Name: 3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol
Uploaded: 2019-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol at JoVE.com

M.S. is dankbaar voor de steun van al het personeel in de medische informatie engineering cursus in Graduate School of Medicine en Faculteit der Geneeskunde, en wil Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto en Doris Zakian bedanken voor hun nuttige Opmerkingen. Deze studie werd gesteund door een subsidie-in-Aid voor uitdagend verkennend onderzoek en door het leidende initiatief voor excellent Young onderzoekers (LEADER) programma om te M.S. van MEXT (het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie). De MRI-experimenten in dit werk werden uitgevoerd in de divisie voor kleine dierlijke MRI, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.

Alle hier beschreven experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Dierenzorg Comité van de Universiteit van Kyoto.
1. dieren (dag 1)
<ol><li>Bereid vrouwelijke C57BL/6J muizen (n = 6, leeftijd 3 − 5 weken). Opmerking: Dit protocol is van toepassing op alle soorten knaagdieren.</li>
</ol>2. MRI-instellingen (dag 1)
<ol><li>Zet de muis in een acryl verdoving box geplaatst op een kachel mat aangepast aan 37 ° c met behulp van een ...

<ol>
	<li>Vogelsberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+galaxies+reproduced+by+a+hydrodynamic+simulation.">Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation.</a> Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+approach+identifies+genetic+nodes+and+networks+in+late-onset+Alzheimer&#8217;s+disease.">Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer&#8217;s disease.</a> Cell. 153 (3), 707-720 (2013).</li><li>Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization,+development+and+function+of+complex+brain+networks.">Organization, development and function of complex brain networks.</a> Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).</li><li>Shimono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+cell+density+and+networks+in+the+monkey+brain.">Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain.</a> Scientific Reports. 3, 2541 (2013).</li><li>DeFelipe, J., Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+MEA+development.">A history of MEA development.</a> Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clusters,+hubs,+and+communities+in+the+cortical+microconnectome.">Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).</li><li>Amunts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigBrain:+An+Ultrahigh-Resolution+3D+Human+Brain+Model.">BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model.</a> Science. 340, 1472-1475 (2013).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigid+and+non-rigid+registration+of+polarized+light+imaging+data+for+3D+reconstruction+of+the+temporal+lobe+of+the+human+brain+at+micrometer+resolution.">Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution.</a> NeuroImage. 181, 235-251 (2018).</li><li>Kozai, T. D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).</li><li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+color+optogenetic+control+of+neural+populations+using+low-noise,+multishank+optoelectrodes.">Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).</li><li>Hellwig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+local+connectivity+between+pyramidal+neurons+in+layers+2/3+of+the+rat+visual+cortex.">A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex.</a> Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).</li><li>Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+spatial+with+ontological+brain+regions+using+Java+tools+for+visualization,+database+access,+and+integrated+data+analysis.">Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis.</a> Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).</li><li>Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cell+communication+within+local+networks+in+layer+2/3+of+rat+neocortex.">Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex.</a> The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).</li><li>Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+cortical+column:+abundance+and+physiology+of+horizontal+connections+imply+a+strong+role+for+inputs+from+the+surround.">Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround.</a> Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).</li><li>Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+reconstruction+by+wrapping+finite+point+sets+in+space.">Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space.</a> Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).</li><li>Roland, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+atlas:+For+high&#8208;resolution+functional+and+anatomical+mapping.">Human brain atlas: For high&#8208;resolution functional and anatomical mapping.</a> Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxholm+space:+an+image-based+reference+for+coordinating+mouse+brain+research.">Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research.</a> NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).</li><li>Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+templates+and+atlases.">Brain templates and atlases.</a> NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).</li><li>Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain/MINDS&#8211;a+new+program+for+comprehensive+analyses+of+the+brain.">Brain/MINDS&#8211;a new program for comprehensive analyses of the brain.</a> Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).</li><li>Shimono, M., Hatano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+communication+dynamics+on+macro-connectome,+and+the+propagation+speed.">Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).</li></ol>

