Name: 3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol
Uploaded: 2019-05-12T13:00:00
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大学院医学系研究科医学情報工学科の皆さんのご支援に感謝し、高久和哲也教授、澤本信勝教授、ドリス・ザキアン先生のご支援に感謝申し上げます。コメント。本研究は、研究に対する助成金と、文部科学省の優秀若手研究者育成推進イニシアティブ(LEADER)プログラム(文部科学省)の支援を受けました。本研究におけるMRI実験は、京都大学大学院医学研究科医療研究支援センター小動物MRI部門で行われました。

ここに記載されているすべての実験手順は、京都大学動物管理委員会によって承認されています。
1. 動物(1日目)
<ol><li>メスのC57BL/6Jマウス(n=6、熟成3−5週間)を調出す。 注:このプロトコルは、すべてのげっ歯類種に適用可能です。</li>
</ol>2. MRI設定(1日目)
<ol><li>ヒーターマットコントローラーを使用して37°Cに調整したヒーター?...

<ol>
	<li>Vogelsberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+galaxies+reproduced+by+a+hydrodynamic+simulation.">Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation.</a> Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+approach+identifies+genetic+nodes+and+networks+in+late-onset+Alzheimer&#8217;s+disease.">Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer&#8217;s disease.</a> Cell. 153 (3), 707-720 (2013).</li><li>Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization,+development+and+function+of+complex+brain+networks.">Organization, development and function of complex brain networks.</a> Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).</li><li>Shimono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+cell+density+and+networks+in+the+monkey+brain.">Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain.</a> Scientific Reports. 3, 2541 (2013).</li><li>DeFelipe, J., Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+MEA+development.">A history of MEA development.</a> Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clusters,+hubs,+and+communities+in+the+cortical+microconnectome.">Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).</li><li>Amunts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigBrain:+An+Ultrahigh-Resolution+3D+Human+Brain+Model.">BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model.</a> Science. 340, 1472-1475 (2013).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigid+and+non-rigid+registration+of+polarized+light+imaging+data+for+3D+reconstruction+of+the+temporal+lobe+of+the+human+brain+at+micrometer+resolution.">Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution.</a> NeuroImage. 181, 235-251 (2018).</li><li>Kozai, T. D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).</li><li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+color+optogenetic+control+of+neural+populations+using+low-noise,+multishank+optoelectrodes.">Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).</li><li>Hellwig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+local+connectivity+between+pyramidal+neurons+in+layers+2/3+of+the+rat+visual+cortex.">A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex.</a> Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).</li><li>Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+spatial+with+ontological+brain+regions+using+Java+tools+for+visualization,+database+access,+and+integrated+data+analysis.">Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis.</a> Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).</li><li>Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cell+communication+within+local+networks+in+layer+2/3+of+rat+neocortex.">Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex.</a> The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).</li><li>Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+cortical+column:+abundance+and+physiology+of+horizontal+connections+imply+a+strong+role+for+inputs+from+the+surround.">Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround.</a> Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).</li><li>Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+reconstruction+by+wrapping+finite+point+sets+in+space.">Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space.</a> Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).</li><li>Roland, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+atlas:+For+high&#8208;resolution+functional+and+anatomical+mapping.">Human brain atlas: For high&#8208;resolution functional and anatomical mapping.</a> Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxholm+space:+an+image-based+reference+for+coordinating+mouse+brain+research.">Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research.</a> NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).</li><li>Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+templates+and+atlases.">Brain templates and atlases.</a> NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).</li><li>Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain/MINDS&#8211;a+new+program+for+comprehensive+analyses+of+the+brain.">Brain/MINDS&#8211;a new program for comprehensive analyses of the brain.</a> Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).</li><li>Shimono, M., Hatano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+communication+dynamics+on+macro-connectome,+and+the+propagation+speed.">Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).</li></ol>

我々は、2つの脳表面をより正確に重ねることによって、マクロスコピックと顕微鏡空間スケールを橋渡しする3D-NEOプロトコルと呼ばれる新しいプロトコルを開発した。もともと、2つの脳表面画像の正確な重なり合いを可能にし、生物から健康な神経活動を記録することを可能にするこのプロトコルを作成する際に2つの課題がありました。まず、脳の生物を傷つけることなく頭蓋骨から抽出?...

