Name: 3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol
Uploaded: 2019-05-12T13:00:00
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M.S.는 의과대학 의과대학 의학정보공학과의 모든 스태프의 성원에 감사드리며, 다카쿠와 데츠야 교수님, 사와모토 노부카쓰 교수, 도리스 자키안 교수님의 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 코멘트. 이 연구는 MEXT (문부과학성)에서 석사까지 의 외래 연구 (LEADER) 프로그램을 위한 이니셔티브와 도전적인 탐사 연구를위한 보조금 지원에 의해 지원되었습니다. 이 작품의 MRI 실험은 일본 교토대학 의학연구센터, 의학연구지원센터, 소동물MRI학과에서 수행되었습니다.

교토대학 동물관리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물 (1일차)
<ol><li>암컷 C57BL/6J 마우스(n = 6, 숙성 된 3-5 주)를 준비하십시오. 참고: 이 프로토콜은 모든 설치류 종에 적용 할 수 있습니다.</li>
</ol>2. MRI 설정 (1일차)
<ol><li>히터 매트에 놓인 아크릴 마취 상자에 마우스를 넣고 히터 매트 컨트롤러를 사용하여 37°C로 조정하였다.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Vogelsberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+galaxies+reproduced+by+a+hydrodynamic+simulation.">Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation.</a> Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+approach+identifies+genetic+nodes+and+networks+in+late-onset+Alzheimer&#8217;s+disease.">Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer&#8217;s disease.</a> Cell. 153 (3), 707-720 (2013).</li><li>Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization,+development+and+function+of+complex+brain+networks.">Organization, development and function of complex brain networks.</a> Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).</li><li>Shimono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+cell+density+and+networks+in+the+monkey+brain.">Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain.</a> Scientific Reports. 3, 2541 (2013).</li><li>DeFelipe, J., Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+MEA+development.">A history of MEA development.</a> Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clusters,+hubs,+and+communities+in+the+cortical+microconnectome.">Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).</li><li>Amunts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigBrain:+An+Ultrahigh-Resolution+3D+Human+Brain+Model.">BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model.</a> Science. 340, 1472-1475 (2013).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigid+and+non-rigid+registration+of+polarized+light+imaging+data+for+3D+reconstruction+of+the+temporal+lobe+of+the+human+brain+at+micrometer+resolution.">Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution.</a> NeuroImage. 181, 235-251 (2018).</li><li>Kozai, T. D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).</li><li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+color+optogenetic+control+of+neural+populations+using+low-noise,+multishank+optoelectrodes.">Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).</li><li>Hellwig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+local+connectivity+between+pyramidal+neurons+in+layers+2/3+of+the+rat+visual+cortex.">A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex.</a> Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).</li><li>Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+spatial+with+ontological+brain+regions+using+Java+tools+for+visualization,+database+access,+and+integrated+data+analysis.">Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis.</a> Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).</li><li>Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cell+communication+within+local+networks+in+layer+2/3+of+rat+neocortex.">Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex.</a> The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).</li><li>Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+cortical+column:+abundance+and+physiology+of+horizontal+connections+imply+a+strong+role+for+inputs+from+the+surround.">Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround.</a> Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).</li><li>Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+reconstruction+by+wrapping+finite+point+sets+in+space.">Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space.</a> Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).</li><li>Roland, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+atlas:+For+high&#8208;resolution+functional+and+anatomical+mapping.">Human brain atlas: For high&#8208;resolution functional and anatomical mapping.</a> Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxholm+space:+an+image-based+reference+for+coordinating+mouse+brain+research.">Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research.</a> NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).</li><li>Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+templates+and+atlases.">Brain templates and atlases.</a> NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).</li><li>Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain/MINDS&#8211;a+new+program+for+comprehensive+analyses+of+the+brain.">Brain/MINDS&#8211;a new program for comprehensive analyses of the brain.</a> Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).</li><li>Shimono, M., Hatano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+communication+dynamics+on+macro-connectome,+and+the+propagation+speed.">Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).</li></ol>

우리는 이전보다 더 정확하게 두 개의 뇌 표면을 중첩하여 거시적 및 현미경 공간 스케일을 연결하는 3D-NEO 프로토콜이라는 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 원래, 가능한 두 개의 뇌 표면 이미지의 정확한 중첩을 만든이 프로토콜을 만드는 두 가지 도전이 있었다 살아있는 유기체에서 건강한 신경 활동을 기록. 첫째, 뇌 유기체를 손상시키지 않고 두개골에서 추출 한 후 추출 된 뇌를 둘러싼 절?...

