Name: 3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol
Uploaded: 2019-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol at JoVE.com

טרשת נפוצה אסירת תודה על התמיכה של כל הצוות בקורס הנדסת מידע רפואי בבית הספר לרפואה והפקולטה לרפואה, ורוצה להודות לפרופ ' טטסויה טקאקווה, פרופ ' נובוקאטסו סורמוטו, ודוריס זקיאן לתועלת ערות. מחקר זה היה נתמך על ידי מענק סיוע למחקר גישוש מאתגרת ועל ידי היוזמה המובילה לתוכנית חוקרים צעירים מצוינים (מנהיג) לטרשת נפוצה מ-MEXT (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, וטכנולוגיה). ניסויי ה-MRI בעבודה זו בוצעו בחטיבה למטרות MRI של בעלי חיים קטנים, מרכז תמיכה במחקר רפואי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת קיוטו, יפן.

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קיוטו.
1. בעלי חיים (יום 1)
<ol><li>הכנת עכברים C57BL/6J (n = 6, בגיל 3 עד 5 שבועות). הערה: פרוטוקול זה חל על כל המינים המכרסמים.</li>
</ol>2. הגדרות MRI (יום 1)
<ol><li>לשים את העכבר בתיב...

<ol>
	<li>Vogelsberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+galaxies+reproduced+by+a+hydrodynamic+simulation.">Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation.</a> Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+approach+identifies+genetic+nodes+and+networks+in+late-onset+Alzheimer&#8217;s+disease.">Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer&#8217;s disease.</a> Cell. 153 (3), 707-720 (2013).</li><li>Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization,+development+and+function+of+complex+brain+networks.">Organization, development and function of complex brain networks.</a> Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).</li><li>Shimono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+cell+density+and+networks+in+the+monkey+brain.">Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain.</a> Scientific Reports. 3, 2541 (2013).</li><li>DeFelipe, J., Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+MEA+development.">A history of MEA development.</a> Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clusters,+hubs,+and+communities+in+the+cortical+microconnectome.">Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).</li><li>Amunts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigBrain:+An+Ultrahigh-Resolution+3D+Human+Brain+Model.">BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model.</a> Science. 340, 1472-1475 (2013).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigid+and+non-rigid+registration+of+polarized+light+imaging+data+for+3D+reconstruction+of+the+temporal+lobe+of+the+human+brain+at+micrometer+resolution.">Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution.</a> NeuroImage. 181, 235-251 (2018).</li><li>Kozai, T. D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).</li><li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+color+optogenetic+control+of+neural+populations+using+low-noise,+multishank+optoelectrodes.">Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).</li><li>Hellwig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+local+connectivity+between+pyramidal+neurons+in+layers+2/3+of+the+rat+visual+cortex.">A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex.</a> Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).</li><li>Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+spatial+with+ontological+brain+regions+using+Java+tools+for+visualization,+database+access,+and+integrated+data+analysis.">Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis.</a> Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).</li><li>Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cell+communication+within+local+networks+in+layer+2/3+of+rat+neocortex.">Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex.</a> The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).</li><li>Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+cortical+column:+abundance+and+physiology+of+horizontal+connections+imply+a+strong+role+for+inputs+from+the+surround.">Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround.</a> Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).</li><li>Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+reconstruction+by+wrapping+finite+point+sets+in+space.">Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space.</a> Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).</li><li>Roland, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+atlas:+For+high&#8208;resolution+functional+and+anatomical+mapping.">Human brain atlas: For high&#8208;resolution functional and anatomical mapping.</a> Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxholm+space:+an+image-based+reference+for+coordinating+mouse+brain+research.">Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research.</a> NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).</li><li>Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+templates+and+atlases.">Brain templates and atlases.</a> NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).</li><li>Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain/MINDS&#8211;a+new+program+for+comprehensive+analyses+of+the+brain.">Brain/MINDS&#8211;a new program for comprehensive analyses of the brain.</a> Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).</li><li>Shimono, M., Hatano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+communication+dynamics+on+macro-connectome,+and+the+propagation+speed.">Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).</li></ol>

פיתחנו פרוטוקול חדש שנקרא פרוטוקול 3D-NEO לגשר מאקרוסקופי ומיקרוסקופית קשקשים מרחבית על ידי חופפים שני משטחי המוח בצורה מדויקת יותר מבעבר. במקור, היו שני אתגרים ביצירת פרוטוקול זה אשר הפכה את החפיפה המדויקת של שתי תמונות משטח המוח והקלטת פעילויות נוירואליות בריאה מאורגניזמים חיים. ראשית, ה?...