様々な物理および生物学的組織における不均一なマルチスケールアーキテクチャは、一般的に1、2を見つけることができます。脳はまた、非常に不均一でマルチスケールのネットワーク組織3、4です。このようなネットワーク組織では、様々な認知機能がコード化され、サブミリ秒の時間分解能における神経集団の電気スパイクパターンの時間的変化を保持する。歴史的に、ニューロン間の複雑なネットワークは、150年以上前の5年前のサンティアゴ・ラモン・イ・カハルの染色技術を用いて詳細に観察された。活性ニューロンの集団挙動を観察するために、研究者は様々な記録技術6、7、8を開発し、最近の重要な技術の発展は、私たちが記録することを可能にしました同時にニューロンの膨大な数からの電気活動。さらに、このような機能的活動から、科学者は膨大な数のニューロン間の因果相互作用のネットワークを再構築することに成功し、複雑な相互作用のトポロジアーキテクチャを宣言しました 9.脳のマクロ的な観察はまた、多くの脳領域が複数のファイバーバンドルによって接続されているので、ネットワーク組織として脳全体を関連することを可能にします。マイクロコネクテムをグローバルな脳マップに埋め込むには、現在の技術の進歩の中で明らかな制限があり、この埋め込みプロトコルが非常に重要である理由です。ただし、埋め込みプロトコルの開発には多くの課題があります。例えば、純粋に孤立した脳領域における生きている局所神経回路の活動を観察するためには、インビトロ録音のために脳スライスを生成する必要があります。さらに、インビトロ録音のための脳スライスからの録音は、少なくとも2つの理由で重要な選択です。第一に、脳領域から1.5mm深く、高時間分解能(<1ミリ秒)で同時に多くの生きている個々のニューロンの活動を観察することは容易ではありません。第二に、局所神経回路の内部アーキテクチャを知りたいとき、交絡因子を排除するために、外部脳領域からのすべての入力を停止する必要があります。生成された脳スライスの方向と位置を特定するためには、これらの生成された脳スライスの空間位置を座標を使用して統合する必要があります。しかし、組織的な方法で脳のスライスを作るためにいくつかの体系的で信頼性の高い方法があります10,11.ここでは、統合プロトコルを提供するために、神経科学研究のための3Dスキャン技術を使用して、新しい共登録プロトコルが導入されています。このプロトコルは、マイクロスケールとマクロスケールを調整し、マルチエレクトロジカル配列(MEA)マイクロデータ12、13を埋め込み、抽出された脳の3Dスキャン表面を介してマクロスコピックMRI空間にデータを染色し、同様に非侵襲的に記録された脳。驚くべきことに、これはヒストグラムのモード値としてわずか〜50 μmの距離誤差を示した。その結果、MRI表面とスキャンされた3D表面との間の2つの表面間の最小距離のモード値は、6匹のマウスすべてに対してほぼ50μmであった。典型的なスライス幅は、約300μmのスパイク活性を記録した。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td>Kimura Medical</td>
			<td>KA-100</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia box</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>RIC-01</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>NS-5000A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67, clone 1G10.2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chrolide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06729-55</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08809-45</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved blunt forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td></td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16605-42</td>
			<td>re-secctioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>HM-10</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat controller</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>BWT-100A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>MR-compatible Small Animal Heating System</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie</td>
			<td></td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>MKIIIai</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Slicer</td>
			<td>DOSAKA</td>
			<td>Neo Linear Slicer MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chrolide Hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxOne Single-Well MEA</td>
			<td>MaxWell Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring software</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>PC-SAM V.5.12</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI compatible cradle</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T12812</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI coil</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T9988</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI operation software</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>ParaVision 5.1</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo LinearSlicer MT</td>
			<td>D.S.K.</td>
			<td>NLS-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24307</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure-sensitive respiration sensor</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RS-301</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preclinical MRI scanner</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>BioSpec 70/20 USR</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid Sodium Salt</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>29806-54</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAN in a BOX</td>
			<td>Open Technologies srl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve bottle</td>
			<td>TIGERCROWN</td>
			<td>81</td>
			<td>For 3D scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-09705</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogensulfite</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31220-15</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor temperature probe</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RTP-101-B, PLTPC-300</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth bar</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T10146</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged intravenous needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SV-23CLK</td>
			<td>For perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35436-01</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Hydrochloric Acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>37314-15</td>
			<td>For pH adjustment of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol

人間の脳は、マルチスケールシステムであり、厚い白色物質繊維束に沿って世界的に流れるマクロ的な電気信号と、軸線とデンドライトに沿って伝播する顕微鏡的な神経スパイクの両方を持っています。両方のスケールは、人間の認知機能と行動機能の異なる側面を補完します。マクロスコピックレベルでは、MRIは現在の標準的なイメージング技術であり、最小の空間分解能ボクセルサイズは0.1~1 mm3です。また、顕微鏡レベルでは、以前の生理学的研究は、このようなボクセル内の不均一なニューロンアーキテクチャを認識していました。本研究は、3Dスキャン技術の技術進歩と生物科学研究をインターフェースすることにより、顕微鏡データをマクロスコピックマップに正確に埋め込む強力な方法を開発する。これまで3Dスキャン技術は、これまで工学や工業デザインに用いられてきたため、生きた脳細胞の自然なスパイクを維持しながら、マイクロコネトームを脳全体に埋め込むことが初めて目的としています。この目的を達成するために、まず、湿った反射面による画像に本質的に挑戦する生体生物から正確な3D画像を得るためのスキャンプロトコルを構築しました。第二に、我々は、より良い状態を維持し、脳組織内の活性ニューロンからより自然なニューロンスパイクを記録する重要な要因である生きている脳組織の劣化を防ぐために速度を維持するために訓練しました。2つの皮質表面画像は、2つの異なるイメージングモジュール、すなわちMRIおよび3Dスキャナ表面画像から独立して抽出され、驚くべきことに、ヒストグラムのモード値としてわずか50μmの距離誤差を示す。この精度は、細胞間距離の顕微鏡分解能に匹敵するスケールです。また、異なる個々のマウス間で安定である。この新しいプロトコル、3D新しい埋め込みオーバーラップ(3D-NEO)プロトコルは、この統合プロトコルによって導き出されたマクロスコピックと顕微鏡レベルを橋渡しし、包括的な接続アーキテクチャを研究するための新しい科学的知見を加速します(すなわち、マイクロコネクチョム)。

MRI体積を剥離して生成される皮質表面間の距離と、抽出した脳の3Dスキャンから得られた表面を評価した。距離のヒストグラムのモード値はわずか 55 μm です (図3a)。さらに、距離がゼロに等しい点からヒストグラムを蓄積すると、累積値は〜300 μm(図3b)でサンプル総数の90%に達する。2つの表面間の距離の最終的なヒストグ?...

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3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

3Dスキャニング技術ブリッジングマイクロ回路とマクロスケールの脳画像を3D新規埋め込み重なりプロトコルで

本稿では、MRIによってイメージされた全脳解剖学のマクロ的な空間スケールと、ニューロン分布の顕微鏡空間スケールの2つの空間スケールを橋渡しする3Dスキャン技術を用いて実験的なプロトコルを紹介する。免疫組織化学染色および多電極アレイシステムおよび他の方法(〜10 μm)。

The human brain, being a multiscale system, has both macroscopic electrical signals, globally flowing along thick white-matter fiber bundles, and ...