다양한 물리적 및 생물학적 조직에서 불균일한 다중 스케일 아키텍처는 일반적으로1,2. 뇌는 또한 매우 균일하고 다중규모 네트워크 조직 3,4. 다양한 인지 기능은 이러한 네트워크 조직에서 코딩되어 서브 밀리초 시간적 해상도에서 신경 인구의 전기 스파이크 패턴의 시간적 변화를 유지합니다. 역사적으로, 뉴런 들 간의 복잡한 네트워크는 150 년 전5에서 산티아고 라몬 y Cajal에 의해 염색 기술을 사용하여 구조적으로 관찰되었다. 활성 뉴런의 그룹 행동을 관찰하기 위해 연구자들은다양한 기록 기술을 개발했습니다 6,7,8,이러한 기술의 최근 중요한 발전은 우리가 기록 할 수 있게 동시에 뉴런의 거대한 숫자에서 전기 활동. 또한, 이러한 기능적 활동으로부터 과학자들은 수많은 뉴런 들 사이에서 인과 상호 작용의 네트워크를 재구성하는 데 성공했으며 복잡한 상호 작용의 위상 구조를 '마이크로 커넥톰'9로 선언했습니다. . 많은 두뇌 지구가 다중 섬유 묶음에 의해 연결되기 때문에 두뇌의 거시적인 관측은 또한 네트워크 조직으로 전체 두뇌에 관하여 허용합니다. 글로벌 뇌 지도에 마이크로 커넥톰을 포함시키는 것은 여전히 현재의 기술 발전 내에서 명확한 한계를 가지고 있으며, 이 때문에 이 포함 프로토콜이 매우 중요합니다. 그러나 포함 프로토콜의 개발에는 많은 과제가 있습니다. 예를 들어, 순수하게 고립 된 뇌 영역에서 살아있는 국소 신경 회로의 활동을 관찰하기 위해, 뇌 조각은 시험관 내 기록을 위해 생산될 필요가있다. 또한, 생체 외에서 기록에 대 한 뇌 조각에서 기록은 여전히 적어도 두 가지 이유로 중요 한 선택. 첫째, ~1.5 mm보다 깊은 뇌 영역과 높은 시간적 해상도 (&1 ms)에서 동시에 많은 살아있는 개별 뉴런의 활동을 관찰하는 것은 쉽지 않습니다. 둘째, 로컬 뉴런 회로의 내부 아키텍처를 알고자 할 때, 우리는 혼란스러운 요인을 제거하기 위해 외부 뇌 영역에서 오는 모든 입력을 중지해야합니다. 생성된 뇌 조각의 방향과 위치를 식별하기 위해서는 좌표를 사용하여 생성된 뇌 조각의 공간 위치를 통합하는 것이 더욱 필요합니다. 그러나, 조직 된 방법으로 뇌 조각을 만드는 몇 가지 체계적이고 신뢰할 수있는 방법이 있습니다10,11. 여기서, 통합 프로토콜을 제공하기 위해 신경 과학 연구를 위한 3D 스캐닝 기술을 사용하여 새로운 공동 등록 프로토콜이 도입된다. 이 프로토콜은 마이크로 및 매크로 스케일을 조정하고 추출 된 뇌의 3D 스캔 표면을 통해 거시적 MRI 공간에 데이터를 염색하는 다중 전극 어레이 (MEA) 마이크로 데이터 (MEA) 마이크로 데이터12및13및 염색 을 하는 역할을 합니다. 비침습적으로 기록 된 뇌. 놀랍게도, 이것은 히스토그램의 모드 값으로 ~ 50 μm의 거리 오차를 보였다. 그 결과, MRI 표면과 스캔된 3D 표면 사이의 두 표면 사이의 최소 거리의 모드 값은 6마리의 마우스 모두에 대해 거의 50 μm에 달했으며, 이는 개인 간의 공통성을 확인할 때 적합한 수치이다. 전형적인 슬라이스 폭은 약 300 μm의 스파이크 활성을 기록하였다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td>Kimura Medical</td>
			<td>KA-100</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia box</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>RIC-01</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>NS-5000A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67, clone 1G10.2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chrolide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06729-55</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08809-45</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved blunt forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal scalpel</td>
			<td>Kai</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td></td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16605-42</td>
			<td>re-secctioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>HM-10</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater mat controller</td>
			<td>Bio Research Center</td>
			<td>BWT-100A</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>MR-compatible Small Animal Heating System</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie</td>
			<td></td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>ACOMA Medical Industry</td>
			<td>MKIIIai</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Slicer</td>
			<td>DOSAKA</td>
			<td>Neo Linear Slicer MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chrolide Hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxOne Single-Well MEA</td>
			<td>MaxWell Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring system</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring software</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>PC-SAM V.5.12</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI compatible cradle</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T12812</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI coil</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T9988</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI operation software</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>ParaVision 5.1</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo LinearSlicer MT</td>
			<td>D.S.K.</td>
			<td>NLS-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24307</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure-sensitive respiration sensor</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RS-301</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preclinical MRI scanner</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>BioSpec 70/20 USR</td>
			<td>For MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid Sodium Salt</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>29806-54</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAN in a BOX</td>
			<td>Open Technologies srl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve bottle</td>
			<td>TIGERCROWN</td>
			<td>81</td>
			<td>For 3D scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-09705</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogensulfite</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31220-15</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor temperature probe</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>RTP-101-B, PLTPC-300</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth bar</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>T10146</td>
			<td>Animal preparation for MRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged intravenous needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SV-23CLK</td>
			<td>For perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35436-01</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mol/l-Hydrochloric Acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>37314-15</td>
			<td>For pH adjustment of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d scanning technology bridging microcircuits and macroscale brain images in 3d novel embedding overlapping protocol