ארכיטקטורות שאינן אחידה בארגונים פיזיים וביולוגיים שונים מצויים בדרך כלל1,2. המוח הוא גם ארגון מאוד לא אחיד ומרובה בקנה מידה של רשת3,4. פונקציות קוגניטיביות שונות מקודדים בארגוני רשת כגון, החזקת שינויים בזמן של דפוסי מסמרים חשמליים של אוכלוסיות נוירואליות ברזולוציות זמן משנה. מבחינה היסטורית, הרשתות המורכבות בין הנוירונים נצפו באופן מבנית בפרוטרוט באמצעות שיטות הצביעה של סנטיאגו רמון את קאחאל מלפני 150 שנים5. כדי לצפות בהתנהגויות קבוצתיות של נוירונים פעילים, החוקרים פיתחו טכנולוגיות הקלטה שונות6,7,8, וההתפתחויות המשמעותיות האחרונות של טכנולוגיות כאלה אפשרו לנו להקליט פעילות חשמלית ממספר עצום של נוירונים בו זמנית. יתר על כן, מתוך פעילויות תפקודית כאלה, מדענים הצליחו לשחזר רשתות של אינטראקציות סיבתי בין מספר עצום של נוירונים והכריזו על הארכיטקטורה הטופולוגית של אינטראקציות מורכבות שלהם ' מיקרוקישוריות '9 . תצפיות מקרוסקופיות של המוח מאפשרות גם לגבי מוח שלם כארגון רשת, משום שאזורי מוח רבים מחוברים באמצעות חבילות סיבים מרובים. הטבעה של מיקרו-התחברות לתוך מפת המוח הגלובלית עדיין יש מגבלות ברורות בתוך ההתקדמות הטכנולוגית הנוכחית, ולכן זה פרוטוקול הטבעה זה חשוב כל כך. עם זאת, ישנם אתגרים רבים להתפתחות של פרוטוקול ההטמעה. לדוגמה, כדי להתבונן בפעילויות של מעגלים עצביים מקומיים באזורי מוח מבודדים גרידא, יש לייצר פרוסות מוח בהקלטות של מבחנה. בנוסף, הקלטות מפרוסות מוח להקלטות של מבחנה הן עדיין בחירה חשובה לפחות שתי סיבות. ראשית, עדיין לא קל להתבונן בפעילויות של הרבה נוירונים חיים בודדים במקביל מאזורי המוח עמוק יותר ~ 1.5 מ"מ וברזולוציה הרקתית הגבוהה (< 1 אלפיות הראשונה). שנית, כאשר אנו מקווים לדעת את הארכיטקטורה הפנימית של מעגל עצבי מקומי, אנחנו צריכים להפסיק את כל התשומות המגיעים מאזורי מוח חיצוניים כדי למנוע גורמים מייסדים. כדי לזהות את ההנחיות והמיקומים של פרוסות המוח המיוצרים, יהיה צורך נוסף לשלב את המיקומים המרחביים של פרוסות המוח הללו באמצעות קואורדינטות. עם זאת, יש כמה דרכים שיטתיות ואמינות לעשות פרוסות המוח בצורה מאורגנת10,11. כאן, פרוטוקול הרישום החדש הוא הציג, באמצעות טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית למחקר נוירומדעי על מנת לספק פרוטוקול אינטגרטיבי. פרוטוקול זה פועל כדי לתאם מיקרו מאזניים ולהטביע מערך רב אלקטרודה (MEA) microdata12,13 ו צביעת נתונים על מרחב MRI מאקרוסקופי באמצעות 3d לסרוק משטחים של המוח המחולצים, כמו גם של מוח שאינו מוקלט באופן בלתי פולשני. באופן מפתיע, פעולה זו הראתה שגיאת מרחק של רק ~ 50 יקרומטר כערך המצב של ההיסטוגרמה. כתוצאה מכך, ערכי המצב של מרחקים מינימליים בין שני משטחים בין משטח ה-MRI לבין משטח התלת-ממד הסרוק היו כמעט 50 יקרומטר עבור כל ששת העכברים, שהוא מספר מתאים בעת בדיקת אחידות בין אנשים. רוחב הפרוסה אופייני היה פעילות ספייק מוקלט של סביב 300 μm.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td>Kimura Medical</td>
			<td>KA-100</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia box</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>RIC-01</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>NS-5000A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67, clone 1G10.2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chrolide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06729-55</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08809-45</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved blunt forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td></td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16605-42</td>
			<td>re-secctioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>HM-10</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat controller</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>BWT-100A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>MR-compatible Small Animal Heating System</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie</td>
			<td></td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>MKIIIai</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Slicer</td>
			<td>DOSAKA</td>
			<td>Neo Linear Slicer MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chrolide Hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxOne Single-Well MEA</td>
			<td>MaxWell Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring software</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>PC-SAM V.5.12</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI compatible cradle</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T12812</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI coil</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T9988</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI operation software</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>ParaVision 5.1</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo LinearSlicer MT</td>
			<td>D.S.K.</td>
			<td>NLS-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24307</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure-sensitive respiration sensor</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RS-301</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preclinical MRI scanner</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>BioSpec 70/20 USR</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid Sodium Salt</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>29806-54</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAN in a BOX</td>
			<td>Open Technologies srl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve bottle</td>
			<td>TIGERCROWN</td>
			<td>81</td>
			<td>For 3D scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-09705</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogensulfite</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31220-15</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor temperature probe</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RTP-101-B, PLTPC-300</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth bar</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T10146</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged intravenous needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SV-23CLK</td>
			<td>For perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35436-01</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Hydrochloric Acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>37314-15</td>
			<td>For pH adjustment of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol

