Name: 3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol
Uploaded: 2019-05-12T13:00:00
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M.S. ist dankbar für die Unterstützung aller Mitarbeiter des medizinischen Informatikkurses in der Graduate School of Medicine und der Medizinischen Fakultät und dankt Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto und Doris Zakian für ihre hilfreiche Kommentare. Diese Studie wurde von einem Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research und dem Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) Programm an M.S. von MEXT (Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie) unterstützt. Die MRT-Experimente in dieser Arbeit wurden in der Abteilung für Kleintier-MRT, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan durchgeführt.

Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierpflege der Universität Kyoto genehmigt.
1. Tiere (Tag 1)
<ol><li>Bereiten Sie weibliche C57BL/6J-Mäuse vor(n = 6, im Alter von 3 bis 5 Wochen). HINWEIS: Dieses Protokoll gilt für alle Nagetierarten.</li>
</ol>2. MRT-Einstellungen (Tag 1)
<ol><li>Legen Sie die Maus in eine Acrylanästhesie-Box auf einer Heizmatte auf 37 °C eingestellt mit einem Heizmatt-Co...

<ol>
	<li>Vogelsberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+galaxies+reproduced+by+a+hydrodynamic+simulation.">Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation.</a> Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+approach+identifies+genetic+nodes+and+networks+in+late-onset+Alzheimer&#8217;s+disease.">Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer&#8217;s disease.</a> Cell. 153 (3), 707-720 (2013).</li><li>Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization,+development+and+function+of+complex+brain+networks.">Organization, development and function of complex brain networks.</a> Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).</li><li>Shimono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+cell+density+and+networks+in+the+monkey+brain.">Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain.</a> Scientific Reports. 3, 2541 (2013).</li><li>DeFelipe, J., Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+MEA+development.">A history of MEA development.</a> Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clusters,+hubs,+and+communities+in+the+cortical+microconnectome.">Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).</li><li>Amunts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigBrain:+An+Ultrahigh-Resolution+3D+Human+Brain+Model.">BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model.</a> Science. 340, 1472-1475 (2013).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigid+and+non-rigid+registration+of+polarized+light+imaging+data+for+3D+reconstruction+of+the+temporal+lobe+of+the+human+brain+at+micrometer+resolution.">Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution.</a> NeuroImage. 181, 235-251 (2018).</li><li>Kozai, T. D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).</li><li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+color+optogenetic+control+of+neural+populations+using+low-noise,+multishank+optoelectrodes.">Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).</li><li>Hellwig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+local+connectivity+between+pyramidal+neurons+in+layers+2/3+of+the+rat+visual+cortex.">A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex.</a> Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).</li><li>Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+spatial+with+ontological+brain+regions+using+Java+tools+for+visualization,+database+access,+and+integrated+data+analysis.">Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis.</a> Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).</li><li>Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cell+communication+within+local+networks+in+layer+2/3+of+rat+neocortex.">Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex.</a> The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).</li><li>Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+cortical+column:+abundance+and+physiology+of+horizontal+connections+imply+a+strong+role+for+inputs+from+the+surround.">Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround.</a> Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).</li><li>Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+reconstruction+by+wrapping+finite+point+sets+in+space.">Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space.</a> Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).</li><li>Roland, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+atlas:+For+high&#8208;resolution+functional+and+anatomical+mapping.">Human brain atlas: For high&#8208;resolution functional and anatomical mapping.</a> Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxholm+space:+an+image-based+reference+for+coordinating+mouse+brain+research.">Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research.</a> NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).</li><li>Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+templates+and+atlases.">Brain templates and atlases.</a> NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).</li><li>Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain/MINDS&#8211;a+new+program+for+comprehensive+analyses+of+the+brain.">Brain/MINDS&#8211;a new program for comprehensive analyses of the brain.</a> Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).</li><li>Shimono, M., Hatano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+communication+dynamics+on+macro-connectome,+and+the+propagation+speed.">Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).</li></ol>

Wir haben ein neues Protokoll namens 3D-NEO-Protokoll entwickelt, um makroskopische und mikroskopische räumliche Skalen zu überbrücken, indem zwei Gehirnoberflächen genauer als zuvor überlappen. Ursprünglich gab es zwei Herausforderungen bei der Erstellung dieses Protokolls, das die genaue Überlappung zweier Gehirnoberflächenbilder ermöglichte und gesunde neuronale Aktivitäten von lebenden Organismen aufzeichnete. Erstens war es notwendig, die Schneidlösung, die das extrahierte Gehirn umgibt, effektiv abzuwisc...