다중 스케일 시스템인 인간의 뇌는 거시적 전기 신호를 모두 가지고 있으며, 전 세계적으로 두꺼운 백색 물질 섬유 번들을 따라 흐르고 있으며, 미세한 뉴런 스파이크는 축색과 모수석을 따라 전파됩니다. 두 척도 인간의 인지 및 행동 기능의 다른 측면을 보완. 거시적 수준에서 MRI는 가장 작은 공간 해상도인 복셀 크기가 0.1-1 mm3인현재의 표준 이미징 기술입니다. 또한, 현미경 수준에서, 이전 생리학 연구는 복셀 내의 불균일한 신경 구조의 알고 있었다. 이 연구는 3D 스캐닝 기술의 기술 적 진보와 생물학적 과학 연구를 상호 결합하여 미세 한 데이터를 거시적지도에 정확하게 포함시키는 강력한 방법을 개발합니다. 3D 스캐닝 기술은 지금까지 주로 엔지니어링 및 산업 설계에 사용되어 왔기 때문에 살아있는 뇌 세포에서 자연 스며드는 유지하면서 전체 뇌에 미세 커넥톰을 내장하는 데 처음으로 용도가 변경되었습니다. 이러한 목적을 달성하기 위해 먼저 습하고 반사되는 표면으로 인해 이미지에 본질적으로 어려움을 겪고 있는 살아있는 생물체로부터 정확한 3D 이미지를 얻기 위한 스캐닝 프로토콜을 구축했습니다. 둘째, 우리는 살아있는 뇌 조직의 저하를 방지하기 위해 속도를 유지하기 위해 훈련, 이는 더 나은 조건을 유지하고 뇌 조직의 활성 뉴런에서 더 많은 자연 신경 스파이크를 기록하는 핵심 요소입니다. 두 개의 서로 다른 이미징 모듈, 즉 MRI 및 3D 스캐너 표면 이미지에서 독립적으로 추출된 두 개의 피질 표면 이미지는 놀랍게도 히스토그램의 모드 값으로 50 μm의 거리 오차를 보여줍니다. 이 정확도는 세포 간 거리의 현미경 해상도와 규모에 필적; 또한, 그것은 다른 개별 마우스 중 안정. 이 새로운 프로토콜, 3D 소설 포함 중첩 (3D-NEO) 프로토콜, 이 통합 프로토콜에 의해 파생 된 거시적 및 현미경 수준을 브리지 하 고 포괄적인 연결 아키텍처를 공부 하는 새로운 과학적 결과 가속화 (즉, 마이크로 커넥톰)을 클릭합니다.