המוח האנושי, להיות מערכת רב-היקף, יש שני אותות חשמליים מאקרוסקופי, הזורם באופן כללי לאורך חבילות סיבים עבים החומר הלבן, וקוצים עצביים מיקרוסקופיים, הפצת לאורך אקסונים ו דנדטים. שני הקשקשים משלימים היבטים שונים של פונקציות קוגניטיביות והתנהגותיות אנושיות. ברמה המקרו-מקרוסקופית, MRI הינו טכנולוגיית ההדמיה הסטנדרטית הנוכחית, שבה הרזולוציה המרחבית הקטנה ביותר, גודל voxel, היא 0.1 – 1 מ"מ3. כמו כן, ברמה המיקרוסקופית, מחקרים פיזיולוגיים קודמים היו מודעים לארכיטקטורות נוירואליות שאינן אחידה בתוך voxels כאלה. מחקר זה מפתח דרך רבת עוצמה להטביע במדויק נתונים מיקרוסקופיים לתוך מפת מאקרוסקופי על ידי מחקר מדעי ביולוגי ממשק עם פיתוחים טכנולוגיים בטכנולוגיית סריקה תלת-ממדית. מאז 3D טכנולוגיה סריקה בעיקר שימש הנדסה ועיצוב תעשייתי עד עכשיו, זה מחדש בפעם הראשונה כדי להטביע מיקרוקישוריות לתוך המוח כולו תוך שמירה על העולה הטבעי בתאי המוח החיים. על מנת להשיג מטרה זו, הראשון, בנינו פרוטוקול סריקה כדי להשיג תמונות 3D מדויקים מהחיים ביו אורגניזמים מאוד מאתגרת לתמונה בשל לחות משטחים רפלקטיבית. שנית, אנו מאומנים לשמור על מהירות כדי למנוע השפלה של רקמת המוח החי, שהוא גורם מפתח בשמירת מצבים טובים יותר והקלטת קוצים עצביים טבעי יותר מנוירונים פעילים ברקמת המוח. שני תמונות משטח קורטיקלית, שחולצו באופן עצמאי משני מודולים הדמיה שונים, כלומר MRI ו 3d משטח הסורק תמונות, מפתיע להראות שגיאת מרחק של רק 50 יקרומטר כערך במצב של ההיסטוגרמה. דיוק זה דומה בקנה מידה לרזולוציה המיקרוסקופית של מרחקים בין-סלולאריים; כמו כן, הוא יציב בין עכברים בודדים שונים. זה פרוטוקול חדש, 3D הטבעה הרומן החופף (3D-NEO) פרוטוקול, גשרים רמות מאקרוסקופי ומיקרוסקופיים הנגזרים על ידי פרוטוקול אינטגרטיבי זה מאיץ ממצאים מדעיים חדשים כדי ללמוד ארכיטקטורות קישוריות מקיפה (כלומר, מיקרו-מחובר).

