Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Detta arbete fick stöd av den ”annat Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 i TR), ”innovativa Medizinische Forschung (IMF) Münster” (I-RU211811 till TR) och tyska Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, mig 3283/5-1, och mig 3283/6-1 till SGM). Illustrerade bilder som tillhandahålls av Heike Blum.

Alla djurförsök godkändes av de lokala myndigheterna och bedrivs enligt lagen om tyska djurskydd (84-02.05.20.13.097).
1. allmänna kommentarer om djurförsök
<ol><li>Utföra alla musen experiment i enlighet med riktlinjerna i de respektive institutionella Djurvård och använda kommittén.</li>
	<li>Hålla möss under standardiserade förhållanden och enligt internationella riktlinjer såsom federationen för Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Obs: Den...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Mikrovaskulära endotelceller ge barriär funktioner i alla vävnader och deras dysfunktion resultat vid sjukdom av associerade organ 3. Dessutom kunde organ-specifika studier av mikrovaskulära EG bana väg för nya terapeutiska strategier. En djupare förståelse för mikrovaskulära EG funktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden är därför av stort vetenskapligt intresse. Modulering av leukocyter/endotel interaktion används framgångsrikt att behandla multipel skleros pat...

Via blodbanan, celler och organ levereras med syre, substrat och andra nödvändiga molekyler. Detta utbyte sker i kapillärerna, de minsta kärlen. Kapillärer bildas genom ett inre endotelceller (EG) lager vars integritet är fortfarande en förutsättning för framgångsrik reglering av muskel homeostas mellan det intravaskulära och interstitiell utrymmet. För att säkerställa en selektiv övergång av lösliga faktorer och celler, EG utgör en enskiktslager sammankopplade med tight och adherens föreningspunkter 1. Förutom sin roll som barriär för näringsämnen eller metaboliska produkter reglera EG rekrytering av leukocyter i inflammatoriska processer. Inflammation eller vävnad skada leder till en Uppregleringen av adhesionsmolekyler på EG ytan och produktion av kemokinerna underlätta leukocyt fastsättning och själavandring in i målet vävnad 2. EG är därför kritiskt involverade i regleringen av inflammatoriska processer såsom försvar mot patogener eller vävnad reparera.
En dysfunktion i EG är direkt associerade med vaskulära sjukdomar, kronisk njursvikt, venös trombos svår patogen infektioner. EG är dessutom nästan alltid involverade i organ-specifika autoimmunitet såsom diabetes mellitus eller multipel skleros 3. Barriärfunktionen mellan blodet och organ styrs därför av ett samordnat samspel av olika celltyper. I skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller (MMEC) tillsammans med muskelceller, fibroblaster och pericyter bildar en funktionell enhet, enhetens ”myovascular” (MVU). Därför kan en dysfunktion i MVU spelar en avgörande roll i patofysiologin bakom myopatier. Dock en djupare förståelse för dessa reglerande mekanismer saknas fortfarande och för närvarande utgör hinder för identifiering av nya, brådskande, terapeutiska mål i myopatier.
För att undersöka de komplexa fysiologiska och patofysiologiska mekanismerna, används djurmodeller ofta. In vitro- modeller erbjuder emellertid fördelen att fokusera på föremål för intresse genom att utesluta en mängd störfaktorer. För att undersöka processer in vitro-är det nödvändigt att isolera ren och livskraftig primära celler. I motsats till cellinjer aktivera primära celler isolerade från transgena djur för att undersöka konsekvenserna av genetiska modifieringar in vitro.
Här beskrivs en metod för att isolera primära murina MMEC med hjälp av mekaniska och enzymatisk dissociation följt av magnetiska aktiverad cell sortering tekniker (MCS) för rening. För detta ändamål används magnetiska pärlor mot specifika yta markörer. Trombocytantal endothelial celladhesionsmolekyl-1 (PECAM1, CD31) uttrycks huvudsakligen på EG och kan användas för att berika denna celltyp. För att garantera hög cell renhet, utesluts celler av hematopoetiska ursprung som ett negativt urval för protein tyrosin fosfatas receptor typ C (PTPRC, CD45). Ytterligare, kvalitetskontroller, odling av primära murina MMEC, potentiella tillämpningar samt begränsningar och särskilda överväganden presenteras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