We ontwikkelden een nieuw protocol genaamd het 3D-NEO protocol om macroscopische en microscopische ruimtelijke schalen te overbruggen door twee hersen oppervlakken nauwkeuriger te overlappen dan voorheen. Oorspronkelijk waren er twee uitdagingen bij het maken van dit protocol dat de nauwkeurige overlapping van twee beelden van het hersen oppervlak mogelijk maakte en gezonde neuronale activiteiten van levende organismen vastlegt. Eerste, het was noodzakelijk om effectief te vegen snij oplossing rond de geëxtraheerde hers...

Niet-uniforme Multi-Scale architecturen op verschillende fysieke en biologische organisaties worden vaak gevonden1,2. De hersenen is ook een zeer niet-uniforme en Multi-Scale netwerkorganisatie3,4. Verschillende cognitieve functies zijn gecodeerd in dergelijke netwerk organisaties, het houden van tijdelijke veranderingen van de elektrische Spike patronen van neuronale populaties in de submilliseconde tijdelijke resoluties. Historisch gezien werden de complexe netwerken onder neuronen in detail structureel waargenomen met behulp van de kleurings technieken van Santiago Ramón y Cajal van meer dan 150 jaar geleden5. Om het groepsgedrag van actieve neuronen te observeren, hebben onderzoekers verschillende opname technologieën ontwikkeld6,7,8, en de recente belangrijke ontwikkelingen van dergelijke technologieën hebben ons in staat om op te nemen elektrische activiteiten van enorme aantallen neuronen tegelijk. Bovendien, uit dergelijke functionele activiteiten, wetenschappers zijn erin geslaagd om te reconstrueren netwerken van causale interacties tussen enorme aantallen neuronen en hebben uitgeroepen tot de topologische architectuur van hun complexe interacties ' microconnectome '9 . Macroscopische waarnemingen van de hersenen zorgen ook voor een hele hersenen als een netwerkorganisatie, omdat veel hersengebieden zijn verbonden door meerdere vezelbundels. Het insluiten van microconnectomes in de wereldwijde hersen kaart heeft nog steeds duidelijke beperkingen binnen de huidige technologische vooruitgang, daarom is dit insluitings protocol zo belangrijk. Er zijn echter veel uitdagingen voor de ontwikkeling van het insluitings protocol. Bijvoorbeeld, om activiteiten van levende lokale neuronale circuits in puur geïsoleerde hersengebieden observeren, hersenen segmenten moeten worden geproduceerd voor in vitro opnames. Bovendien zijn opnames uit hersen segmenten voor in vitro opnames nog steeds een belangrijke keuze voor ten minste twee redenen. Ten eerste is het nog steeds niet gemakkelijk om activiteiten van vele levende individuele neuronen tegelijkertijd te observeren uit hersengebieden die dieper zijn dan ~ 1,5 mm en in hoge temporele resolutie (< 1 MS). Ten tweede, wanneer we hopen te weten de interne architectuur van een lokale neuronale circuit, we moeten stoppen met alle inputs afkomstig uit externe hersengebieden om verstorende factoren te elimineren. Om de richtingen en posities van geproduceerde hersen sneden te identificeren, zal het verder nodig zijn om de ruimtelijke posities van deze geproduceerde hersen segmenten te integreren met behulp van coördinaten. Er zijn echter een paar systematische en betrouwbare manieren om hersen sneden op een georganiseerde manier te maken10,11. Hier wordt een nieuw coregistration-protocol geïntroduceerd, met behulp van 3D-scantechnologie voor neurowetenschappelijk onderzoek om een integratief protocol te bieden. Dit protocol werkt aan de coördinatie van micro-en macro weegschalen en insluiten van multi-elektrode array (MEA) microdata12,13 en kleurings gegevens op een macroscopische MRI-ruimte via 3D-scan oppervlakken van geëxtraheerde hersenen, evenals van niet-invasief opgenomen hersenen. Verrassend genoeg toonde dit een afstand fout van slechts ~ 50 μm als de modus waarde van het histogram. Als gevolg hiervan waren de modus waarden van de minimale afstanden tussen twee oppervlakken tussen het MRI-oppervlak en het gescande 3D-oppervlak bijna 50 μm voor alle zes muizen, wat een geschikt getal is bij het controleren op gemeenschappelijkheid bij individuen. De typische segment breedte had een opgenomen Spike-activiteit van ongeveer 300 μm.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td>Kimura Medical</td>
			<td>KA-100</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia box</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>RIC-01</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>NS-5000A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67, clone 1G10.2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chrolide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06729-55</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08809-45</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved blunt forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td></td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16605-42</td>
			<td>re-secctioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>HM-10</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat controller</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>BWT-100A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>MR-compatible Small Animal Heating System</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie</td>
			<td></td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>MKIIIai</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Slicer</td>
			<td>DOSAKA</td>
			<td>Neo Linear Slicer MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chrolide Hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxOne Single-Well MEA</td>
			<td>MaxWell Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring software</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>PC-SAM V.5.12</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI compatible cradle</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T12812</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI coil</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T9988</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI operation software</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>ParaVision 5.1</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo LinearSlicer MT</td>
			<td>D.S.K.</td>
			<td>NLS-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24307</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure-sensitive respiration sensor</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RS-301</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preclinical MRI scanner</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>BioSpec 70/20 USR</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid Sodium Salt</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>29806-54</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAN in a BOX</td>
			<td>Open Technologies srl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve bottle</td>
			<td>TIGERCROWN</td>
			<td>81</td>
			<td>For 3D scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-09705</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogensulfite</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31220-15</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor temperature probe</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RTP-101-B, PLTPC-300</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth bar</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T10146</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged intravenous needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SV-23CLK</td>
			<td>For perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35436-01</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Hydrochloric Acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>37314-15</td>
			<td>For pH adjustment of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol

Het menselijk brein, zijnde een Multi-Scale systeem, heeft zowel macroscopische elektrische signalen, wereldwijd stroomt langs dikke witte vezelbundels, en microscopische neuronale pieken, propageren langs axonen en dendrieten. Beide weegschalen vullen verschillende aspecten van menselijke cognitieve en gedragsfuncties aan. Op macroscopisch niveau is MRI de huidige standaard beeldvormingstechnologie, waarbij de kleinste ruimtelijke resolutie, Voxel-grootte, 0,1 – 1 mm3is. Ook, op microscopisch niveau, eerdere fysiologische studies waren op de hoogte van niet-uniforme neuronale architecturen binnen dergelijke voxels. Deze studie ontwikkelt een krachtige manier om nauwkeurig microscopische gegevens in te bedden in een macroscopische kaart door interfacing biologisch wetenschappelijk onderzoek met technologische vooruitgang in 3D-scantechnologie. Aangezien 3D-scantechnologie is meestal gebruikt voor engineering en industrieel ontwerp tot nu toe, het is voorzien voor de eerste keer om microconnectomes in de hele hersenen insluiten terwijl het behoud van natuurlijke steking in levende hersencellen. Om dit doel te bereiken, hebben we eerst een scan protocol gebouwd om nauwkeurige 3D-beelden te verkrijgen van levende bio-organismen die inherent uitdagend zijn voorbeeld door vochtige en reflecterende oppervlakken. Ten tweede, we getraind om de snelheid te houden om te voorkomen dat de afbraak van levende hersenweefsel, dat is een belangrijke factor in het behoud van betere omstandigheden en het opnemen van meer natuurlijke neuronale pieken van actieve neuronen in het hersenweefsel. Twee corticale oppervlakte beelden, onafhankelijk geëxtraheerd uit twee verschillende Imaging modules, namelijk MRI en 3D scanner oppervlakte beelden, verrassend Toon een afstand fout van slechts 50 μm als modus waarde van het histogram. Deze nauwkeurigheid is vergelijkbaar in schaal met de microscopische resolutie van intercellulaire afstanden; ook is het stabiel onder verschillende individuele muizen. Dit nieuwe protocol, de 3D-roman Embedding overlappende (3D-NEO) protocol, overbrugt macroscopische en microscopische niveaus afgeleid door dit integratieve protocol en versnelt nieuwe wetenschappelijke bevindingen om uitgebreide connectiviteits architecturen te bestuderen (d.w.z. microconnectome).

