Name: isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Bu eser "başka Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından" desteklenmiştir (TR 2018_A03), "Yenilikçi Medizinische Forschung (IMF) Münster" (ı-RU211811 TR için) ve Alman Araştırma Vakfı (DFG, INST 2105/27-1, bana 3283/5-1 ve bana 3283/6-1'e SGM). Heike Blum tarafından sağlanan resimli görüntüler.

Tüm hayvan deneyleri yerel makamlar tarafından onaylanmış ve Alman hayvan hakları yasası (84-02.05.20.13.097) göre yapılmıştır.
1. genel açıklamalar üzerinde hayvan deneyleri
<ol><li>Tüm fare deneyleri ilgili Kurumsal hayvan bakımı yönergelere uygun olarak gerçekleştirmek ve komite kullanın.</li>
	<li>Fareler standart koşullar altında ve Federasyon laboratuvar hayvan bilim dernekler (FELASA) gibi uluslararası kurallara göre tutmak. Not: Genel olar...

<ol>
	<li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+endothelial+barrier+function.">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).</li><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li><li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children.">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), (2017).</li><li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets.">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li><li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line.">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li><li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis:+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring.">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li><li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).</li><li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+occludin,+zona+occludens-1,+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum,+ileum,+colon,+kidney,+liver,+lung,+brain,+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice.">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li><li>Frye, C. A., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li><li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle:+Effects+of+hypoxia+and/or+acidosis.">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li><li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+cells.">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li><li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation,+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential.">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).</li><li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li></ol>

Mikrovasküler endotel hücreleri bariyer işlevleri tüm dokularda ve ilişkili organları 3hastalığında disfonksiyon sonuçları sağlar. Ayrıca, organ özel çalışmalar mikrovasküler EC yeni tedavi stratejileri için önünü açabilir. Bu nedenle, mikrovasküler EC işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında daha derin bir anlayış büyük bilimsel ilgi. Modülasyon lökosit/endotel etkileşim başarıyla natalizumab, lenfosit yapışma önleyen bir antikor multipl skleroz ...

Kan yolu ile hücre ve organların oksijen, yüzeyler ve gerekli diğer molekülleri ile sağlanır. Bu değişim kılcal damarlar, en küçük gemiler yer alır. Kılcal damarlar kas homeostazı intravasküler ve interstisyel alanı arasında başarılı düzenlenmesi için bir ön koşul olan bütünlüğü kalır bir iç endotel hücre (EC) tabaka meydana gelir. EC çözünür faktörler ve hücrelerin seçici bir geçiş sağlamak için bir tarafından sıkıca birbirine monolayer ve adherens kavşaklar 1oluşturmaktadır. Besin veya metabolik ürünler için engel olarak rolünü yanı sıra, EC düzenleyen lökosit inflamatuar süreçlerde alımı. İltihap veya doku hasarı için adezyon moleküllerinin bir up-yönetmelik EC yüzey ve lökosit eki ve Hicret hedef doku 2içine kolaylaştıran kemokinler üretimine yol açar. Sonuç olarak, EC eleştirel söz konusu olursa patojenleri ya da doku tamiri karşı savunma gibi iltihabi süreçleri düzenlenmesi.
EC disfonksiyon doğrudan olduğunu vasküler hastalıklar, kronik böbrek yetmezliği, Venöz tromboz ağır patojen enfeksiyonları ile ilişkili. Ayrıca, EC hemen hemen her zaman söz konusu olursa organ özgü otoimmünite diabetes mellitus veya multipl skleroz 3gibi. Kan akışı ve organları arasında bariyer fonksiyonu bu nedenle farklı hücre türleri uyumlu bir etkileşim tarafından kontrol edilir. İskelet kas mikrovasküler endotel hücrelerinde (MMEC) ile birlikte kas hücreleri, fibroblastlar ve perisitlerden fonksiyonel ünitesi, "myovascular ünitesi" formu (MVU). Bu nedenle, işlev bozukluğu MVU myopathies Patofizyoloji kritik bir rol oynamaktadır. Ancak, düzenleyici mekanizmaların daha derin bir anlayış hâlâ kayıp ve şu anda myopathies yeni, acilen gerekli, tedavi hedefleri tanımlaması engellemektedir.
Karmaşık fizyolojik ve patofizyolojik mekanizmaları araştırmak için hayvan modelleri yaygın olarak kullanılır. Ancak, vitro modelleri faiz konusunda çeşitli karıştırıcı etkenlere hariç tutarak odaklanmak için avantaj sunuyor. Süreçleri araştırmak için tüp bebek bu saf ve uygun Primer hücre izole etmek gereklidir. Aksine hücre hatları, Primer hücre Transjenik hayvanlar izole genetik değişiklikler tüp bebek sonuçlarını araştırmak için etkinleştirin.
Burada, birincil fare MMEC izole etmek için bir yöntem mekanik ve enzimatik ayrışma teknikleri (MCS) arıtma için sıralama manyetik aktif hücre ardından kod sayfası kullanılmıştır. Bu amaçla, manyetik boncuklar belirli yüzey işaretleyicileri karşı kullanılır. Trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM1, CD31) EC sayılı esas olarak ifade edilir ve bu hücre tipi zenginleştirmek için kullanılabilir. Yüksek hücre saflık emri için hücreleri hematopoetik kökenli bir negatif seçim tarafından için protein tirozin fosfataz reseptör tip C (PTPRC, CD45) hariç tutulur. Ayrıca, kalite denetimleri, birincil fare MMEC, potansiyel uygulamalar ve sınırlamalar yanı sıra özel hususlar ekimi sunulmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102506</td>
			<td>Isotype control: FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td>Isotype control: PE Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody</td>
			<td>dianova</td>
			<td>712-166-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonat treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>551,579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor780</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (serrated, straight, 12 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161708V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large magnetiv columns (LS columns)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for CD45-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium magnetic column (MS column)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for CD31-MACS-step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td>in a kit with the reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 rat &#945;-mouse</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>Sc-52713</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary murine muscle cells</td>
			<td>celprogen</td>
			<td>66066-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cdh15 (M-Cadherin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00483191_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Cldn5 (claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00727012_s1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Ocln (occludin)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00500912_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Pax-7</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm01354484_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Mm00493699_m1</td>
			<td>FAM labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4310893E</td>
			<td>VIC labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0231</td>
			<td>2 x 1,25 mL; for 200 reactions each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random mixture of single-stranded primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase (200 U/&#956;L) + PCR buffer (5x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) )</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Coating solution</td>
			<td>PeloBiotech</td>
			<td>PB-LU-000-0002-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine skeletal muscle microvascular endothelial cells