Uneinheitliche multiskalen Architekturen in verschiedenen physikalischen und biologischen Organisationen sind häufig gefunden1,2. Das Gehirn ist auch eine sehr uneinheitliche und multiskalige Netzwerkorganisation3,4. Verschiedene kognitive Funktionen sind in solchen Netzwerkorganisationen kodiert, die zeitliche Veränderungen der elektrischen Spitzenmuster neuronaler Populationen in submillisekundenzeitlichen Auflösungen halten. Historisch gesehen wurden die komplexen Netzwerke zwischen Neuronen strukturell detailliert beobachtet, indem man die Färbetechniken von Santiago Ramon y Cajal von vor über 150 Jahrenverwendete 5. Um das Gruppenverhalten aktiver Neuronen zu beobachten, haben forscher verschiedene Aufzeichnungstechnologien entwickelt6,7,8, und die jüngsten bedeutenden Entwicklungen solcher Technologien haben es uns ermöglicht, elektrische Aktivitäten von einer großen Anzahl von Neuronen gleichzeitig. Darüber hinaus ist es Wissenschaftlern aus solchen funktionellen Aktivitäten gelungen, Netzwerke kausaler Wechselwirkungen zwischen einer großen Anzahl von Neuronen zu rekonstruieren und die topologische Architektur ihrer komplexen Wechselwirkungen als "Mikroconnectom" bezeichnet zu haben9 . Makroskopische Beobachtungen des Gehirns ermöglichen auch die Bezug auf ein ganzes Gehirn als Netzwerkorganisation, da viele Hirnregionen durch mehrere Faserbündel verbunden sind. Die Einbettung von Mikroconnectomen in die globale Hirnkarte hat immer noch klare Grenzen innerhalb des aktuellen technologischen Fortschritts, weshalb dieses Einbettungsprotokoll so wichtig ist. Die Entwicklung des Einbettungsprotokolls stellt jedoch viele Herausforderungen dar. Um beispielsweise Aktivitäten lebender lokaler neuronaler Schaltkreise in rein isolierten Hirnregionen zu beobachten, müssen Hirnscheiben für In-vitro-Aufnahmen produziert werden. Darüber hinaus sind Aufnahmen von Gehirnscheiben für In-vitro-Aufnahmen aus mindestens zwei Gründen immer noch eine wichtige Wahl. Erstens ist es immer noch nicht einfach, Aktivitäten vieler lebender einzelner Neuronen gleichzeitig aus Hirnregionen zu beobachten, die tiefer als 1,5 mm und in hoher zeitlicher Auflösung (<1 ms) liegen. Zweitens, wenn wir hoffen, die interne Architektur eines lokalen neuronalen Schaltkreises zu kennen, müssen wir alle Eingaben aus externen Gehirnregionen stoppen, um verwirrende Faktoren zu beseitigen. Um die Richtungen und Positionen der produzierten Hirnscheiben zu identifizieren, wird es weiterhin notwendig sein, die räumlichen Positionen dieser produzierten Gehirnscheiben mithilfe von Koordinaten zu integrieren. Es gibt jedoch ein paar systematische und zuverlässige Möglichkeiten, Gehirnscheiben in organisierter Weise zu machen10,11. Hier wird ein neues Co-Registrierungsprotokoll eingeführt, das 3D-Scanning-Technologie für die neurowissenschaftliche Forschung nutzt, um ein integratives Protokoll zu liefern. Dieses Protokoll dient der Koordination von Mikro- und Makroskalen und der Einbettung von Multielektroden-Array (MEA)-Mikrodaten12,13 und Der Färbung von Daten auf einen makroskopischen MRT-Raum durch 3D-Scan-Oberflächen von extrahierten Gehirnen sowie nicht invasiv aufgezeichnete Gehirne. Überraschenderweise zeigte dies einen Entfernungsfehler von nur 50 m als Moduswert des Histogramms. Infolgedessen lagen die Moduswerte der Mindestabstände zwischen zwei Oberflächen zwischen der MRT-Oberfläche und der gescannten 3D-Oberfläche für alle sechs Mäuse bei fast 50 m, was bei der Überprüfung auf Gemeinsamkeit unter Individuen eine geeignete Zahl darstellt. Die typische Schnittbreite hatte eine aufgezeichnete Spitzenaktivität von ca. 300 m.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td>Kimura Medical</td>
			<td>KA-100</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia box</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>RIC-01</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>NS-5000A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67, clone 1G10.2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chrolide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06729-55</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08809-45</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved blunt forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td></td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16605-42</td>
			<td>re-secctioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>HM-10</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat controller</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>BWT-100A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>MR-compatible Small Animal Heating System</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie</td>
			<td></td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>MKIIIai</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Slicer</td>
			<td>DOSAKA</td>
			<td>Neo Linear Slicer MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chrolide Hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxOne Single-Well MEA</td>
			<td>MaxWell Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring software</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>PC-SAM V.5.12</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI compatible cradle</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T12812</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI coil</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T9988</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI operation software</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>ParaVision 5.1</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo LinearSlicer MT</td>
			<td>D.S.K.</td>
			<td>NLS-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24307</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure-sensitive respiration sensor</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RS-301</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preclinical MRI scanner</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>BioSpec 70/20 USR</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid Sodium Salt</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>29806-54</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAN in a BOX</td>
			<td>Open Technologies srl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve bottle</td>
			<td>TIGERCROWN</td>
			<td>81</td>
			<td>For 3D scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-09705</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogensulfite</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31220-15</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor temperature probe</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RTP-101-B, PLTPC-300</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth bar</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T10146</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged intravenous needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SV-23CLK</td>
			<td>For perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35436-01</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Hydrochloric Acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>37314-15</td>
			<td>For pH adjustment of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol

Das menschliche Gehirn, ein Multiskalensystem, hat sowohl makroskopische elektrische Signale, die global entlang dicker weißer Faserbündel fließen, als auch mikroskopische neuronale Spitzen, die sich entlang axons und dendriten ausbreiten. Beide Skalen ergänzen verschiedene Aspekte der menschlichen kognitiven und Verhaltensfunktionen. Auf makroskopischer Ebene ist die MRT die aktuelle Standard-Bildgebungstechnologie, bei der die kleinste räumliche Auflösung, die Voxelgröße, 0,1–1 mm3beträgt. Auch auf mikroskopischer Ebene waren sich frühere physiologische Studien ungleichmäßiger neuronaler Architekturen innerhalb solcher Voxel bewusst. Diese Studie entwickelt eine leistungsstarke Möglichkeit, mikroskopische Daten genau in eine makroskopische Karte einzubetten, indem biologische wissenschaftliche Forschung mit technologischen Fortschritten in der 3D-Scanning-Technologie in Verbindung gebracht wird. Da die 3D-Scanning-Technologie bisher vor allem für Engineering und Industriedesign eingesetzt wurde, wird sie erstmals umfunktioniert, um Mikroconnectome in das gesamte Gehirn einzubetten und dabei das natürliche Spiking in lebenden Gehirnzellen zu erhalten. Um diesen Zweck zu erreichen, haben wir zunächst ein Scanprotokoll erstellt, um genaue 3D-Bilder von lebenden Bioorganismen zu erhalten, die aufgrund feuchter und reflektierender Oberflächen von Natur aus eine Herausforderung für das Bild darstellen. Zweitens haben wir trainiert, um die Geschwindigkeit zu halten, um den Abbau von lebendem Hirngewebe zu verhindern, was ein Schlüsselfaktor für die Beibehaltung besserer Bedingungen und die Aufzeichnung natürlicherer neuronaler Spitzen aus aktiven Neuronen im Gehirngewebe ist. Zwei kortikale Oberflächenbilder, die unabhängig voneinander aus zwei verschiedenen Bildgebungsmodulen extrahiert werden, nämlich MRT- und 3D-Scanner-Oberflächenbilder, zeigen überraschenderweise einen Entfernungsfehler von nur 50 m als Moduswert des Histogramms. Diese Genauigkeit ist in der Skala mit der mikroskopischen Auflösung interzellulärer Entfernungen vergleichbar; auch, Es ist stabil unter verschiedenen einzelnen Mäusen. Dieses neue Protokoll, das 3D-Roman-Einbettungsprotokoll (3D-NEO), überbrückt makroskopische und mikroskopische Ebenen, die durch dieses integrative Protokoll abgeleitet werden, und beschleunigt neue wissenschaftliche Erkenntnisse, um umfassende Konnektivitätsarchitekturen zu untersuchen (d. h. Mikroconnectom).