We beoordeelden afstanden tussen corticale oppervlakken, geproduceerd door het strippen van MRI-volume, en oppervlakken verkregen uit 3D-scans van geëxtraheerde hersenen. De modus waarden van het histogram van de afstanden zijn slechts 55 μm (Figuur 3a). Bovendien bereikt de gecumuleerde waarde bij het accumuleren van het histogram vanaf het punt waar de afstand gelijk is aan nul, 90% van de totale monster aantallen bij ~ 300 μm (Figuu...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol at JoVE.com

3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

3D scanning technologie bridging micro circuits en Macroscale hersen beelden in 3D novel insluiten overlappend Protocol

Dit artikel introduceert een experimenteel protocol met behulp van 3D-scantechnologie die twee ruimtelijke schalen overbrugt: de macroscopische ruimtelijke schaal van de anatomie van de gehele hersenen die wordt afgebeeld door een MRI op > 100 μm en de microscopische ruimtelijke schaal van neuronale verdelingen met behulp van Immunohistochemie-kleuring en een multi elektrode-array systeem en andere methoden (~ 10 μm).

The human brain, being a multiscale system, has both macroscopic electrical signals, globally flowing along thick white-matter fiber bundles, and ...

Dit protocol is de eerste die 3D-scantechnologie introduceert in het anatomische, met name neuroanatomisch onderzoeksveld, en heeft zeer nauwkeurige overlappende prestaties bereikt. De 3D neuro inbedding overlappen, of 3D-neuro protocol, integreert micro-schaal steriele sockets in macro-schaal hersenbeelden, en bruggen deze verschillende ruimtelijke schalen naadloos. We moeten ook het 3D neuro protocol toepassen op menselijke MRI's en postmortem hersenen.De overlappende stelt ons in staat om bekende MRI-contrastpatronen met betrekking tot ziekten te identificeren. 3D-scansystemen zijn gevoelig voor water rondom het geëxtraheerde bio-organisme, dus het is van cruciaal belang om het water zeer zorgvuldig af te vegen. Bovendien moet de procedure zo snel mogelijk worden uitgevoerd.Begin deze procedure met de voorbereiding van een muis, evenals MRI-acquisities en apparatuurvoorbereidingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Snijd op dag twee de hoofdhuid van een eerder geëuthanaseerde muis langs de sagittale hechting met behulp van een chirurgische schaar. Gebruik chirurgische schaar om de schedel te snijden in diagonale richtingen van de lambda punt naar een punt een beetje in de voorkant van de bregma.Dan, voorzichtig schil van de schedel uit de hersenen met behulp van gebogen pincet. Til de hersenen op met een spatel en breng deze over naar een petrischaaltje met ijskoude snijoplossing. Met behulp van een externe gasbom met een gecontroleerde roterende pompsnelheid, stroomlucht met 95% zuurstof en 5% kooldioxide om kleine bellen te genereren in de ijskoude snijoplossing.Na een tot twee minuten, zet de hersenen op een microvezel doek waarvan het oppervlak is iets bedekt met een bloem zeef. Veeg voorzichtig de vloeistof van het hersenoppervlak met behulp van de microvezeldoek. Zet de hersenen, met zijn dorsale aspect omhoog, op de monsterstandaard.Plaats vervolgens de monsterstandaard in het midden van de automatische draaitafel. Maak de kamer donkerder tijdens de 3D-scan en voer een 3D-scan uit op de draaitafel. Als u wilt testen of de 3D-scan goed werkt, klikt u op 3D-scan door de hoek tussen twee opnamen als 22,5, de starthoek als nul en de laatste hoek als 360 te selecteren.Verplaats