הערכנו מרחקים בין משטחי קליפת המוח, המיוצר על ידי נפח ה-MRI ההתפשט, ומשטחים שהתקבלו מסריקות 3D של המוח המחולצים. ערכי המצב של היסטוגרמה של המרחקים הם רק 55 יקרומטר (איור 3a). בנוסף, בעת צבירת ההיסטוגרמה מהנקודה שבה המרחק שווה לאפס, הערך שנצבר מגיע ל-90% ממספרי המדג...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol at JoVE.com

3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

3D סריקה תלת-ממדית מיקרומעגלים ותמונות המוח המקברקנה בתלת-ממד הטבעה בפרוטוקול החופף

מאמר זה מציג פרוטוקול ניסיוני באמצעות טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית המגשר על שני סולמות מרחביים: הסולם המרחבי המקסקופי של אנטומיה מוחית שלמה המועלת על-ידי MRI ב-> 100 יקרומטר ובקנה המידה המרחבי המיקרוסקופי של הפצות עצבי באמצעות כתמים אימונוהיסטוכימיה ומערכת מערך רב אלקטרודה ושיטות אחרות (~ 10 μm).

The human brain, being a multiscale system, has both macroscopic electrical signals, globally flowing along thick white-matter fiber bundles, and ...

פרוטוקול זה הוא הראשון להציג טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית בתחום המחקר האנטומי, במיוחד הנוירואנטומי, והשיג ביצועים חופפים מדויקים ביותר. הפרוטוקול הנוירו-הטבעה של 3D חופף, או פרוטוקול נוירו תלת-מימדי, מטמיע שקעים סטריליים בקנה מידה זעיר בתמונות מוח בקנה מידה מאקרו, ומגשר על קשקשים מרחביים שונים אלה בצורה חלקה. אנחנו גם צריכים ליישם את פרוטוקול נוירו 3D על MRIs אנושיים ומוח שלאחר המוות.החפיפה מאפשרת לנו לזהות דפוסי ניגודיות MRI ידועים הקשורים למחלות. מערכות סריקה תלת-מימדיות רגישות למים המקיפים את האורגניזם הביולוגי המופק, ולכן חיוני לנגב את המים בזהירות רבה. יתר על כן, ההליך חייב להתבצע מהר ככל האפשר.התחל הליך זה עם הכנת עכבר, כמו גם רכישות MRI והכנות ציוד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ביום השני, חותכים את הקרקפת של עכבר שהומת בעבר לאורך התפר הסגיטלי באמצעות מספריים כירורגיים. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את הגולגולת בכיוונים אלכסוניים מנקודת lambda לנקודה קצת מול bregma.לאחר מכן, לקלף בעדינות את הגולגולת מהמוח באמצעות פינצטה מעוגלת. הרם את המוח עם מרית והעבר אותו לצלחת פטרי עם פתרון חיתוך קר כקרח. באמצעות פצצת גז חיצונית עם מהירות משאבה מסתובבת מבוקרת, אוויר זרימה המכיל 95%חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני כדי ליצור בועות קטנות בתת פתרון החיתוך הקר כקרח.לאחר 1-2 דקות, לשים את המוח על בד מיקרופייבר אשר פני השטח מכוסה מעט על ידי מנון קמח. יש לנגב בעדינות את הנוזל מפני השטח של המוח באמצעות מטלית המיקרופייבר. שים את המוח, עם ההיבט הגבי שלו למעלה, על דוכן הדגימה.לאחר מכן, מקם את דוכן הדגימה במרכז הסובב האוטומטי. להכהות את החדר במהלך סריקת 3D ולבצע סריקה 3D על הסובבן. כדי לבדוק אם הסריקה תלת-מימדית פועלת היטב, לחץ על סריקה תלת-מימדית על-ידי בחירת הזווית בין שתי יריות כ- 22.5, זווית ההתחלה כאפס והזווית הסופית כ- 360.