Name: 3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol
Uploaded: 2019-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol at JoVE.com

تشعر الأستاذة بالامتنان للدعم الذي تقدمه جميع الموظفين في دورة هندسة المعلومات الطبية في كلية الدراسات العليا للطب وكلية الطب، وترغب في شكر البروفيسور تيتسويا تاكاكوا، والبروفيسور نوبوكاتسو ساواموتو، ودوريس زاكيان على ما قدموه من مساعدة تعليقات. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة في المعونة لتحدي البحوث الاستكشافية والمبادرة الرائدة للباحثين الشباب الممتاز (LEADER) برنامج إلى M.S. من MEXT (وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا). وقد أجريت تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي في هذا العمل في شعبة التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانية الصغيرة، ومركز دعم البحوث الطبية، وكلية الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو، اليابان.

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات بجامعة كيوتو على جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا.
1. الحيوانات (اليوم 1)
<ol><li>إعداد الإناث C57BL/6J الفئران (ن = 6، الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أسابيع). ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول على جميع أنواع القوارض.</li>
</ol>2. إعدا...

<ol>
	<li>Vogelsberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+galaxies+reproduced+by+a+hydrodynamic+simulation.">Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation.</a> Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+approach+identifies+genetic+nodes+and+networks+in+late-onset+Alzheimer&#8217;s+disease.">Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer&#8217;s disease.</a> Cell. 153 (3), 707-720 (2013).</li><li>Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization,+development+and+function+of+complex+brain+networks.">Organization, development and function of complex brain networks.</a> Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).</li><li>Shimono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+cell+density+and+networks+in+the+monkey+brain.">Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain.</a> Scientific Reports. 3, 2541 (2013).</li><li>DeFelipe, J., Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+MEA+development.">A history of MEA development.</a> Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clusters,+hubs,+and+communities+in+the+cortical+microconnectome.">Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).</li><li>Amunts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigBrain:+An+Ultrahigh-Resolution+3D+Human+Brain+Model.">BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model.</a> Science. 340, 1472-1475 (2013).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigid+and+non-rigid+registration+of+polarized+light+imaging+data+for+3D+reconstruction+of+the+temporal+lobe+of+the+human+brain+at+micrometer+resolution.">Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution.</a> NeuroImage. 181, 235-251 (2018).</li><li>Kozai, T. D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).</li><li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+color+optogenetic+control+of+neural+populations+using+low-noise,+multishank+optoelectrodes.">Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).</li><li>Hellwig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+local+connectivity+between+pyramidal+neurons+in+layers+2/3+of+the+rat+visual+cortex.">A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex.</a> Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).</li><li>Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+spatial+with+ontological+brain+regions+using+Java+tools+for+visualization,+database+access,+and+integrated+data+analysis.">Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis.</a> Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).</li><li>Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cell+communication+within+local+networks+in+layer+2/3+of+rat+neocortex.">Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex.</a> The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).</li><li>Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+cortical+column:+abundance+and+physiology+of+horizontal+connections+imply+a+strong+role+for+inputs+from+the+surround.">Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround.</a> Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).</li><li>Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+reconstruction+by+wrapping+finite+point+sets+in+space.">Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space.</a> Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).</li><li>Roland, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+atlas:+For+high&#8208;resolution+functional+and+anatomical+mapping.">Human brain atlas: For high&#8208;resolution functional and anatomical mapping.</a> Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxholm+space:+an+image-based+reference+for+coordinating+mouse+brain+research.">Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research.</a> NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).</li><li>Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+templates+and+atlases.">Brain templates and atlases.</a> NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).</li><li>Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain/MINDS&#8211;a+new+program+for+comprehensive+analyses+of+the+brain.">Brain/MINDS&#8211;a new program for comprehensive analyses of the brain.</a> Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).</li><li>Shimono, M., Hatano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+communication+dynamics+on+macro-connectome,+and+the+propagation+speed.">Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).</li></ol>

وقد طورنا بروتوكولا جديدا يسمى بروتوكول الـ 3D-NEO لسد المقاييس المكانية العيانية والمجهرية عن طريق تداخل سطحين من أسطح الدماغ بدقة أكبر من ذي قبل. في الأصل، كان هناك تحديان في إنشاء هذا البروتوكول الذي جعل من الممكن التداخل الدقيق لصورتين سطح الدماغ وتسجيل الأنشطة العصبية الصحية من الكائن?...