de hersenen naar een petrischaaltje en bel de hersenen in de snijoplossing gedurende ongeveer 10 seconden. Snijd de hersenen in twee blokken in het midden van het coronale vlak, met behulp van een scalpel. Beweeg vervolgens de twee hersenblokken voorzichtig naar het vlakke oppervlak met behulp van een chirurgische spatel.Bevestig de hersenblokken van het hersenblok basis met behulp van instant lijm. Veeg de vloeistof voorzichtig en zorgvuldig van het hersenoppervlak binnen een tot twee minuten, met behulp van de microvezeldoek. Voer vervolgens opnieuw een 3D-scan uit.Bevestig een mes aan de bladhouder van het vibratome. Bevestig de zwarte tape die het midden van de basis van het hersenblok bedekt tot het midden van het snijstadium voor een vibratome. Giet de snijoplossing in de snijfase en zet het snijstadium op het vibratome.Pas de snijsnelheid en amplitude aan. Maak twee tot vijf coronale plakjes van 300 micron dik van de twee hersenblokken. Houd de oplossing in de snijfase borrelen indien mogelijk.Optimaliseer de snijsnelheid, frequentie en trillingsamplitude van het systeem door ze in te stellen als 12,7 millimeter per minuut voor de snelheid, 87 tot 88 hertz voor de frequentie en 0,8 tot 1,0 millimeter voor de swingbreedte. Terwijl u de hersensegmenten snijdt, registreert u de gesneden coördinaat in het formaat, inclusief de voorste coördinaat, halfrond en andere voorwaarden. Breng de plakjes van de hersenen voorzichtig over op een beker gevuld met voorverwarmde ACSF met behulp van een dikke plastic pipet.Incubeer de hersenen plakjes in het bekerglas op ongeveer 34 graden Celsius voor een uur. Gedurende deze tijd, voer een 3D-scan van de resterende hersenblokken op het snijstadium. Stel nu een multielectrode array, of MEA-chip, in op een opname-eenheid.Sluit de chip aan op een peristaltische pomp met twee buizen. Gebruik een buis om dezelfde ACSF gids in de MEA-chip en de andere buis om de ACSF gids uit de MEA-chip. Bevestig twee naalden, verbonden aan de uiteinden van de twee buizen, aan de bovenkant van de muur van de MEA-chip.Fix hun posities met hun tips na de binnenwand van de MEA chip. Stel de stroomsnelheid van de ACSF in op 4,1 RPM. Voer MRI-gegevensverwerking uit om corticale volumes te extraheren zoals beschreven in het tekstprotocol.Download de vrije 3D Slicer-software om MRI-beeldverwerking uit te voeren. Open de MR-afbeeldingen van de geëxtraheerde hersenen die zijn geproduceerd met behulp van de volumeweergave- en editormodules in de 3D Slicer. Verander de modus van editor naar volumeweergave en klik op een doelknop om de afbeelding van de hersenen naar het midden van het scherm te laten komen.Selecteer de MRT-2 hersenmodus en stem de drempels af door de shiftbalk te verplaatsen. Ga vervolgens terug van volumeweergave naar editor en klik op de knop drempelwaarde-effect. Breng het etiket 41 aan, hersenschors.Sla vervolgens de gegevens van het hersenoppervlak op als een STL-bestand door de bestandsindeling te wijzigen van VTK naar STL op de checklist van het formulier. Voer een automatische coregistratie uit tussen acht of 16 afbeeldingen uit acht of zestien verschillende hoeken binnen een reeks van een scan om kleine mismatches te corrigeren. Klik hiervoor op Globale registratie die is opgenomen in de uitlijningsoptie en integreer de afbeeldingen.Herhaal scans vanuit verschillende hoeken om het hele hersenoppervlak te verkrijgen. Als de integratie tussen afbeeldingen die vanuit verschillende hoeken worden