מעבירים את המוח לצלחת פטרי ומבעבעים את המוח בתת פתרון החיתוך למשך כ-10 שניות. חותכים את המוח לשני בלוקים באמצע מישור הקורונה, באמצעות אזמל. לאחר מכן, להעביר את שני המוח בלוקים בעדינות אל פני השטח השטוחים באמצעות מרית כירורגית.חבר את גושי המוח של בסיס בלוק המוח באמצעות דבק מיידי. יש לנגב את הנוזל בעדינות ובזהירות מפני השטח של המוח תוך שעה עד שתי דקות, באמצעות מטלית המיקרופייבר. לאחר מכן, בצע שוב סריקה תלת-מימדית.חבר להב למחזיק הלהב של הרטט. חבר את הסרט השחור המכסה את מרכז בסיס בלוק המוח למרכז שלב החיתוך עבור רטט. יוצקים פתרון חיתוך לתוך שלב החיתוך ולהגדיר את שלב החיתוך על הרטט.כוונן את מהירות החיתוך ואת משרעת. הפוך שתיים עד חמש פרוסות coronal של 300 מיקרון עבה משני בלוקים המוח. שמור על הפתרון בשלב החיתוך מבעבע במידת האפשר.מטב את מהירות החיתוך, התדירות משרעת הרטט של המערכת על ידי הגדרת אותם כמו 12.7 מילימטרים לדקה עבור המהירות, 87 כדי 88 הרץ עבור התדר, ו 0.8 כדי 1.0 מילימטרים עבור רוחב הנדנדה. בעת חיתוך פרוסות המוח, רשום את הקואורדינטות הפרוסות בתבנית, כולל הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות, חצי הכדור ותנאים אחרים. מעבירים בעדינות את פרוסות המוח לתוך מלאה ב- ACSF מחומם מראש באמצעות פיפטה פלסטיק עבה.להדק את פרוסות המוח בפקק בערך 34 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. במהלך תקופה זו, לבצע סריקה 3D של בלוקים המוח הנותרים על שלב החיתוך. כעת, הגדר מערך רב-אלקטרוני, או שבב MEA, ביחידת הקלטה.חבר את השבב למשאבה פריסטואלית באמצעות שני צינורות. השתמש בצינור אחד כדי להנחות את אותו ACSF לתוך שבב MEA ואת הצינור השני כדי להנחות את ACSF מתוך שבב MEA. חבר שני מחטים, מחוברים בטיפים של שני הצינורות, לראש הקיר של שבב MEA.לתקן את עמדותיהם עם הטיפים שלהם בעקבות הקיר הפנימי של שבב MEA. הגדר את קצב הזרימה של ה- ACSF ל- 4.1 סל"ד. בצע עיבוד נתוני MRI כדי לחלץ אמצעי אחסון קליפתיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי לבצע עיבוד תמונת MRI, הורד את התוכנה החינמית של כלי פריסה תלת-מימדי. פתח את תמונות MR של המוחות שחולצו שהופקו באמצעות עיבוד עוצמת הקול ומודולים עורך בכלי פריסה 3D. שנה את המצב מעורך לעיבוד עוצמה ולחץ על לחצן יעד כדי לגרום לתמונה של המוח להגיע למרכז המסך.בחר את מצב המוח MRT-2 וכוונן את ערכי הסף על-ידי הזזת סרגל ההזזה. לאחר מכן, חזור מעיבוד עוצמת הקול לעורך ולחץ על לחצן אפקט הסף. החל את התווית 41, קליפת המוח.לאחר מכן, שמור את נתוני פני השטח של המוח כקובץ STL על-ידי שינוי תבנית הקובץ מ- VTK ל- STL ברשימה לביצוע של הטופס. בצע ליבה אוטומטית בין שמונה או 16 תמונות שצולמו משמונה או 16 זוויות שונות בתוך רצף של סריקה כדי לתקן אי-התאמות קטנות. לשם כך, לחץ על רישום כללי הכלול באפשרות היישור וכלול את התמונות.