عادة ما توجد البنى متعددة الدرجات غير الموحدة في مختلف المنظمات الفيزيائية والبيولوجية1،2. الدماغ هو أيضا منظمة شبكة غير موحدة جدا ومتعددة النطاق3،4. يتم ترميز الوظائف المعرفية المختلفة في مثل هذه المنظمات الشبكة، وعقد التغيرات الزمنية لأنماط ارتفاع الكهربائية من السكان الخلايا العصبية في القرارات الزمنية submillisecond. تاريخيا، لوحظت الشبكات المعقدة بين الخلايا العصبية هيكليا بالتفصيل باستخدام تقنيات تلطيخ من قبل سانتياغو رامون y Cajal من أكثر من 150 عاما مضت5. لمراقبة السلوكيات الجماعية للخلايا العصبية النشطة، طور الباحثون تقنيات تسجيل مختلفة6و7و8، وقد مكنتنا التطورات الهامة الأخيرة من هذه التقنيات من تسجيل الأنشطة الكهربائية من أعداد كبيرة من الخلايا العصبية في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، من هذه الأنشطة الوظيفية، نجح العلماء في إعادة بناء شبكات من التفاعلات السببية بين أعداد كبيرة من الخلايا العصبية وأعلنوا الهندسة الطوبوغرافية لتفاعلاتهم المعقدة 'microconnectome'9 . كما تسمح الملاحظات العيانية للدماغ باعتبار الدماغ بأكمله منظمة للشبكة لأن العديد من مناطق الدماغ متصلة بحزم ألياف متعددة. إن إدماج الكُمَكَمّات الدقيقة في خريطة الدماغ العالمية لا يزال له حدود واضحة ضمن التطورات التكنولوجية الحالية، وهذا هو السبب في أن بروتوكول التضمين هذا مهم جداً. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات لتطوير بروتوكول التضمين. على سبيل المثال، من أجل مراقبة أنشطة الدوائر العصبية المحلية الحية في مناطق الدماغ المعزولة بحتة، تحتاج شرائح الدماغ إلى إنتاج للتسجيلات في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال التسجيلات من شرائح الدماغ للتسجيلات في المختبر خياراً هاماً لسببين على الأقل. أولا، لا يزال من غير السهل مراقبة أنشطة العديد من الخلايا العصبية الفردية الحية في وقت واحد من مناطق الدماغ أعمق من ~ 1.5 ملم وفي دقة زمنية عالية (<1 مللي ثانية). ثانيا، عندما نأمل أن نعرف البنية الداخلية للدائرة العصبية المحلية، ونحن بحاجة إلى وقف جميع المدخلات القادمة من مناطق الدماغ الخارجية للقضاء على العوامل المربكة. من أجل تحديد الاتجاهات والمواقف من شرائح الدماغ المنتجة، سيكون من الضروري كذلك لدمج المواقف المكانية لهذه شرائح الدماغ المنتجة باستخدام الإحداثيات. هناك، ومع ذلك، هناك عدد قليل من الطرق المنهجية وموثوق بها لجعل شرائح الدماغ بطريقة منظمة10،11. هنا، يتم إدخال بروتوكول جديد للتسجيل المشترك، باستخدام تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد للبحث العلمي العصبي من أجل توفير بروتوكول تكاملي. يعمل هذا البروتوكول على تنسيق المقاييس الدقيقة والكلية وتضمين مجموعة متعددة الأقطاب (MEA) microdata12و13 وتلطيخ البيانات على مساحة التصوير بالرنين المغناطيسي العياني من خلال أسطح المسح الضوئي ثلاثية الأبعاد للعقول المستخرجة، وكذلك من العقول المسجلة غير الغازية. ومن المستغرب، وهذا أظهر خطأ المسافة من ~ فقط 50 ميكرومتر كقيمة وضع الرسم البياني. ونتيجة لذلك، كانت قيم وضع الحد الأدنى للمسافات بين سطح التصوير بالرنين المغناطيسي وسطح 3D الممسوحة ضوئيا ً حوالي 50 ميكرومتر لجميع الفئران الستة، وهو رقم مناسب عند التحقق من القواسم المشتركة بين الأفراد. وكان عرض شريحة نموذجية نشاط ارتفاع مسجل من حوالي 300 ميكرومتر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td>Kimura Medical</td>
			<td>KA-100</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia box</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>RIC-01</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>NS-5000A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67, clone 1G10.2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chrolide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06729-55</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08809-45</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved blunt forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td></td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16605-42</td>
			<td>re-secctioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>HM-10</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat controller</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>BWT-100A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>MR-compatible Small Animal Heating System</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie</td>
			<td></td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>MKIIIai</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Slicer</td>
			<td>DOSAKA</td>
			<td>Neo Linear Slicer MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chrolide Hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxOne Single-Well MEA</td>
			<td>MaxWell Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring software</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>PC-SAM V.5.12</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI compatible cradle</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T12812</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI coil</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T9988</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI operation software</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>ParaVision 5.1</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo LinearSlicer MT</td>
			<td>D.S.K.</td>
			<td>NLS-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24307</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure-sensitive respiration sensor</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RS-301</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preclinical MRI scanner</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>BioSpec 70/20 USR</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid Sodium Salt</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>29806-54</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAN in a BOX</td>
			<td>Open Technologies srl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve bottle</td>
			<td>TIGERCROWN</td>
			<td>81</td>
			<td>For 3D scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-09705</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogensulfite</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31220-15</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor temperature probe</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RTP-101-B, PLTPC-300</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth bar</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T10146</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged intravenous needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SV-23CLK</td>
			<td>For perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35436-01</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Hydrochloric Acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>37314-15</td>
			<td>For pH adjustment of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol

الدماغ البشري، كونه نظام متعدد الدرجات، على حد سواء إشارات كهربائية مجهرية، تتدفق على الصعيد العالمي على طول حزم الألياف البيضاء سميكة، والمسامير العصبية المجهرية، ونشر على طول المحاور وdendrites. ويكمل كلا الجدولين جوانب مختلفة من الوظائف المعرفية والسلوكية البشرية. على المستوى العياني، كان التصوير بالرنين المغناطيسي هو تكنولوجيا التصوير القياسية الحالية، حيث أصغر دقة مكانية، حجم voxel، هو 0.1-1 مم3. أيضا، على المستوى المجهري، كانت الدراسات الفسيولوجية السابقة على بينة من البنى العصبية غير موحدة داخل هذه voxels. تطور هذه الدراسة طريقة قوية لدمج البيانات المجهرية بدقة في خريطة مجهرية من خلال ربط البحث العلمي البيولوجي مع التقدم التكنولوجي في تكنولوجيا المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد. منذ 3D تكنولوجيا المسح الضوئي وقد استخدمت في الغالب للهندسة والتصميم الصناعي حتى الآن، يتم إعادة استخدامها لأول مرة لتضمين microconnectomes في الدماغ كله مع الحفاظ على الصنبور الطبيعي في خلايا الدماغ الحية. من أجل تحقيق هذا الغرض، أولا، قمنا بإنشاء بروتوكول المسح الضوئي للحصول على صور دقيقة 3D من الكائنات الحية الحية التي تشكل تحديا بطبيعتها للصورة بسبب الأسطح الرطبة والعاكسة. ثانيا، تدربنا على الحفاظ على السرعة لمنع تدهور أنسجة الدماغ الحية، وهو عامل رئيسي في الحفاظ على ظروف أفضل وتسجيل المزيد من المسامير العصبية الطبيعية من الخلايا العصبية النشطة في أنسجة الدماغ. تظهر صورتان على سطح القشرية، تم استخراجهما بشكل مستقل من وحدتين مختلفتين للتصوير، وهما التصوير بالرنين المغناطيسي والصور السطحية للماسح الضوئي ثلاثي الأبعاد، خطأ ً في المسافة لا يتجاوز 50 ميكرومتر كقيمة وضع للرسم البياني. هذه الدقة قابلة للمقارنة من حيث الحجم إلى القرار المجهري للمسافات بين الخلايا؛ أيضا، فمن مستقر بين الفئران الفردية المختلفة. هذا البروتوكول الجديد، و3D الجديدة تضمين بروتوكول متداخلة (3D-NEO)، والجسور مستويات العيان ية والمجهرية المستمدة من هذا البروتوكول التكاملي وتسريع النتائج العلمية الجديدة لدراسة بنيات الاتصال الشامل (أي، microconnectome).