Wir untersuchten Abstände zwischen kortikalen Oberflächen, die durch Abisolieren des MRT-Volumens erzeugt wurden, und Oberflächen, die aus 3D-Scans extrahierter Gehirne gewonnen wurden. Die Moduswerte des Histogramms der Abstände betragen nur 55 m (Abbildung 3a). Wenn das Histogramm von dem Punkt, an dem der Abstand gleich Null ist, akkumuliert wird, erreicht der akkumulierte Wert 90 % der gesamten Stichprobenzahlen bei 300 m (Abbildung<strong class="xfig...

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3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

3D-Scanning-Technologie Überbrückung von Mikroschaltungen und Makroskalen-Gehirnbildern in 3D-Neuartigem Einbetten von Überlappungsprotokollen

Dieser Artikel stellt ein experimentelles Protokoll vor, das die 3D-Scanning-Technologie verwendet, die zwei räumliche Skalen überbrückt: die makroskopische räumliche Skala der Anatomie des gesamten Gehirns, die durch die MRT auf >100 m abgebildet wird, und die mikroskopische räumliche Skala neuronaler Verteilungen unter Verwendung von immunhistochemische Färbung und ein Multielektroden-Array-System und andere Methoden (ca. 10 m).

The human brain, being a multiscale system, has both macroscopic electrical signals, globally flowing along thick white-matter fiber bundles, and ...

