
<ol><li>Todos los experimentos de ratón siguiendo las directrices de la respectiva atención animal institucional y Comité.</li>
	<li>Mantener los ratones en condiciones estandarizadas y de acuerdo con las normas internacionales como la Federación de laboratorio animales ci...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Las células endoteliales microvasculares proporcionan funciones de barrera en todos los tejidos y los resultados de la disfunción en la enfermedad de los órganos asociados 3. Por otra parte, estudios de órgano-específicas de la CE microvascular podrían allanar el camino para nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, una comprensión más profunda de la función microvascular de CE bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es de gran interés científico. Modulación de la inte...

Órganos, células y a través de torrente sanguíneo están provistos de oxígeno, substratos y otras moléculas necesarias. Este intercambio tiene lugar en los capilares, los vasos más pequeños. Los capilares están formados por una capa interna células endoteliales (CE), cuya integridad es un pre-requisito para la exitosa regulación de la homeostasis del músculo entre el espacio intravascular e intersticial. Para asegurar una transición selectiva de células y factores solubles, CE constituyen un monocapa interconectados por apretada y de las ensambladuras de los adherens 1. Además de su papel como barrera para alimentos o productos metabólicos, CE regular el reclutamiento de leucocitos en los procesos inflamatorios. Inflamación o tejido daños conduce a una para arriba-regulación de moléculas de adhesión en la superficie de la CE y la producción de quimiocinas facilitando el apego del leucocito y transmigración en los tejidos de destino 2. En consecuencia, CE están implicados críticamente en la regulación de procesos inflamatorios como la defensa contra agentes patógenos o reparación de los tejidos.
Una disfunción de la CE está directamente asociada con enfermedades vasculares, la insuficiencia renal crónica, trombosis venosa grave patógeno infecciones. Además, CE casi siempre están implicadas en autoinmunidad órgano-específicas como diabetes mellitus o esclerosis múltiple 3. La función de barrera entre la sangre y órganos por lo tanto es controlada por una interacción concertada de diferentes tipos de células. En el músculo esquelético microvascular células endoteliales (MMEC) junto con las células musculares, fibroblastos y pericitos forman una unidad funcional, la "unidad myovascular" (MVU). Por lo tanto, una disfunción de la MVU pudo desempeñar un papel fundamental en la fisiopatología de las Miopatías. Sin embargo, una comprensión más profunda de estos mecanismos reguladores todavía falta y actualmente imposibilita la identificación de objetivos nuevos, urgentes, terapéuticos en las Miopatías.
Para investigar los mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos complejos, se utilizan modelos animales. Sin embargo, en vitro modelos ofrecen la ventaja de centrarse en el tema de interés mediante la exclusión de una gran variedad de factores de confusión. Para investigar los procesos in vitro es necesario aislar células primaria puras y viables. En contraste con las líneas celulares, células primarias aisladas de animales transgénicos permiten investigar las consecuencias de modificaciones genéticas in vitro.
Aquí, un método para aislar primaria MMEC murino se describe mediante el uso de disociación mecánica y enzimática, seguida de magnético celular activado clasificación técnicas (MCS) para la purificación. Para ello, se utilizan granos magnéticos contra marcadores de superficie específicos. Plaquetas endotelial de la célula molécula 1 de adhesión (PECAM1, CD31) se expresa principalmente en el CE y se puede utilizar para enriquecer este tipo celular. Para garantizar la pureza alta de la célula, las células de origen hematopoyético son excluidas por una selección negativa para la proteína tirosina fosfatasa receptor tipo C (PTPRC, CD45). Además, se presentan los controles de calidad, el cultivo de primaria MMEC murino, aplicaciones potenciales y limitaciones, así como consideraciones especiales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

Las células endoteliales de capilares del músculo esquelético (músculo microvascular las células endoteliales, MMEC) construcción la barrera entre la sangre y los músculos esqueléticos que regula el intercambio de fluidos y nutrientes así como la respuesta inmune contra infecciosas agentes de control de la migración de células inmunes. Para estas funciones, forman un funcional MMEC "unidad myovascular" (MVU), con más tipos de células, como fibroblastos y pericitos, células del músculo esquelético. Por lo tanto, una disfunción de MMEC y por lo tanto la MVU contribuye a una gran variedad de miopatías. Sin embargo, mecanismos de MMEC en la salud y la enfermedad siguen siendo insuficientemente comprendidos y su elucidación precede a tratamientos más específicos para miopatías. El aislamiento y la investigación en profundidad de funciones primarias de MMEC en el contexto de la MVU podrían facilitar una mejor comprensión de estos procesos.
Este artículo proporciona un protocolo para aislar MMEC murino primaria del músculo esquelético por la disociación mecánica y enzimática, incluyendo purificación y pasos de mantenimiento de la cultura.