このプロトコルは、解剖学的、特に神経解剖学的研究分野で3Dスキャン技術を導入する最初のものであり、非常に正確な重複性能を達成しています。3D神経埋め込みオーバーラップ、または3D神経プロトコルは、マクロスケールの脳画像にマイクロスケールの無菌ソケットを埋め込み、これらの異なる空間スケールをシームレスに橋渡しします。また、3D神経プロトコルをヒトMRIと死後の脳に適用する必要があります。重複により、疾患に関連する既知のMRIコントラストパターンを同定することができます。3Dスキャンシステムは、抽出された生物を取り巻く水に敏感であるため、非常に慎重に水を拭く必要があります。さらに、手順はできるだけ迅速に実行する必要があります。この手順は、テキスト プロトコルで説明されているように、マウスの準備、および MRI 取得および装置の準備から始めます。2日目には、手術用ハサミを使用して、以前に安楽死させたマウスの頭皮を矢状縫合糸に沿って切断します。手術用はさみを使用して、ラムダポイントからブレグマの少し前のポイントまで斜め方向に頭蓋骨を切断します。その後、湾曲したピンセットを使用して脳から頭蓋骨を静かに剥がします。へらで脳を持ち上げ、氷冷切断溶液でペトリ皿に移します。制御された回転ポンプ速度を持つ外部ガス爆弾を使用して、95%の酸素と5%の二酸化炭素を含む空気を流し、氷冷切断液に小さな気泡を生成する。1〜2分後、表面が小麦粉ふるいでわずかに覆われているマイクロファイバーの布の上に脳を置きます。マイクロファイバーの布を使用して、脳表面から静かに流体を拭きます。脳を下方面に置いて、サンプルスタンドに置きます。次に、サンプルスタンドを自動ターンテーブルの中央に置きます。3D スキャン中に部屋を暗くし、ターンテーブルで 3D スキャンを実行します。3D スキャンが正常に動作するかどうかをテストするには、2 つのショット間の角度を 22.5、開始角度を 0、最終角度を 360 として選択して、[3D スキャン] をクリックします。脳をペトリ皿に移動し、約10秒間切断溶液中の脳を泡立てる。メスを使用して、コロナ平面の真ん中で脳を2つのブロックにカットします。次に、外科用ヘラを使用して、2つの脳ブロックを平らな表面にそっと移動させます。インスタント接着剤を使用して脳ブロックベースの脳ブロックを取り付けます。マイクロファイバークロスを使用して、1〜2分以内に脳表面から液を柔らかく慎重に拭きます。次に、3D スキャンを再度実行します。ビブラートメのブレードホルダーにブレードを取り付けます。脳ブロックベースの中心を覆う黒いテープを、ビブラートメの切断ステージの中央に取り付けます。切断段階に切削液を注ぎ、ビブラートメに切削ステージを設定します。切削速度と振幅を調整します。2つの脳ブロックから厚い300ミクロンの2〜5個のコロナスライスを作ります。可能であれば、切断段階のバブリングにソリューションを保管してください。速度に対して 1 分あたり 12.7 ミリメートル、周波数に 87 ~ 88 ヘルツ、スイング幅に 0.8 ~ 1.0 ミリメートルを設定して、システムの切削速度、周波数、振動振幅を最適化します。脳のスライスを切断しながら、前部後方座標、半球、その他の条件を含む形式でスライスされた座標を記録します。厚いプラスチックピペットを使用して、脳スライスを事前に温めたACSFで満たされたビーカーにそっと移します。ビーカーの脳スライスを摂氏約34度で1時間インキュベートします。この間、切断段階で残りの脳ブロックの3Dスキャンを行います。次に、記録ユニットに多電極アレイ(MEAチップ)をセットします。2つのチューブを使用して、チップを蠕動ポンプに接続します。1 つのチューブを使用して同じ ACSF を MEA チップに誘導し、もう 1 つのチューブを使用して、ACSF を MEA チップから取り出します。2本のチューブの先端に接続された2本の針をMEAチップの壁の上部に取り付けます。MEAチップの内壁に続くヒントでポジションを固定します。ACSF の流量を 4.1 RPM に設定します。テキストプロトコルで説明されているように、MRIデータ処理を実行して皮質ボリュームを抽出します。MRI画像処理を実行するには、3Dスライサーフリーソフトウェアをダウンロードしてください。3D スライサーのボリューム レンダリングとエディター モジュールを使用して生成された抽出された脳の MR イメージを開きます。