우리는 MRI 부피를 제거하여 생성 된 피질 표면과 추출 된 뇌의 3D 스캔에서 얻은 표면 사이의 거리를 평가했습니다. 거리의 히스토그램의 모드 값은 55 μm (그림 3a)입니다. 또한 거리가 0인 지점에서 히스토그램을 축적할 때 누적된 값은 ~300 μm(그림 3b)에서총 샘플 수의 90%에 도달합니다. 두 표면 사이의 거리의 최종 히스토그램은...

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3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

3D 소설 포함 프로토콜에서 마이크로 회로 및 매크로 스케일 뇌 이미지를 연결하는 3D 스캐닝 기술

이 기사에서는 두 개의 공간 척도를 연결하는 3D 스캐닝 기술을 사용하여 실험 프로토콜을 소개합니다: MRI에 의해 이미지된 전체 뇌 해부학의 거시적 공간 척도 >100 μm 및 이를 사용하는 뉴런 분포의 현미경 공간 스케일 면역히스토화학 염색 및 다중전극 어레이 시스템 및 기타 방법(~10 μm).

The human brain, being a multiscale system, has both macroscopic electrical signals, globally flowing along thick white-matter fiber bundles, and ...

이 프로토콜은 해부학, 특히 신경 해부학 연구 분야에서 3D 스캐닝 기술을 최초로 도입했으며 매우 정확한 중복 성능을 달성했습니다. 3D 신경 포함 중복 또는 3D 신경 프로토콜은 마이크로 스케일 멸균 소켓을 거시적 규모의 뇌 이미지에 포함하고 이러한 다양한 공간 스케일을 원활하게 교개합니다. 우리는 또한 인간 MRI 및 사후 두뇌에 3D 신경 프로토콜을 적용해야 합니다.중첩을 통해 질병과 관련된 알려진 MRI 대비 패턴을 식별할 수 있습니다. 3D 스캔 시스템은 추출된 생체 유기체를 둘러싼 물에 민감하므로 물을 매우 신중하게 닦는 것이 중요합니다. 또한 절차는 가능한 한 빨리 수행해야합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 준비와 MRI 획득 및 장비 준비로 이 절차를 시작합니다. 둘째 날, 외과 가위를 사용하여 처진 봉합사를 따라 이전에 안락사 된 마우스의 두피를 잘라냅니다. 외과 가위를 사용하여 람다 지점에서 브레그마 앞의 지점까지 대각선 방향으로 두개골을 자른다.그런 다음 곡선 핀셋을 사용하여 두개골을 뇌에서 부드럽게 벗겨냅니다. 주걱으로 뇌를 들어 올려 얼음 차가운 절단 용액으로 페트리 접시로 옮춥춥시게 합니다. 제어 된 회전 펌프 속도를 가진 외부 가스 폭탄을 사용하여 95 %의 산소와 5 %의 이산화탄소를 함유 한 유동 공기로 얼음 냉간 절단 용액에서 작은 거품을 생성합니다.1~2분 후, 표면이 밀가루 체로 약간 덮여 있는 마이크로 화이버 천에 뇌를 놓습니다. 마이크로 화이버 천을 사용하여 뇌 표면에서 유체를 부드럽게 닦아냅니다. 등등 측면을 가진 뇌를 샘플 스탠드에 올려 놓습니다.그런 다음 샘플 스탠드를 자동 턴테이블의 중앙에 놓습니다. 3D 스캔 중에 방을 어둡게 하고 턴테이블에 3D 스캔을 수행합니다. 