Un día después de aislamiento, principal MMEC murino y residual otras células forman conglomerados y se adhieren a la parte inferior de los platos de la cultura (figura 1A día 1). Del día 7, se pueden observar células alargadas y planas. Sin embargo, la contaminación de otros, sobre todo células del esferoide, es aún visible (figura 1A día 7). Así, otro ciclo de CD31 positiva selección vía MCS se requiere. E...

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Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la "unidad myovascular".

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Este protocolo describe una técnica de plataforma para aislar las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos. Estas células se pueden utilizar, por ejemplo, para obtener más información sobre las funciones de barrera muscular en la sangre. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que es posible aislar células endoteliales microvasculares primarias con alta pureza.Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades musculares mediadas por el sistema inmunitario, como la interacción entre el músculo y las células endoteliales en la salud y la enfermedad. En primer lugar, prepare todas las soluciones necesarias y placas de seis pozos como se describe en el protocolo. Para comenzar el procedimiento práctico, obtenga un par de tijeras quirúrgicas afiladas/contundentes, un par de tijeras quirúrgicas afiladas/afiladas, y fórceps rectos y curvos.Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos con 70% de etanol. Coloque un ratón macho adulto eutanizado en su espalda y humedezca las piernas con 70% de etanol. Usando las tijeras quirúrgicas afiladas/contundentes, corta cada pierna entera cortando en la articulación de la cadera.Coloque las extremidades en un plato de cultivo celular cerrado. Transfiera el plato a una capucha de flujo laminar estéril. Usa tijeras afiladas y fórceps curvos para cortar la piel abierta desde la cadera hasta la punta del dedo del pie.Usa los fórceps rectos para sostener la almohadilla del dedo del pie o del pie mientras usas los fórceps curvos para pelar la piel desde el dedo del pie hasta la cadera. Para aislar el musculus cuádriceps femoris, cortar el tendón de la rodilla, y cortar el músculo a lo largo del fémur a la cadera. Cortar el tendón de Aquiles para aislar el musculus tríceps surae.A continuación, corta a lo largo de la tibia a la fosa popliteal y elimina el músculo. Para eliminar los tendones que no se pueden disociar, sostenga los músculos con los fórceps curvos y corte cada tendón apropiado. Agregue 2, 445 microlitros de solución de digestión preparada a un plato de cultivo celular fresco y etiquetado y determine el peso.Transfiera todas las piezas musculares a este plato. A continuación, determine el peso. La diferencia de ambos valores medidos proporciona el peso seco del tejido muscular que no debe exceder un gramo.Usando las tijeras afiladas quirúrgicas, corta todo el tejido muscular en trozos pequeños. Incubar la suspensión tisular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 1,5 horas, asegurándose de mezclar la suspensión cuidadosamente con una jeringa de insulina de un mililitro cada 20 minutos durante aproximadamente cinco minutos. Después de la incubación, transfiera la suspensión a un colador de nylon de 70 micrómetros colocado en un tubo etiquetado de 50 mililitros y recoja el flujo a través.Lavar el colador celular con ocho mililitros de DMEM y recoger el flujo a través. Si las piezas están enchufando el colador, resuspender la solución disociada. Deseche el colador celular y centrifugar la suspensión a 300 veces la gravedad y a 20 grados Celsius durante 10 minutos.Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspendir el gránulo celular en un mililitro de un tampón de alálisis de potasio de cloruro de amonio para la lysis de los glóbulos rojos. Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos. A continuación, agregue nueve mililitros de DMEM que contengan 10%FCS para detener la reacción.Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Luego, utilice una cámara de conteo de células Neubauer para determinar los números de celda. Para comenzar a agotar las células CD45 positivas, centrifugar la suspensión a 300 veces la gravedad y a cuatro grados celsius durante 10 minutos.Retire el sobrenadante por completo y resuspendir el pellet celular en 90 microlitros de tampón MCS. Añadir 10 microlitros de microperlas CD45 y mezclar la suspensión. Incubar en un refrigerador de cuatro a ocho grados centígrados durante 15 minutos.Después de esto, agregue un mililitro del buffer MCS. Centrifugar a 300 veces la gravedad y a cuatro grados celsius durante 10 minutos. Retire el sobrenadante completamente y resusppend las células en 500 microlitros del búfer MCS.Coloque una columna magnética grande en el campo magnético del separador. Enjuague el depósito de la columna con tres mililitros de tampón MCS. A continuación, coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna para recoger el flujo a través.Aplique toda la suspensión de celda a la columna y déjela fluir completamente. Lave la columna tres veces añadiendo tres mililitros de tampón MCS en el depósito para cada paso de lavado y esperando hasta que el depósito de la columna esté vacío antes de comenzar el siguiente paso de lavado. Recoja las celdas sin etiquetar que pasan a través de la columna para usarlas en pasos de separación adicionales.Para comenzar a acumular células CD31 positivas, utilice