gescand, niet is geslaagd, klikt u op Handmatig uitlijnen en selecteert u een paar vaste afbeeldingen en een bewegend beeld. Start de handmatige uitlijning van de afbeeldingen door drie of vier veelvoorkomende punten in verschillende afbeeldingen te selecteren.Klik vervolgens op OK. Het optimalisatiealgoritme is het iteratieve dichtstbijzijnde-puntalgoritme en bevat geen niet-lineaire vervorming. Maak een gaas van alle uitgelijnde afbeeldingen door alle afbeeldingen te selecteren en op de knop voor het genereren van gaas te klikken. Selecteer vervolgens de optie, klein artistiek object, om het net op de hoogste resolutie te krijgen.Sla de afbeelding op als STL Binary- of ASCII-indeling. Open nu het MRI-oppervlak en voeg het samen met het 3D-scanoppervlak met behulp van de oppervlakteverwerkingssoftware. Voer een handmatig uitlijningsproces uit zoals voorheen.Sla vervolgens deze coregistered surface images opnieuw op. Maak indien nodig de afzonderlijke oppervlaktegegevens schoon door kleine geluiden rond het hersengebied te wissen, vooral in het geval van de MRI-gegevens, en door gaten te vullen, vooral in het geval van de 3D-scangegevens. Open ten slotte de oppervlaktegegevens met data-analysesoftware zoals MATLAB.Het genereren en evalueren van de histogrammen van de minimale afstanden tussen de twee oppervlakken. Afstanden werden geëvalueerd tussen corticale oppervlakken geproduceerd door het strippen van MRI-volume en oppervlakken verkregen uit 3D-scans van geëxtraheerde hersenen. De moduswaarden van het histogram van de afstanden zijn slechts 55 micron.Bovendien, bij het accumuleren van het histogram vanaf het punt waar de afstand gelijk is aan nul, de geaccumuleerde waarde bereikt 90% van de totale steekproef nummers op ongeveer 300 micron. Het laatste histogram van de afstanden tussen twee oppervlakken toonde een typische piek rond 50 micron. Vanuit macroscopisch oogpunt komt deze moduswaarde overeen met de geometrische beperking, die 100 micron was van de voxelgrootte van MRI's.Dit punt suggereert indirect dat het overlappende algoritme tussen de MRI en 3D-scan uitstekend werkte, en dat de geluidsniveaus van zowel de MRI als de 3D-scan werden onderdrukt als een lage waarde. Dit protocol is de eerste om uprise door middel van de scantechnologie om bio-organisme. De technologie werd oorspronkelijk gebruikt voor zuiver technische eisen.Het toepassen van deze technologie op de geneeskunde kan nieuwe vragen beantwoorden. Na 3D-scanning kunnen we calcium-imaging wall patch gram-opnamen gebruiken om aanvullende kennis te krijgen in termen van temporele en ruimtelijke resolutie en opneembare aantallen cellen. De zeer nauwkeurige overlappende prestaties die dit protocol biedt, maken een naadloze associatie tussen de anatomische ruimtelijke schaal en de nul-ruimtelijke schaal realistischer dan voorheen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Met behulp van 3D-printtechnologie om samenvoegen MRI met de histologie: A Protocol for Brain Snijden

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live beelden van GLUT4 eiwit mensenhandel muis primaire hypothalame neuronen met behulp van deconvolutie microscopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Een roman In Vitro Model van traumatische hersenenverwonding Blast

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Een methode voor 3D reconstructie en Virtual Reality analyse van gliale en neuronale cellen

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...