İskelet kas kılcal damarlar (kas mikrovasküler endotel hücreleri, MMEC) endotel hücrelerinin kan akışı ve iskelet kasları bulaşıcı karşı immün yanıt yanı sıra sıvı ve besin alışverişini düzenleyen arasındaki bariyeri oluşturmak ajanlar bağışıklık hücre geçiş kontrol ederek. Bu işlevler için MMEC şeklinde bir işlevsel "myovascular birimi" (MVU), fibroblastlar, perisitlerden ve iskelet kas hücreleri gibi daha fazla hücre tipleri ile. Sonuç olarak, bir işlev bozukluğu MMEC ve bu nedenle MVU myopathies geniş bir çeşitlilik katkıda bulunur. Ancak, MMEC düzenleyici mekanizmaları sağlık ve hastalığında yeterince anlaşılır kalır ve onların aydınlatma daha spesifik tedaviler myopathies için önce. Yalıtım ve MVU bağlamında birincil MMEC fonksiyonların derinlemesine soruşturma bu süreçlerin daha iyi bir anlayış dahakolaylaştırabilirdi.
Bu makalede birincil fare MMEC iskelet kas arıtma ve kültür bakım adımlar da dahil olmak üzere mekanik ve enzimatik ayrılma tarafından yalıtmak için bir protokol sağlar.