قمنا بتقييم المسافات بين الأسطح القشرية، التي تنتجها تجريد حجم التصوير بالرنين المغناطيسي، والأسطح التي تم الحصول عليها من المسح الضوئي 3D من العقول المستخرجة. قيم وضع الرسم البياني للمسافات هي فقط 55 ميكرومتر (الشكل3a). بالإضافة إلى ذلك، عند تراكم الرسم ال...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol at JoVE.com

3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد تربط الدوائر الدقيقة وصور الدماغ على نطاق كبير في بروتوكول تضمين متداخلثلاثي الأبعاد

يقدم هذا المقال بروتوكول تجريبي باستخدام تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد التي تربط بين مقياسين مكانيين: المقياس المكاني العياني للتشريح في الدماغ الكامل الذي صوره التصوير بالرنين المغناطيسي في > 100 ميكرومتر والمقياس المكاني المجهري لتوزيع الخلايا العصبية باستخدام تلطيخ الكيمياء المناعية ونظام صفيف متعدد الأقطاب وطرق أخرى (~ 10 درجة مئوية).

The human brain, being a multiscale system, has both macroscopic electrical signals, globally flowing along thick white-matter fiber bundles, and ...

هذا البروتوكول هو الأول من إدخال تقنية المسح ثلاثي الأبعاد في مجال البحوث التشريحية، وتحديداً تحليلية تحليلية عصبية، وقد حقق أداءً متداخلًا دقيقًا للغاية. التداخل التضمين العصبي ثلاثي الأبعاد ، أو بروتوكول الأعصاب ثلاثية الأبعاد ، يدمج مآخذ معقمة على نطاق صغير في صور الدماغ على نطاق الماكرو ، ويجسّد هذه المقاييس المكانية المختلفة بسلاسة. علينا أيضا تطبيق بروتوكول 3D العصبية للتصوير بالرنين المغناطيسي البشري والدماغ بعد الوفاة.التداخل يمكننا من تحديد أنماط التباين التصوير بالرنين المغناطيسي المعروفة المتعلقة بالمرض. نظم المسح ثلاثي الأبعاد حساسة للمياه المحيطة بالكائن الحي الحيوي المستخرج ، لذلك من المهم مسح الماء بعناية فائقة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم تنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن.ابدأ هذا الإجراء بإعداد فأرة، وكذلك عمليات اقتناء الرنين المغناطيسي وإعدادات المعدات كما هو موضح في بروتوكول النص. في اليوم الثاني، قطع فروة رأس فأر القتل الرحيم سابقا على طول خياطة القوس باستخدام مقص الجراحية. استخدام مقص الجراحية لقطع الجمجمة في اتجاهات قطري من نقطة لامدا إلى نقطة قليلا أمام البريغما.ثم، قشر بلطف قبالة الجمجمة من الدماغ باستخدام الملاقط المنحنية. ارفع الدماغ بملعقة ونقلها إلى طبق بيتري مع محلول قطع بارد من الجليد. باستخدام قنبلة غاز خارجي مع سرعة مضخة الدورية الخاضعة للرقابة، تدفق الهواء التي تحتوي على 95٪ من الأوكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتوليد فقاعات صغيرة في حل قطع الجليد الباردة.بعد دقيقة إلى دقيقتين ، ضع الدماغ على قطعة قماش من الأقمشة الدقيقة التي يتم تغطية سطحها قليلاً بمنخل دقيق. امسح السائل بلطف من سطح الدماغ باستخدام قطعة قماش الميكروفايبر. وضع الدماغ، مع الجانب الظهري حتى، على موقف العينة.ثم ضع الحامل العينة في مركز القرص الدوار التلقائي. تغمم الغرفة أثناء المسح ثلاثي الأبعاد، ثم قم بإجراء مسح ثلاثي الأبعاد على القرص الدوار. لاختبار ما إذا كان المسح ثلاثي الأبعاد يعمل بشكل جيد، انقر فوق المسح ثلاثي الأبعاد عن طريق تحديد الزاوية بين طلقتين كـ 22.5، زاوية البداية كصفر، والزاوية النهائية كـ 360.