3D 스캔이 잘 작동하는지 테스트하려면 두 샷 사이의 각도를 22.5로 선택하고 시작 각도를 0으로 선택하고 최종 각도를 360으로 선택하여 3D 스캔을 클릭합니다.뇌를 페트리 접시로 옮기고 절단 용액에서 뇌를 약 10초 동안 거품을 낸다. 메스를 사용하여 관상 비행기 의 중간에 두 블록으로 뇌를 잘라. 그런 다음 두 뇌 블록을 외과 주걱을 사용하여 평평한 표면으로 부드럽게 이동합니다.인스턴트 접착제를 사용하여 뇌 블록 베이스의 뇌 블록을 부착합니다. 마이크로 화이버 천을 사용하여 1 ~ 2 분 이내에 뇌 표면에서 유체를 부드럽고 조심스럽게 닦습니다. 그런 다음 3D 검사를 다시 수행합니다.진동의 블레이드 홀더에 블레이드를 부착합니다. 뇌 블록 베이스의 중심을 덮는 검은 테이프를 절단 단계의 중앙에 부착하여 진동을 합니다. 절단 액액을 절삭 단계에 붓고 진동에 절단 단계를 설정합니다.절삭 속도와 진폭을 조정합니다. 두 뇌 블록에서 두께 300 미크론의 2 ~ 5 개의 관상 슬라이스를 만듭니다. 가능하면 절삭 단계에 용액을 유지합니다.속도의 경우 분당 12.7밀리미터, 주파수의 경우 87~88헤르츠, 스윙 폭의 0.8~1.0mm로 설정하여 시스템의 절삭 속도, 주파수 및 진동 진폭을 최적화합니다. 뇌 슬라이스를 자르는 동안 전방 후방 좌표, 반구 및 기타 조건을 포함하여 슬라이스 된 좌표를 형식으로 기록하십시오. 두꺼운 플라스틱 파이펫을 사용하여 미리 따뜻워진 ACSF로 채워진 비커로 뇌 슬라이스를 부드럽게 전달합니다.1시간 동안 약 34도의 비커에 있는 뇌 슬라이스를 배양합니다. 이 시간 동안 절삭 단계에서 남은 뇌 블록의 3D 스캔을 수행합니다. 이제 기록 장치에 다중 전극 배열 또는 MEA 칩을 설정합니다.두 개의 튜브를 사용하여 칩을 연동 펌프에 연결합니다. 하나의 튜브를 사용하여 동일한 ACSF를 MEA 칩과 다른 튜브로 안내하여 ACSF를 MEA 칩에서 유도합니다. 두 개의 튜브 끝에 연결된 두 개의 바늘을 MEA 칩 벽 의 상단에 부착합니다.MEA 칩의 내부 벽에 따라 팁으로 위치를 수정합니다. ACSF의 유량을 4.1 RPM으로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 MRI 데이터 처리를 수행하여 피질 볼륨을 추출합니다.MRI 이미지 프로세싱을 수행하려면 3D 슬라이서 무료 소프트웨어를 다운로드하십시오. 3D 슬라이서의 볼륨 렌더링 및 편집기 모듈을 사용하여 생성된 추출된 뇌의 MR 이미지를 엽니다. 모드를 편집기에서 볼륨 렌더링으로 변경하고 대상 버튼을 클릭하여 뇌의 이미지가 화면 중앙에 도달하도록 합니다.MRT-2 뇌 모드를 선택하고 시프트 막대를 이동하여 임계값을 조정합니다. 그런 다음 볼륨 렌더링에서 편집기로 다시 이동하고 임계값 효과 버튼을 클릭합니다. 라벨 41, 대뇌 피질을 적용합니다.그런 다음 양식 체크리스트에서 VTK에서 STL로 파일 형식을 변경하여 뇌 표면 데이터를 STL 파일로 저장합니다. 작은 불일치를 수정하기 위해 스캔 시퀀스 내에서 8개 또는 16개의 각도에서 촬영한 8개 또는 16개의 이미지 중 자동 공동 등록을 수행합니다. 이렇게 하려면 정렬 옵션에 포함된 전역 등록을 클릭하고 이미지를 통합합니다.