Bir gün sonra yalıtım, birincil fare MMEC ve kalan diğer hücreleri ikinci büyük şirketler oluşturmak ve kültür yemekleri (şekil 1A gün 1) altına uygun. Günden sonra 7, düz ve uzun hücreleri görülebilir. Ancak, diğer, çoğunlukla küresel hücreleri, kirlenme hala görülür (şekil 1A gün 7). Böylece, başka bir döngüsü CD31 pozitif seçim yoluyla MCS gereklidir. Bundan sonra birincil fare MMEC ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Bu protokol, mikrovasküler endotel hücrelerini iskelet kaslarından izole etmek için bir platform tekniğini tanımlar. Bu hücreler, örneğin, kan kas bariyerfonksiyonları hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yüksek saflıkta primer mikrovasküler endotel hücrelerini izole etmek mümkündür.Bu teknik, sağlık ve hastalık kas ve endotel hücreleri arasındaki etkileşim gibi bağışıklık aracılı kas hastalıkları alanında anahtar soruları cevaplamak için yardımcı olabilir. İlk olarak, protokolde açıklandığı gibi gerekli tüm çözümleri ve altı kuyulu plakaları hazırlayın. Pratik prosedüre başlamak için, bir çift cerrahi keskin/künt makas, bir çift cerrahi keskin/keskin makas ve düz ve kavisli forceps alın.Tüm cerrahi aletleri %70 etanol ile dezenfekte edin. Ötenaziyapılan yetişkin bir erkek fareyi sırtına yerleştirin ve bacakları %70 etanol ile nemlendirin. Keskin/ künt cerrahi makas kullanarak, kalça eklemini keserek her bacağın tamamını koparın.Ekstremiteleri kapalı hücre kültürü yemeğine yerleştirin. Yemeği steril bir laminar akış başlığına aktarın. Ayak ucuna kalçadan açık deri kesmek için keskin makas ve kavisli forceps kullanın.Ayak veya ayak yastığı nı tutmak için düz forceps'u kullanın, kavisli forceps'u kullanarak deriyi ayak altından kalçaya doğru sök. Musculus quadriceps femoris izole etmek için, diz tendon kesmek, ve kalça uyluk boyunca kas kesmek. Musculus triceps surae izole etmek için Aşil tendonu ayırın.Sonra, popliteal fossa tibia boyunca kesilmiş ve kas kaldırmak. Ayrıştırılamayan tendonu çıkarmak için, kavisli forceps ile kasları tutun ve her uygun tendonu kesti. Taze, etiketli hücre kültürü yemeğine hazırlanmış sindirim çözeltisinin 2, 445 mikrolitresini ekleyin ve ağırlığı belirleyin.Tüm kas parçalarını bu tabağa aktarın. Sonra, ağırlığı belirleyin. Ölçülen her iki değerin farkı, kas dokusunun bir gramı geçmemesi gereken kuru ağırlığını sağlar.Cerrahi keskin makas kullanarak, küçük parçalar halinde tüm kas dokusu kesti. Doku süspansiyonuna 37 derecede %5 karbondioksit le 1,5 saat kuluçkaya yatarak süspansiyonu yaklaşık beş dakika boyunca her 20 dakikada bir mililitrelik insülin şırıngasıyla dikkatlice karıştırın. Kuluçkadan sonra süspansiyonu 50 mililitrelik etiketli bir tüpe yerleştirilen 70 mikrometrelik naylon süzgeçe aktarın ve akışı toplayın.Hücre süzgecini sekiz mililitre DMEM ile yıkayın ve akışı toplayın. Parçalar süzgeçi takıyorsa, ayrık çözeltiyi yeniden askıya alın. Hücre süzgeci atın ve 10 dakika boyunca 300 kat yerçekimi ve 20 derece santigrat süspansiyon santrifüj.Dikkatle supernatant kaldırmak ve kırmızı kan hücrelerinin lysis için bir amonyum klorür potasyum lysing tampon bir mililitre hücre pelet resuspend. 30 saniye boyunca oda sıcaklığında kuluçka. Daha sonra, reaksiyonu durdurmak için %10 FCS içeren dokuz mililitre DMEM ekleyin.Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp aktarın. Daha sonra, hücre numaralarını belirlemek için bir Neubauer hücre sayma odası kullanın. CD45-pozitif hücreleri tükenmeye başlamak için süspansiyonu 300 kat yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.Supernatant'ı tamamen çıkarın ve 90 mikrolitre MCS tamponundaki hücre peletini yeniden askıya alın. 10 mikrolitre CD45 mikroboncuk ekleyin ve süspansiyonu karıştırın. 15 dakika boyunca 4-8 santigrat derecede bir buzdolabında kuluçka.Bundan sonra, bir mililitre MCS arabelleği ekleyin. 300 kat yerçekiminde santrifüj ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede. Süpernatant'ı tamamen çıkarın ve 500 mikrolitre MCS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.Ayırıcının manyetik alanına büyük bir manyetik kolon yerleştirin. Üç mililitre MCS tamponuyla sütunun rezervuarını durulayın. Daha sonra, içinden akışı toplamak için sütunun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin.Tüm hücre süspansiyonunu kolona uygulayın ve tamamen akmasına izin verin. Her yıkama adımı için rezervuara üç mililitre MCS tampon u ekleyerek ve bir sonraki yıkama adımına başlamadan önce sütunun rezervuarının boşalmasını bekleyerek sütunu üç kez yıkayın. Daha fazla ayırma adımlarında kullanılmak üzere sütundan geçen etiketlenmemiş hücreleri toplayın.CD31-pozitif hücreleri toplamaya başlamak için, hücre numaralarını belirlemek için bir Neubauer hücre sayma odası kullanın. Daha sonra, etiketlenmemiş hücreleri 300 kat yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı tamamen çıkarın ve 90 mikrolitre MCS tamponundaki peleti yeniden askıya alın.10 mikrolitre CD31 mikroboncuk ekleyin ve tüm süspansiyonu karıştırın. 