نقل الدماغ إلى طبق بيتري وفقاعات الدماغ في حل القطع لمدة 10 ثوان تقريبا. قطع الدماغ إلى كتلتين في منتصف الطائرة التاجية، وذلك باستخدام مشرط. ثم، نقل كتلتين الدماغ بلطف إلى السطح المسطح باستخدام ملعقة الجراحية.إرفاق كتل الدماغ من قاعدة كتلة الدماغ باستخدام الغراء الفوري. بهدوء وبعناية مسح السائل من سطح الدماغ في غضون دقيقة إلى دقيقتين، وذلك باستخدام القماش microfiber. ثم قم بإجراء مسح ثلاثي الأبعاد مرة أخرى.إرفاق شفرة إلى حامل شفرة من هزاز. إرفاق الشريط الأسود الذي يغطي مركز قاعدة كتلة الدماغ إلى مركز مرحلة القطع لهتزوم. صب حل القطع في مرحلة القطع وتعيين مرحلة القطع على هزاز.ضبط سرعة القطع والسعة. جعل 2-5 شرائح إكلية من 300 ميكرون سميكة من كتلتين في الدماغ. الحفاظ على الحل في مرحلة القطع محتدما إذا كان ذلك ممكنا.تحسين سرعة القطع، تردد، وسرعة الاهتزاز من النظام عن طريق وضعها على النحو 12.7 ملليمتر في الدقيقة للسرعة، 87 إلى 88 هيرتز للتردد، و 0.8 إلى 1.0 ملليمتر لعرض سوينغ. أثناء قطع شرائح الدماغ، قم بتسجيل الإحداثيات المقطعة في الشكل، بما في ذلك الإحداثي الأمامي الأمامي ونصف الكرة الأرضية وغيرها من الظروف. نقل بلطف شرائح الدماغ إلى منقار مملوءة ACSF قبل الدافئة باستخدام ماصة بلاستيكية سميكة.احتضان شرائح الدماغ في الكوكر في حوالي 34 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. خلال هذا الوقت، إجراء مسح ثلاثي الأبعاد من كتل الدماغ المتبقية على مرحلة القطع. الآن، تعيين صفيف multielectrode أو MEA رقاقة، على وحدة تسجيل.قم بتوصيل الشريحة بمضخة مُتعالِبة باستخدام أنبوبين. استخدام أنبوب واحد لتوجيه ACSF نفسه في رقاقة MEA وأنبوب آخر لتوجيه ACSF للخروج من رقاقة MEA. نعلق اثنين من الإبر، متصلة عند نصائح من الأنابيب اثنين، إلى الجزء العلوي من جدار رقاقة MEA.إصلاح مواقفهم مع نصائحهم بعد الجدار الداخلي للشريحة MEA. تعيين معدل تدفق ACSF إلى 4.1 دورة في الدقيقة. تنفيذ معالجة بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي لاستخراج وحدات التخزين القشرية كما هو موضح في بروتوكول النص.لتنفيذ معالجة الصور التصوير بالرنين المغناطيسي، قم بتنزيل برنامج 3D Slicer المجاني. افتح صور MR للأدمغة المستخرجة التي تم إنتاجها باستخدام وحدات عرض وحدة التخزين والمحرر في Slicer ثلاثية الأبعاد. تغيير الوضع من محرر إلى تقديم وحدة التخزين، وانقر فوق زر الهدف لجعل صورة الدماغ تأتي إلى وسط الشاشة.حدد وضع الدماغ MRT-2 وضبط العتبات عن طريق تحريك شريط التحول. ثم، الانتقال مرة أخرى من وحدة التخزين تقديم إلى محرر وانقر فوق زر تأثير عتبة. تطبيق التسمية 41، قشرة الدماغ.ثم احفظ بيانات سطح الدماغ كملف STL عن طريق تغيير تنسيق الملف من VTK إلى STL في قائمة الاختيار الخاصة بالنموذج. تنفيذ coregistration التلقائي بين ثمانية أو 16 صورة مأخوذة من ثماني أو 16 زوايا مختلفة ضمن تسلسل من مسح لتصحيح عدم التطابق الصغيرة. للقيام بذلك، انقر فوق التسجيل العمومي المضمنة في خيار المحاذاة ودمج الصور.كرر عمليات المسح الضوئي من زوايا مختلفة للحصول على سطح الدماغ بأكمله. إذا لم ينجح التكامل بين الصور الممسوحة ضوئيًا من زوايا مختلفة، فانقر فوق المحاذاة اليدوية وحدد زوجًا من الصور الثابتة وصورة متحركة. ابدأ المحاذاة اليدوية للصور عن طريق تحديد ثلاث أو أربع نقاط مشتركة في صور مختلفة.