전체 뇌 표면을 얻기 위해 다른 각도에서 스캔을 반복합니다. 서로 다른 각도에서 스캔한 이미지 간의 통합이 성공적이지 않은 경우 수동 정렬을 클릭하고 고정 된 이미지와 움직이는 이미지 쌍을 선택합니다. 서로 다른 이미지에서 서너 개의 공통 점을 선택하여 이미지의 수동 정렬을 시작합니다.그런 다음 확인을 클릭합니다. 최적화 알고리즘은 반복적 최측근 알고리즘이며 비선형 변형을 포함하지 않습니다. 모든 이미지를 선택하고 메시 생성 버튼을 클릭하여 정렬된 모든 이미지의 메시를 만듭니다. 그런 다음 옵션을 선택하여 작은 아티스틱 오브젝트를 선택하여 메시를 가장 높은 해상도로 가져옵니다.이미지를 STL 바이너리 또는 ASCII 형식으로 저장합니다. 이제 MRI 표면을 열고 표면 처리 소프트웨어를 사용하여 3D 스캔 표면과 병합합니다. 이전과 같이 수동 정렬 프로세스를 수행합니다.그런 다음 이러한 공동 등록된 표면 이미지를 다시 저장합니다. 필요한 경우, 특히 MRI 데이터의 경우 뇌 영역을 둘러싼 작은 소음을 삭제하고 특히 3D 스캔 데이터의 경우 구멍을 채우면 개별 표면 데이터를 청소하십시오. 마지막으로 MATLAB과 같은 데이터 분석 소프트웨어로 표면 데이터를 엽니다.두 서피스 사이의 최소 거리의 히스토그램을 생성하고 평가합니다. 발췌한 뇌의 3D 스캔에서 얻은 MRI 부피와 표면을 제거하여 생성된 피질 표면 간의 거리를 평가하였다. 거리의 히스토그램의 모드 값은 55미크론에 불과합니다.또한, 거리가 0과 같은 지점에서 히스토그램을 축적할 때 누적된 값은 약 300미크론에서 총 샘플 수의 90%에 도달합니다. 두 표면 사이의 거리의 마지막 히스토그램은 약 50 미크론의 전형적인 피크를 보였다. 거시적 관점에서 이 모드 값은 MRI의 복셀 크기에서 100미크론이었던 기하학적 제한에 해당합니다.이 점은 MRI와 3D 스캔 사이의 중복 알고리즘이 훌륭하게 잘 작동했으며 MRI와 3D 스캔 모두의 노이즈 수준이 낮은 값으로 억제되었음을 간접적으로 시사합니다. 이 프로토콜은 스캐닝 기술을 통해 바이오 유기체로 가장 먼저 상승합니다. 이 기술은 원래 순수 엔지니어링 요구에 활용되었습니다.이 기술을 의학에 적용하면 새로운 질문에 답할 수 있습니다. 3D 스캐닝 후, 우리는 칼슘 이미징 벽 패치 그램 레코딩을 사용하여 시간적 및 공간 적 해상도 및 기록 가능한 세포 수측면에서 상호 보완적인 지식을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜이 제공하는 매우 정확한 중복 성능은 해부학 적 공간 규모와 영 공간 규모 사이의 원활한 연결을 이전보다 더 사실적으로 만들 것입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

연구

신경과학

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

3D 인쇄 기술을 활용하여 조직학과 MRI를 병합하기 : 두뇌를위한 프로토콜 단면

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

모델을 새로운 시험관에 폭발 외상 성 뇌 손상의

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...