15 dakika boyunca 4-8 santigrat derecede bir buzdolabında kuluçka. Bundan sonra, 300 kez yerçekimi ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat bir mililitre MCS tampon ve santrifüj ekleyin.Supernatant çıkarın ve MCS tampon 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Orta manyetik kolonu ayırıcının manyetik alanına yerleştirin. 500 mikrolitre MCS tamponuyla sütunu durulayın.Daha sonra, akışı toplamak için sütunun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin. Tüm hücre süspansiyonunu kolona uygulayın ve tamamen akmasına izin verin. Her yıkama adımı için rezervuara 500 mikrolitre MCS tamponu ekleyerek sütunu üç kez yıkayın ve bir sonraki yıkama adımına başlamadan önce sütunun rezervuarının boşalmasını bekleyin.Sütunu geçen etiketlenmemiş hücreler CD45-negatif, CD31-negatif fraksiyonu temsil eder. Daha fazla kalite kontrolleri için saklayın. Ardından, kolon ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpüne yerleştirin.Pipet iki mililitre MCS tamponu sütunun üzerine. Hemen manyetik etiketli hücreleri floş için sütuniçine piston itin. Bu CD45-negatif, CD31-pozitif fraksiyonu zenginleştirilmiş birincil murine ECs temsil eder.Hücre süspansiyonuna 350 kat yerçekimi ve 20 derecede 5 dakika santrifüj edin. Supernatant tamamen çıkarın ve endotel hücreli orta bir mililitre hücreleri resuspend. Hücreleri, bir mililitre endotel hücreli ortam içeren altı kuyulu bir kültür plakasının tek bir kuyuya aktarın.Ekim için, steril bir kuluçka makinesinde% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece hücreleri kuluçka, her iki ila üç günde bir orta yenilemek için emin olun. Hücreler %80 ila %90 oranında birleştiğinde, her iyi içeren hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez ardışık yıkama adımlarında durulayın. Daha sonra, her kuyuya 800 mikrolitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve steril bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksitle 37 derecede 37 santigrat derecede üç ila beş dakika kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, enzimatik aktiviteyi durdurmak için en az %10 FCS içeren 1, 200 mikrolitre DMEM ekleyin. Santrifüj 350 kat yerçekimi ve 20 santigrat derecede beş dakika. Daha sonra, daha önce saflığı artırmak için açıklandığı gibi CD31 hücreleri birikir.Hücre birleşimini gözlemlemek için %20 büyütme ve 0,35 lens sayısal diyafram açıklığına sahip parlak bir alan veya standart faz sözleşme mikroskobu kullanın. Bu çalışmada primer murine iskelet kası mikrovasküler endotel hücreleri izole edilmiştir. Bir gün izolasyondan sonra, birincil murine MMECs ve artık diğer hücreler konglomeralar oluşturmak ve kültür yemekleri altına yapışır.Yedinci günden itibaren, düz ve uzamış hücreler görülebilir, ancak, diğer kontaminasyon, çoğunlukla küresel hücrelerin hala görülebilir. Böylece, MCS ile CD31-pozitif seçim başka bir döngü gereklidir. Bundan sonra, birincil murine MMECs yaklaşık bir yoğunluk tayılmak 80-90%Birleştirme üzerine, genellikle uzunlamasına hizalanmış hücrelerin örtüşen olmayan bir monolayer oluşturur.Kontak tetkiki nedeniyle çoğalma durur. Akış sitometrisi ile kalite kontrol, izolasyondan hemen sonra hücreler için her biri %70 civarında değişen canlılık ve saflık değerleri gösterir. MCS aracılığıyla başka bir CD31-pozitif seçimden sonra yetiştirilen hücreler, her biri %95'e kadar değişen saflık ve canlılık için tatmin edici değerler gösterir.Elde edilen hücreler daha sonra kantitatif PCR ile mRNA düzeyinde kutu protein 7 ve M-kadherin eşleştirilmiş kas uydu hücre marker genlerinin gen ekspresyonu için araştırılır. Beklendiği gibi, sadece CD45-negatif, CD31-negatif fraksiyonu yanı sıra farklılaşmış primer mindik kas hücreleri kutu protein 7 ve M-kadherin ifade, CD45-negatif ise, CD31-pozitif ve primer murine MMECs bu belirteçleri için negatif. İkinci CD31 MCS adımından sonra, qPCR konfluent primer murine mmecs sıkı kavşak proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılır.Primer murine MMECs claudin-5, oklüdin ve zonula oklüden-1 yüksek düzeyde ifade görülür, pmMC sadece zonula oklüdens-1 düşük bir ifade gösterirken. Bu teknik 5-6 saat içinde yapılabilir. Bu protokolü takiben, ek soruları yanıtlamak için geçiş denemeleri veya düşük kesme gerilimi deneyleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, mekanik ve enzimatik dissosilasyon ve manyetik hücre sıralama ile iskelet kaslarından birincil mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek gerekir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Sıçan Medial Gastroknemius KasTek Motor Üniteleri Fonksiyonel İzolasyon

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...