ثم انقر فوق موافق. خوارزمية التحسين هي خوارزمية أقرب نقطة متكررة ولا تتضمن تشوه غير خطي. جعل شبكة من جميع الصور الانحياز عن طريق تحديد جميع الصور والنقر على زر توليد شبكة. ثم، حدد الخيار، الكائن الفني الصغيرة، للحصول على شبكة في أعلى دقة.حفظ الصورة كـ STL ثنائي أو تنسيق ASCII. الآن، افتح سطح التصوير بالرنين المغناطيسي ودمجه مع سطح المسح ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج معالجة السطح. تنفيذ عملية محاذاة يدوية كما كان من قبل.ثم، حفظ هذه الصور سطح coregistered مرة أخرى. إذا لزم الأمر، قم بتنظيف بيانات السطح الفردية عن طريق محو الضوضاء الصغيرة المحيطة بمنطقة الدماغ، خاصة في حالة بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي، وعن طريق ملء أي ثقوب، خاصة في حالة بيانات المسح ثلاثي الأبعاد. وأخيراً، افتح البيانات السطحية باستخدام برنامج تحليل البيانات مثل MATLAB.توليد وتقييم المدرجات البيانية للمسافات الدنيا بين السطحين. تم تقييم المسافات بين الأسطح القشرية التي تنتجها تجريد حجم التصوير بالرنين المغناطيسي والأسطح التي تم الحصول عليها من مسح ثلاثي الأبعاد للأدمغة المستخرجة. قيم الوضع من الرسم البياني للمسافات هي فقط 55 ميكرون.بالإضافة إلى ذلك، عند تراكم الرسم البياني من النقطة حيث المسافة تساوي الصفر، القيمة المتراكمة تصل إلى 90٪ من إجمالي أرقام العينة في حوالي 300 ميكرون. وأظهر الرسم البياني النهائي للمسافات بين سطحين ذروة نموذجية حوالي 50 ميكرون. من وجهة نظر العيانية، هذه القيمة الوضع يتوافق مع الحد الهندسي، الذي كان 100 ميكرون من حجم voxel من التصوير بالرنين المغناطيسي.هذه النقطة تشير بشكل غير مباشر إلى أن خوارزمية التداخل بين التصوير بالرنين المغناطيسي والمسح ثلاثي الأبعاد عملت بشكل رائع بشكل جيد، وأن مستويات الضوضاء لكل من التصوير بالرنين المغناطيسي والمسح ثلاثي الأبعاد تم منعها كقيمة منخفضة. هذا البروتوكول هو أول من uprise من خلال تكنولوجيا المسح إلى الكائنات الحية الحيوية. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا في الأصل لمطالب هندسية بحتة.تطبيق هذه التكنولوجيا على الطب يمكن الإجابة على أسئلة جديدة. بعد المسح 3D، يمكننا استخدام الكالسيوم تصوير الجدار التصحيح التسجيلات غرام للحصول على المعرفة التكميلية من حيث دقة الزمنية ودقة spacial وأرقام قابلة للتسجيل من الخلايا. إن الأداء المتداخل الدقيق للغاية الذي يوفره هذا البروتوكول سيجعل الارتباط السلس بين المقياس المكاني التشريحي والنطاق المكاني الصفري أكثر واقعية من ذي قبل.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

تفاعل الثقافات 3D المهندسة العصبية لمايكرو الكهربائي صالحة: مبتكر<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج تجريبي

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

استخدام 3D تكنولوجيا الطباعة لدمج التصوير بالرنين المغناطيسي مع الأنسجة: بروتوكول لالدماغ باجتزاء

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

التنمية المقايسة للقياس الكمي المحتوى عالية Sod1 البروتين متحولة تشكيل التجميعية في الخلايا الحية

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

نموذج رواية في المختبر للانفجار إصابات الدماغ الرضية

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...