Endotelceller i skelettmuskulaturen kapillärerna (muskel mikrovaskulära endotelceller, MMEC) bygga upp barriären mellan blodet och skelettmuskulaturen reglerar utbyte av vätskor och näringsämnen samt immunsvaret mot smittsamma agenter genom att kontrollera immunceller migration. För dessa funktioner, MMEC bildar en funktionell ”myovascular unit” (MVU), med ytterligare celltyper, såsom fibroblaster, pericyter och skelettmuskel celler. Följaktligen, en dysfunktion i MMEC och därför MVU bidrar till en stor mängd myopatier. Dock regleringsmekanismer av MMEC i hälsa och sjukdom förbli otillräckligt förstådda och deras klargörande föregår mer specifika behandlingar för myopatier. Isolering och djupgående utredning av primära MMEC funktioner i samband med MVU kan underlätta en bättre förståelse av dessa processer.
Denna artikel tillhandahåller ett protokoll för att identifiera primära murina MMEC av skelettmuskulaturen med mekaniska och enzymatisk dissociation inklusive rening och kultur underhåll steg.

En dag efter isolering, primära murina MMEC och resterande andra celler bildar konglomerat och följa botten av kultur rätter (figur 1A dag 1). Från dag 7, kan platt och långsträckta celler observeras. Kontaminering av andra, mestadels sfäroid celler, är dock fortfarande synliga (figur 1A dag 7). Således, en annan cykel av CD31 positiva urval via MCS krävs. Härefter, primära murina MMEC föröka till en densit...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Mikrovaskulära endotelceller i skelettmuskulaturen (MMEC) forma den inre väggen av muskel kapillärer och reglera båda, utbyte av vätskor/molekyler och migration av (immunceller) mellan muskelvävnad och blod. Isolering av primära murina MMEC, kan som beskrivs här, omfattande in vitro-undersökningar av enheten ”myovascular”.