una cámara de conteo de células Neubauer para determinar los números de celda. Después, centrifugar las células sin etiquetar a 300 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante por completo y resusppend el pellet en 90 microlitros de tampón MCS.Añadir 10 microlitros de microperlas CD31 y mezclar toda la suspensión. Incubar en un refrigerador de cuatro a ocho grados centígrados durante 15 minutos. Después de esto, agregue un mililitro de tampón MCS y centrífuga a 300 veces la gravedad y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Retire el sobrenadante y resusppend las células en 500 microlitros del búfer MCS. Coloque la columna magnética media en el campo magnético del separador. Enjuague la columna con 500 microlitros de tampón MCS.A continuación, coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna para recoger el flujo a través. Aplique toda la suspensión de celda en la columna y déjela fluir completamente. Lave la columna tres veces añadiendo 500 microlitros de tampón MCS en el depósito para cada paso de lavado, y espere hasta que el depósito de la columna esté vacío antes de comenzar el siguiente paso de lavado.Las celdas sin etiquetar que pasan la columna representan la fracción CD45-negativa, CD31-negativa. Guárdelos para más controles de calidad. A continuación, retire la columna del separador y colóquela en un tubo de recogida adecuado.Pipetear dos mililitros de búfer MCS en la columna. Empuje inmediatamente el émbolo en la columna para vaciar las celdas etiquetadas magnéticamente. Esta fracción CD45-negativa, CD31-positiva representa los CE primarios murinas enriquecidos.Centrifugar la suspensión celular a 350 veces la gravedad y a 20 grados celsius durante cinco minutos. Retire el sobrenadante por completo y resuspendir las células en un mililitro de medio celular endotelial. Transfiera las células a un solo pozo de una placa de cultivo recubierta de seis pozos que contenga un mililitro de medio celular endotelial.Para el cultivo, incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora estéril, asegurándose de refrescar el medio cada dos o tres días. Cuando las células estén a una confluencia de 80 a 90%, enjuague cada bien con las células dos veces con dos mililitros de PBS en dos pasos de lavado consecutivos. A continuación, agregue 800 microlitros de solución de trippsina EDTA a cada pozo e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora estéril durante tres a cinco minutos.Después de esto, agregue 1.200 microlitros de DMEM que contengan al menos 10%FCS para detener la actividad enzimática. Centrifugar a 350 veces la gravedad y a 20 grados celsius durante cinco minutos. Luego, acumule las células CD31 como se describió anteriormente para aumentar la pureza.Utilice un microscopio de contrato de campo brillante o de fase estándar con un aumento del 20% y una apertura numérica de lente de 0,35 para observar la confluencia celular. En este estudio, se aíslan las células endoteliales microvasculares del músculo esquelético murino primario. Un día después del aislamiento, las MMET murinas primarias y otras células residuales forman conglomerados y se adhieren al fondo de los platos de cultivo.Desde el séptimo día en adelante, se pueden observar células planas y alargadas, sin embargo, la contaminación de otras células esferoides, en su mayoría sigue siendo visible. Por lo tanto, se requiere otro ciclo de selección CD31-positiva a través de MCS. A partir de ahora, las MMEr murinas primarias proliferan a una densidad de aproximadamente 80 a 90% Tras la confluencia, por lo general forman una monocapa no superpuesta de células alineadas longitudinalmente.La proliferación se detiene tras la confluencia debido a la inhibición del contacto. El control de calidad a través de la citometría de flujo muestra valores de viabilidad y pureza que oscilan alrededor del 70% cada uno para las células inmediatamente después del aislamiento. Las células cultivadas después de otra selección CD31-positiva a través de MCS muestran valores satisfactorios para la pureza, así como para la viabilidad, que van hasta 95% cada una.A continuación, se investigan las células obtenidas para la expresión génica de los genes marcadores de células del satélite muscular emparejados con la proteína de caja 7 y la M-cadherina a nivel de ARNm por PCR cuantitativo. Como era de esperar, sólo la fracción CD45 negativa, CD31-negativa, así como las células musculares murinas primarias diferenciadas expresaron proteína de caja 7 y M-cadherina, mientras que CD45 negativo, CD31 positivo y los MMET murinos primarios son negativos para estos marcadores. Después del segundo paso CD31 MCS, qPCR se utiliza para evaluar la expresión de proteínas de unión estrecha en MMEC murinas primarias confluentes.Se observa que las MMET murinas primarias expresan altos niveles de claudin-5, ocludina y zonula ocludens-1, mientras que pmMC solo muestra una expresión baja de zonula ocludens-1. Esta técnica se puede realizar en cinco a seis horas. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar otros métodos como los ensayos de migración o los experimentos de tensión de bajo cizallamiento para responder preguntas adicionales.Después de ver este video, usted debe ser capaz de aislar las células endoteliales microvasculares primarias de los músculos esqueléticos por disociación mecánica y enzimática y clasificación de células magnéticas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

Neurociencias

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