Dieses Protokoll ist das erste, das 3D-Scanning-Technologie im anatomischen, speziell neuroanatomischen Forschungsbereich einführt und eine hochpräzise Überlappungsleistung erzielt hat. Die 3D-Neuro-Einbettungsüberlappung oder das 3D-Neuroprotokoll bettet sterile Mikrosteckdosen in Makro-Skala-Gehirnbilder ein und überbrückt diese verschiedenen räumlichen Skalen nahtlos. Wir müssen auch das 3D-Neuroprotokoll auf menschliche MRTs und post-mortem Gehirn anwenden.Die Überlappung ermöglicht es uns, bekannte MRT-Kontrastmuster im Zusammenhang mit Krankheiten zu identifizieren. 3D-Scansysteme reagieren empfindlich auf Wasser, das den extrahierten Bioorganismus umgibt, daher ist es wichtig, das Wasser sehr sorgfältig abzuwischen. Darüber hinaus muss das Verfahren so schnell wie möglich durchgeführt werden.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung einer Maus sowie MRT-Erfassungen und Gerätevorbereitungen, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie am zweiten Tag die Kopfhaut einer zuvor eingeschläferten Maus entlang der sagittalen Naht mit einer chirurgischen Schere. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Schädel in diagonale Richtungen vom Lambda-Punkt bis zu einem Punkt ein wenig vor dem Bregma zu schneiden.Dann schälen Sie den Schädel vorsichtig aus dem Gehirn mit gekrümmten Pinzette. Heben Sie das Gehirn mit einem Spachtel an und übertragen Sie es auf eine Petrischale mit eiskalter Schneidlösung. Mit einer externen Gasbombe mit einer kontrollierten drehbaren Pumpengeschwindigkeit, Strömungsluft mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid, um kleine Blasen in der eiskalten Schneidlösung zu erzeugen.Nach ein bis zwei Minuten das Gehirn auf ein Mikrofasertuch legen, dessen Oberfläche leicht mit einem Mehlsieb bedeckt ist. Wischen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit dem Mikrofasertuch von der Hirnoberfläche ab. Setzen Sie das Gehirn mit seinem dorsalen Aspekt auf den Probenständer.Platzieren Sie dann den Probenständer in der Mitte des automatischen Drehtellers. Verdunkeln Sie den Raum während des 3D-Scans und führen Sie einen 3D-Scan auf dem Plattenspieler durch. Um zu testen, ob der 3D-Scan gut funktioniert, klicken Sie auf 3D-Scan, indem Sie den Winkel zwischen zwei Aufnahmen als 22,5, den Startwinkel als Null und den letzten Winkel als 360 auswählen.Bewegen Sie das Gehirn zu einer Petrischale und blasen Sie das Gehirn in der Schneidlösung für etwa 10 Sekunden. Schneiden Sie das Gehirn in zwei Blöcke in der Mitte der koronalen Ebene, mit einem Skalpell. Dann bewegen Sie die beiden Gehirnblöcke sanft auf die flache Oberfläche mit einem chirurgischen Spachtel.Befestigen Sie die Gehirnblöcke der Gehirnblockbasis mit Instantkleber. Wischen Sie die Flüssigkeit mit dem Mikrofasertuch innerhalb von ein bis zwei Minuten vorsichtig von der Hirnoberfläche ab. Führen Sie dann erneut einen 3D-Scan durch.Befestigen Sie eine Klinge am Klingenhalter des Vibratom. Befestigen Sie das schwarze Band, das die Mitte der Gehirnblockbasis bedeckt, an der Mitte der Schnittstufe für ein Vibratome. Schneidlösung in die Schneidstufe gießen und die Schnittstufe auf das Vibratome stellen.Passen Sie die Schnittgeschwindigkeit und Amplitude an. Machen Sie zwei bis fünf koronale Scheiben von 300 Mikrometern dick aus den beiden Gehirnblöcken. Halten Sie die Lösung in der Schneidebühne sprudeln, wenn möglich.Optimieren Sie die Schnittgeschwindigkeit, Frequenz und Schwingungsamplitude des Systems, indem Sie sie auf 12,7 Millimeter pro Minute für die Geschwindigkeit, 87 bis 88 Hertz für die Frequenz und 0,8 bis 1,0 Millimeter für die Schwingbreite einstellen. Zeichnen Sie beim Schneiden der Gehirnscheiben die geschnittene Koordinate im Format auf, einschließlich der vorderen hinteren Koordinate, der Halbkugel und anderer Bedingungen. Übertragen Sie die Gehirnscheiben vorsichtig auf einen Becher, der mit vorgewärmten ACSF gefüllt ist, mit einer dicken Kunststoffpipette.Inkubieren Sie das Gehirn Scheiben in den Becher bei etwa 34 Grad Celsius für eine Stunde. Führen Sie während dieser Zeit einen 3D-Scan der verbleibenden Gehirnblöcke auf der Schnittstufe durch. Stellen Sie nun ein Multielektroden-Array oder einen MEA-Chip auf einer Aufnahmeeinheit ein.Schließen Sie den Chip mit zwei Rohren an eine peristaltische Pumpe an. Verwenden Sie ein Rohr, um den gleichen ACSF in den MEA-Chip zu führen, und das andere Rohr, um den ACSF aus dem MEA-Chip zu führen. Befestigen Sie zwei Nadeln, die an den Spitzen der beiden Rohre verbunden sind, an der Oberseite der Wand des MEA-Chips.Fixieren Sie ihre Positionen mit ihren Spitzen nach der Innenwand des MEA-Chips. Legen Sie den Durchfluss des ACSF auf 4,1 RPM fest. Führen Sie die MRT-Datenverarbeitung durch, um kortikale Volumina zu extrahieren, wie im Textprotokoll beschrieben.Um