モードをエディタからボリュームレンダリングに変更し、ターゲットボタンをクリックして、脳の画像を画面の中央に表示します。MRT-2脳モードを選択し、シフトバーを移動してしきい値を調整します。次に、ボリューム レンダリングからエディタに戻り、しきい値効果ボタンをクリックします。標識41、大脳皮質を適用する。次に、フォームチェックリストで VTK から STL にファイル形式を変更して、脳表面データを STL ファイルとして保存します。スキャンのシーケンス内で 8 または 16 の異なる角度から撮影した 8 つまたは 16 の画像間で自動共登録を実行して、小さな不一致を修正します。これを行うには、配置オプションに含まれるグローバル登録をクリックし、画像を統合します。異なる角度からスキャンを繰り返して、脳表面全体を得ます。異なる角度からスキャンした画像間の統合が失敗した場合は、「手動配置」をクリックして、固定画像と動画のペアを選択します。異なる画像の 3 つまたは 4 つの共通点を選択して、イメージの手動配置を開始します。次に、[OK] をクリックします。最適化アルゴリズムは、反復的な最も近い点アルゴリズムであり、非線形変形は含まれません。すべてのイメージを選択し、メッシュ生成ボタンをクリックして、整列したイメージをすべてメッシュにします。次に、小さな芸術オブジェクトを選択して、メッシュを最高の解像度で取得します。イメージを STL バイナリまたは ASCII 形式で保存します。MRI サーフェスを開き、サーフェス処理ソフトウェアを使用して 3D スキャン サーフェスとマージします。以前と同様に手動で調整を行います。次に、これらの登録されたサーフェス イメージを再度保存します。必要に応じて、特にMRIデータの場合は、脳領域を取り巻く小さなノイズを消去し、特に3Dスキャンデータの場合は穴を埋めることによって、個々の表面データを清掃します。最後に、MATLABなどのデータ解析ソフトウェアでサーフェスデータを開きます。2 つのサーフェス間の最小距離のヒストグラムを生成し、評価します。MRI体積を除去して生成した皮質表面と、抽出された脳の3Dスキャンから得られた表面間の距離を評価した。距離のヒストグラムのモード値はわずか55ミクロンです。また、距離がゼロの地点からヒストグラムを蓄積すると、累積値は約300ミクロンでサンプル総数の90%に達します。2つの表面間の距離の最終的なヒストグラムは、約50ミクロンの典型的なピークを示した。このモード値は、マクロ的な観点から、MRIのボクセルサイズから100ミクロンであった幾何学的な制限に対応しています。この点は、MRIと3Dスキャンの間の重複するアルゴリズムが非常にうまく機能し、MRIと3Dスキャンの両方のノイズレベルが低い値として抑制されたことを間接的に示唆しています。このプロトコルは、バイオ生物にスキャン技術を通じて上昇する最初のプロトコルです。この技術はもともと純粋にエンジニアリングの要求に利用されていました。この技術を医学に応用することは、新しい疑問に答えることができます。3Dスキャンの後、カルシウムイメージングウォールパッチグラム記録を使用して、時間的および容量分解能と記録可能な細胞数の観点から補完的な知識を得ることができます。このプロトコルが提供する非常に正確な重複する性能は、解剖学的空間スケールとゼロ空間スケールのシームレスな関連付けを以前よりも現実的にします。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em&gt;インビトロ</em&gt;実験モデル

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

組織学でMRIをマージするために、3D印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

GLUT4 タンパク質デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス一次視床下部ニューロンにおける人身売買のライブ映像

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

爆発外傷性脳損傷の新規In Vitroモデル

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...