Isolering av primära murina skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Detta protokoll beskriver en plattform teknik för att isolera microvascular endotelceller från skelettmuskulaturen. Dessa celler kan användas, till exempel, för att få ytterligare insikter i blod muskelbarriären funktioner. Den största fördelen med denna teknik jämfört med befintliga metoder är att det är möjligt att isolera primära mikrovaskulära endotelceller med hög renhet.Denna teknik kan bidra till att besvara viktiga frågor inom området immunmedierade muskelsjukdomar såsom samspelet mellan muskel- och endotelceller i hälsa och sjukdom. Först förbereda alla nödvändiga lösningar och sex-well plattor som beskrivs i protokollet. Till att börja det praktiska förfarandet, erhålla ett par kirurgiska skarpa / trubbig sax, ett par kirurgiska skarpa / vassa saxar, och raka och böjda tång.Desinficera alla kirurgiska instrument med 70%etanol. Placera en avlivad vuxen manlig mus på ryggen och fukta benen med 70%etanol. Med hjälp av den vassa/ trubbiga operationssaxen, skär varje helt ben genom att skära vid höftleden.Placera extremiteterna i en sluten cell kultur maträtt. Överför skålen till en steril laminär flödeshuva. Använd vass sax och böjda forceps för att skära huden öppen från höften till tåspetsen.Använd de raka tångarna för att hålla i tå- eller fotdynan medan du använder de böjda tången för att skala av huden från tången till höften. För att isolera muskulos quadriceps femoris, skär senan från knäet, och bryta muskeln längs lårbenet till höften. Sever achilles senan att isolera musculus triceps sura.Därefter skär längs skenbenet till popliteal fossa och ta bort muskeln. För att ta bort senor som inte kan separeras, håll musklerna med de böjda tlystnorna och skär av varje lämplig sena. Lägg till 2, 445 mikroliter av beredd matsmältningslösning till en fräsch, märkt cellodlingsfat och bestäm vikten.Överför alla muskelbitar till denna maträtt. Sedan, bestämma vikten. Skillnaden av båda uppmätta värden ger torrvikten på muskelvävnaden som inte får överstiga ett gram.Med hjälp av den kirurgiska vassa saxen, skär hela muskelvävnaden i små bitar. Inkubera vävnadsupphängningen i 37 grader Celsius med 5 %koldioxid i 1,5 timmar, och se till att blanda suspensionen försiktigt med en en milliliter insulinspruta var 20:e minut i ungefär fem minuter. Efter inkubationen, överför suspensionen till en 70-mikrometer nylon sil placeras på en 50-milliliter märkt rör och samla flödet genom.Tvätta cellsilen med åtta milliliter DMEM och samla in flödet igenom. Om bitarna pluggar silen, resuspend den dissociated lösningen. Kasta cellsilen och centrifugera suspensionen vid 300 gånger gravitation och vid 20 grader Celsius i 10 minuter.Avlägsna försiktigt supernatanten och resuspend cellpelleten i en milliliter av en ammoniumkloridkaliumlysningsbuffert för lys av röda blodkroppar. Inkubera i rumstemperatur i 30 sekunder. Sedan lägger du till nio milliliter DMEM som innehåller 10% FCS för att stoppa reaktionen.Överför cellupphängningen till ett 15-milliliterrör. Sedan använder en Neubauer cell räkna kammare för att bestämma cellen tal. För att börja tömma DE CD45-positiva cellerna centrifuger suspensionen vid 300 gånger gravitation och vid fyra grader Celsius i 10 minuter.Ta bort supernatanten helt och resuspend cell pelleten i 90 mikroliter av MCS buffert. Tillsätt 10 mikroliter av CD45 mikropärlor och blanda upphängningen. Inkubera i ett kylskåp vid fyra till åtta grader Celsius i 15 minuter.Efter detta lägger du till en milliliter MCS-buffert. Centrifugera vid 300 gånger gravitation och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Ta bort supernatanten helt och resuspend cellerna i 500 mikroliter av MCS buffert.Placera en stor magnetisk kolumn i avgränsarens magnetfält. Skölj spaltens reservoar med tre milliliter MCS-buffert. Placera sedan ett koniskt rör på 15 milliliter under kolonnen för att samla in flödet genom.Applicera hela cellupphängningen på kolonnen och låt den flöda igenom helt. Tvätta kolonnen tre gånger genom att lägga till tre milliliter MCS-buffert i reservoaren för varje tvättsteg och vänta tills kolonnens reservoar är tom innan nästa tvättsteg påbörjas. Samla in de omärkta cellerna som passerar genom kolumnen för användning i ytterligare separationssteg.Om du vill börja ackumulera CD31-positiva celler använder du en Neubauer cellräkningskammare för att bestämma cellnumren. Efteråt centrifug de omärkta cellerna vid 300 gånger gravitation och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Ta bort supernatanten helt och resuspend pelleten i 90 mikroliter av MCS buffert.Tillsätt 10 mikroliter av CD31 mikropärlor och blanda hela suspensionen. Inkubera i ett kylskåp vid fyra till åtta grader Celsius i 15 minuter. Efter detta, tillsätt en milliliter MCS buffert och centrifug vid 300 gånger gravitation och vid fyra grader Celsius i 10 minuter.Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i 500 mikroliter av MCS buffert. Placera den medelstora magnetiska kolumnen i avgränsarens magnetfält. Skölj kolonnen med 500 mikroliter av MCS-buffert.Därefter placerar du ett 15-milliliter koniskt rör under kolonnen för att samla in flödet genom. Applicera hela cellupphängningen på kolonnen och låt den helt flöda igenom. Tvätta kolonnen tre gånger genom att lägga till 500 mikroliter av MCS-buffert i reservoaren för varje tvättsteg, och vänta tills kolonnens reservoar är tom innan nästa tvättsteg påbörjas.Omärkta celler som passerar kolumnen representerar CD45-negativa, CD31-negativa fraktion. Förvara dem för ytterligare kvalitetskontroller. Ta sedan bort kolonnen från avgränsaren och placera den på ett lämpligt uppsamlingsrör.Pipetten två milliliter MCS buffert på kolonnen. Tryck omedelbart in kolven i kolonnen för att spola de magnetiskt märkta cellerna. Denna CD45-negativa, CD31-positiva fraktion representerar den berikade primära murine EC.Centrifugera cellupphängningen vid 350 gånger gravitation och vid 20 grader Celsius i fem minuter. Ta bort supernatanten helt och resuspend cellerna i en milliliter av endotelcellsmedium. Överför cellerna till en enda brunn av en bestruken sex-brunns odlingsplatta som innehåller en milliliter av endotelcellsmedium.För odling, inkubera cellerna i 37 grader Celsius med 5%koldioxid i en steril inkubator, se till att uppdatera mediet varannan till var tredje dag. När cellerna är på 80 till 90%sammanflödet, skölj varje brunn som innehåller celler två gånger med två milliliter PBS i två på varandra följande tvättsteg. Tillsätt sedan 800 mikroliter trypsin EDTA-lösning i varje brunn och inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i en steril inkubator i tre till fem minuter.Efter detta, lägg till 1, 200 mikroliter av DMEM som innehåller minst 10%FCS för att stoppa den enzymatiska aktiviteten. Centrifugera vid 350 gånger gravitation och vid 20 grader Celsius i fem minuter. Sedan ackumulera CD31-cellerna som tidigare beskrivits för att öka renheten.Använd ett ljust fält eller standard fas kontrakt mikroskop med 20%förstoring och 0,35 lins numerisk bländare för att observera cellen sammanflödet. I denna studie, primära murine skelettmuskel mikrovaskulära endotelceller är isolerade. En dag efter isolering, primära murine MMECs och resterande andra celler bildar konglomerat och hålla sig till botten av kultur rätter.Från dag sju och framåt, kan platta och avlånga celler observeras, men kontaminering av andra, mestadels sfäroidceller är fortfarande synlig. Således krävs en annan cykel av CD31-positivt urval via MCS. Härefter förökar sig primära murine MMECs till en densitet på cirka 80 till 90%Vid sammanflödet utgör de vanligtvis en icke-överlappande monoskikt av längsgående-anpassade celler.Proliferation stannar vid sammanflödet på grund av kontakthämning. Kvalitetskontroll via flödescytometri visar värden för både viabilitet och renhet som sträcker sig runt 70%vardera för celler omedelbart efter isoleringen. Celler odlas efter en annan CD31-positiva urval via MCS visar tillfredsställande värden för renhet samt för lönsamhet, som sträcker sig upp till 95%vardera.Erhållna celler undersöks sedan för genuttrycket av muskel satellit cell markör gener parade box protein 7 och M-cadherin på mRNA nivå av kvantitativa PCR. Som väntat, endast den CD45-negativa, CD31-negativa fraktionen samt de differentierade primära murin muskelceller uttryckta box protein 7 och M-kadherin, medan CD45-negativa, CD31-positiva och den primära murine MMECs är negativa för dessa markörer. Efter det andra CD31 MCS-steget används qPCR för att utvärdera uttrycket av snäva junction-proteiner i confluent primära murine MMECs.Primära murine MMECs ses för att uttrycka höga nivåer av claudin-5, occludin och zonula occludens-1, medan PMMC bara visa ett lågt uttryck för zonula occludens-1. Denna teknik kan utföras i fem till sex timmar. Efter detta protokoll kan andra metoder som migreringsanalyser eller stressexperiment med låg skjuvning utföras för att besvara ytterligare frågor.Efter att ha sett den här videon, bör du kunna isolera primära mikrovaskulära endotelceller från skelettmusklerna av mekaniker och enzymatisk dissociation och magnetisk cell sortering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Kopplade Patch Clamp Inspelningar från Motor-neuron och Target skelettmuskulaturen i Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generering av en immortaliserad Murine Brain Microvascular Endothelial cellinje som<em&gt; In Vitro</em&gt; Blod-hjärnbarriären Modell

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering av Primär Murina Brain mikrovaskulära endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Utvärdering av bioenergetisk Funktion i Cerebral vaskulära endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Funktionell Isolering av single motor enheter av Råtta Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissekering av enstaka skelettmuskelfibrer för immunofluorescerande och morfometriska analyser av neuromuskulära korsningar på hela berget

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...