חזור על סריקות מזוויות שונות כדי להשיג את כל משטח המוח. אם השילוב בין תמונות שנסרקו מזוויות שונות לא הצליח, לחץ על יישור ידני ובחר זוג תמונה קבועה ותמונה נעה. התחל את היישור הידני של התמונות על-ידי בחירת שלוש או ארבע נקודות נפוצות בתמונות שונות.לאחר מכן, לחץ על אישור. אלגוריתם המיטוב הוא אלגוריתם הנקודה הקרובה ביותר ואינו כולל עיוות לא ליניארי. צור רשת שינוי של כל התמונות המיושרות על-ידי בחירת כל התמונות ולחיצה על לחצן יצירת רשת שינוי. לאחר מכן, בחר באפשרות , אובייקט אמנותי קטן, כדי לקבל את רשת שינוי ברזולוציה הגבוהה ביותר.שמור את התמונה כ- STL בינארי או בתבנית ASCII. עכשיו, לפתוח את משטח MRI ולמזג אותו עם משטח סריקה 3D באמצעות תוכנת עיבוד פני השטח. בצע תהליך יישור ידני כבעבר.לאחר מכן, שמור שוב את תמונות המשטח המרכזיות האלה. במידת הצורך, נקה את נתוני פני השטח הבודדים על-ידי מחיקת רעשים קטנים המקיפים את אזור המוח, במיוחד במקרה של נתוני ה- MRI, ועל-ידי מילוי חורים כלשהם, במיוחד במקרה של נתוני הסריקה תלת-מימדית. לבסוף, פתח את נתוני פני השטח באמצעות תוכנה לניתוח נתונים כגון MATLAB.צור והערך את ההיסטוגרמות של המרחקים המינימליים בין שני המשטחים. מרחקים הוערכו בין משטחים קליפת המוח המיוצרים על ידי הפשטת נפח MRI ומשטחים המתקבלים סריקות תלת מימד של מוחות שחולצו. ערכי המצב של ההיסטוגרמה של המרחקים הם רק 55 מיקרון.בנוסף, בעת צבירת ההיסטוגרמה מהנקודה שבה המרחק שווה לאפס, הערך המצטבר מגיע ל-90% מכלל מספרי הדגימה בכ- 300 מיקרון. ההיסטוגרמה הסופית של המרחקים בין שני משטחים הראתה שיא טיפוסי סביב 50 מיקרון. מנקודת מבט מקרוסקופית, ערך מצב זה תואם למגבלה הגיאומטרית, שהייתה 100 מיקרון מגודל הווקסל של MRIs.נקודה זו מרמזת בעקיפין כי האלגוריתם החופף בין סריקת ה- MRI לסריקת תלת-מימד עבד מצוין, ושרמות הרעש של ה- MRI וסריקת תלת-מימד דוכאו כערך נמוך. פרוטוקול זה הוא הראשון לעלות באמצעות טכנולוגיית הסריקה לביו-אורגניזם. הטכנולוגיה נוצל במקור לדרישות הנדסיות גרין.החלת טכנולוגיה זו על רפואה יכולה לענות על שאלות חדשות. לאחר סריקה תלת מימדית, אנו יכולים להשתמש בהקלטות גרם של תיקון קיר הדמיה סידן כדי לקבל ידע משלים במונחים של זמני ואת הרזולוציה spacial ומספרים לרישום של תאים. הביצועים החופפים המדויקים ביותר שפרוטוקול זה מספק יהפוך את הקשר החלק בין הסולם המרחבי האנטומי לסקאלה האפס מרחבית למציאותי יותר מבעבר.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

ניצול טכנולוגיית הדפסה 3D כדי מיזוג MRI עם היסטולוגיה: פרוטוקול המוח חתך

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

מודל הרומן במבחנה של פגיעה מוחית טראומטית הפיצוץ

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

שיטה לניתוח שחזור תלת מימד ומציאות וירטואלית של תאים גליאל ונוירוונאליות

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...