die MRT-Bildverarbeitung durchzuführen, laden Sie die kostenlose 3D Slicer-Software herunter. Öffnen Sie die MR-Bilder der extrahierten Gehirne, die mit den Volume-Rendering- und Editor-Modulen im 3D-Slicer erzeugt wurden. Ändern Sie den Modus vom Editor zum Lautstärke-Rendering, und klicken Sie auf eine Zielschaltfläche, damit das Bild des Gehirns in die Mitte des Bildschirms kommt.Wählen Sie den MRT-2-Gehirnmodus aus und stimmen Sie die Schwellenwerte ab, indem Sie die Schaltleiste bewegen. Wechseln Sie dann zurück vom Lautstärke-Rendering zum Editor, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Schwellenwerteffekt". Tragen Sie das Etikett 41, Großhirnrinde auf.Speichern Sie dann die Daten der Gehirnoberfläche als STL-Datei, indem Sie das Dateiformat in der Formular-Checkliste von VTK in STL ändern. Führen Sie eine automatische Koregistrierung zwischen acht oder 16 Bildern aus acht oder 16 verschiedenen Winkeln innerhalb einer Sequenz eines Scans durch, um kleine Nichtübereinstimmungen zu korrigieren. Klicken Sie dazu auf Globale Registrierung, die in der Ausrichtungsoption enthalten ist, und integrieren Sie die Bilder.Wiederholen Sie Scans aus verschiedenen Winkeln, um die gesamte Gehirnoberfläche zu erhalten. Wenn die Integration zwischen Bildern, die aus verschiedenen Winkeln gescannt wurden, nicht erfolgreich war, klicken Sie auf Manuelle Ausrichtung, und wählen Sie ein Paar festes Bild und ein bewegtes Bild aus. Starten Sie die manuelle Ausrichtung der Bilder, indem Sie drei oder vier gemeinsame Punkte in verschiedenen Bildern auswählen.Klicken Sie dann auf OK. Der Optimierungsalgorithmus ist der iterative Engpunktalgorithmus und enthält keine nichtlineare Verformung. Erstellen Sie ein Netz aller ausgerichteten Bilder, indem Sie alle Bilder auswählen und auf die Schaltfläche "Netzgenerierung" klicken. Wählen Sie dann die Option, kleines künstlerisches Objekt, um das Netz mit der höchsten Auflösung zu erhalten.Speichern Sie das Bild als STL Binary oder asCII-Format. Öffnen Sie nun die MRT-Oberfläche und verschmelzen Sie sie mit der 3D-Scanoberfläche mit der Oberflächenverarbeitungssoftware. Führen Sie wie zuvor einen manuellen Ausrichtungsprozess durch.Speichern Sie dann diese mitregistrierten Oberflächenbilder erneut. Reinigen Sie bei Bedarf die einzelnen Oberflächendaten, indem Sie kleine Geräusche rund um den Hirnbereich, insbesondere bei den MRT-Daten, löschen und löcherfüllen, insbesondere bei den 3D-Scandaten. Öffnen Sie schließlich die Oberflächendaten mit Datenanalysesoftware wie MATLAB.Generieren und bewerten Sie die Histogramme der Mindestabstände zwischen den beiden Flächen. Die Entfernungen zwischen kortikalen Oberflächen, die durch Abisolieren des MRT-Volumens erzeugt wurden, und Oberflächen, die aus 3D-Scans extrahierter Gehirne gewonnen wurden, wurden ausgewertet. Die Moduswerte des Histogramms der Entfernungen sind nur 55 Mikrometer.Wenn sie das Histogramm von dem Punkt anakkumulieren, an dem der Abstand gleich Null ist, erreicht der akkumulierte Wert 90 % der gesamten Stichprobenzahlen bei etwa 300 Mikrometern. Das endgültige Histogramm der Abstände zwischen zwei Oberflächen zeigte einen typischen Spitzenwert von etwa 50 Mikrometern. Aus makroskopischer Sicht entspricht dieser Moduswert der geometrischen Begrenzung, die 100 Mikrometer von der Voxelgröße der MRTs entfernt war.Dieser Punkt deutet indirekt darauf hin, dass der überlappende Algorithmus zwischen MRT und 3D-Scan hervorragend funktioniert hat und dass die Geräuschpegel sowohl des MRT als auch des 3D-Scans als niedriger Wert unterdrückt wurden. Dieses Protokoll ist das erste, das durch die Scan-Technologie zu Bioorganismus aufsteigt. Die Technologie wurde ursprünglich für rein technische Anforderungen eingesetzt.Die Anwendung dieser Technologie auf die Medizin kann neue Fragen beantworten. Nach dem 3D-Scannen können wir Kalzium-Imaging-Wand-Patch-Gramm-Aufnahmen verwenden, um ergänzende Kenntnisse in Bezug auf zeitliche und räumliche Auflösung und rekordbare Anzahl von Zellen zu erhalten. Die hochpräzise Überlappungsleistung, die dieses Protokoll bietet, wird eine nahtlose Verknüpfung zwischen der anatomischen räumlichen Skala und der Null-Raumskala realistischer als zuvor.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

3D-Drucktechnologie Verwendung MRI mit Histologie fusionieren: Ein Protokoll für Hirn Sectioning

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

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Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

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Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

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Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

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