Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

البحث في نورث كارولاينا مختبر معتمد من قبل منحة معاهد وطنية لصحة (NIH) R01AI24499، ومنحة مؤسسة صحة ولاية نيو جيرسي (نجهف)، #PC40-18.

ملاحظة: بروتوكول التدرجي مفصلة المقايسة يرد أدناه، والبروتوكول التخطيطي ويرد في الشكل 1.
1-سلالات المبيضة وظروف النمو
<ol><li>تنمو سلالات المبيضة في السائل المتوسطة الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YPD) في 30 °مئوية في شاكر حاضنة بين عشية وضحاها. ...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

الاستقلاب المقايسة الجريان الإضافي بمثابة أداة ممتازة لقراءة وظيفة الميتوكوندريا بقياس الفسفرة (أوكسفوس)-استهلاك الأوكسجين تعتمد في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا التحقيق دالة glycolytic ويتم قياسه كنسبة تحمض خارج الخلية (التغير في درجة الحموضة خارج الخلية) في نفس الوقت في تحليل...

الأمراض الفطرية الغازية تقتل ما يزيد على 1.5 مليون شخص سنوياً في جميع أنحاء العالم. هذا الرقم في الارتفاع بسبب زيادة في عدد الأشخاص الذين يعيشون مع حصانة المساس بها، بما في ذلك الرضع المسنين، سابق لأوانه، ومتلقي زرع، و مرضى السرطان1. المبيضة هو ممرض فطرية بشرية انتهازية التي جزء من النبت البشرية. كما يقطن الأسطح المخاطية والجهاز الهضمي ككائن كومينسال. وتنتج المبيضة الأمراض الجهازية الخطيرة في الأشخاص الذين لديهم أوجه القصور المناعي، الذين خضعوا لعملية جراحية، أو الذين قد تم التعامل مع دورات طويلة من المضادات الحيوية. أنواع المبيضات الرتبة من بين أعلى ثلاثة إلى أربعة أسباب الأمراض المعدية (NID) المستشفيات في البشر2،3،،من45،،من67. ويقدر عدد العالمية السنوية من التهابات مجرى الدم المبيضات حالات ~ 400,000، مع نفوق المرتبطة بها من 46-75%1. الوفيات السنوية بسبب داء المبيضات هو تقريبا 10000 في الولايات المتحدة وحدها. مدى NID تسببها الفطريات ينعكس أيضا في نفقات المريض الفلكية5. في الولايات المتحدة، تفوق النفقات السنوية لعلاج الأمراض الفطرية الغازية $ 2 بیلیون، مضيفاً سلالة ضخمة لنظام الرعاية الصحية المثقلة بالفعل. العلاجات المضادة للفطور القياسية المتوفرة حاليا محدودة بسبب السمية، ومقاومة المخدرات أكثر انتشارا، والمخدرات-المخدرات التفاعلات. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتحديد أهداف العقاقير المضادة للفطور الجديدة التي سوف تسفر عن أفضل خيارات العلاج للمرضى المعرضة للخطر. ومع ذلك، اكتشاف أدوية جديدة تعمل على أهداف الفطرية معقد نظراً للفطريات حقيقيات النوى. وهذا يحد بدرجة كبيرة العدد من الأهداف الفطرية الخاصة بالمخدرات.
قد بينت الدراسات الأخيرة أن الميتوكوندريا هي مساهم حرجة لضراوة الفطرية والتسامح للأدوية المضادة للفطور منذ الميتوكوندريا هامة للتنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج8 9، ،،من1011. التمثيل الغذائي سواء جليكوليتيك أو غير جليكوليتيك ضرورية لبقاء المبيضة في الثدييات المضيفة12،،من1314،،من1516. وعلاوة على ذلك، عدة طفرات المبيضة التي تفتقر إلى البروتينات المتقدرية، مثل Goa1، Srr1، Gem1، Sam37 إلخ قد أظهرت أن تكون معيبة في فيلامينتيشن، عامل فوعة هامة من المبيضة17، 18 , 19 , 20 , 21 , 22-وبالإضافة إلى ذلك، عرضت هذه طفرات أيضا أن يخفف لضراوة في نموذج ماوس لنشر داء المبيضات17،،من1819،20،21 ،22. وهكذا، تمثل الميتوكوندريا الفطرية هدفا جذاباً لاكتشاف المخدرات. ومع ذلك، هو التحدي دراسة الوظيفة المتقدرية في المبيضة سبب المبيضة صغيرتي السلبية23، مما يعني أنها لا تستطيع أن تعيش دون جينوم المتقدرية.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي يمكن استخدامها للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وجليكوليتيك في المبيضة دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا. هذا الأسلوب يمكن أن يكون الأمثل أيضا للتحقيق في تأثير التلاعب بالجينات أو المغيرون الكيميائية على مسارات mitochondrial وجليكوليتيك في المبيضة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

الميتوكوندريا هي العضيات الضرورية الأيض الخلوية والبقاء على قيد الحياة. مجموعة متنوعة من الأحداث الرئيسية تجري في الميتوكوندريا، مثل التنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج. ونتيجة لذلك، أفيد بخلل mitochondrial تلعب دوراً هاما في التسامح العقاقير المضادة للفطور وضراوة من الفطريات المسببة للأمراض. البيانات الأخيرة أدت أيضا إلى الاعتراف بأهمية الميتوكوندريا بوصفها مساهما هاما في الآلية المرضية الفطرية. وعلى الرغم من أهمية الميتوكوندريا في الأحياء الفطرية، هي بدائية أساليب موحدة لفهم وظيفتها. نقدم هنا، إجراء دراسة معدل استهلاك الأكسجين القاعدية (OCR)، مقياسا للتنفس المتقدرية، ومعدلات تحمض خارج الخلية (عكر)، مقياسا للدالة جليكوليتيك في سلالات المبيضة . يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا لأي ضغوط كانديداسب. دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من الخلايا الفطرية سليمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تخصيص هذا البروتوكول إلى الشاشة لمثبطات للوظيفة المتقدرية في سلالات المبيضة .

ينصب هذا البروتوكول تحديد وظائف الطاقة البيولوجية المبيضة تقييم من قبل محلل تدفق إضافي. ويرد أيضا متحولة المبيضة التي تفتقر إلى البروتين المتقدرية Mam33 جنبا إلى جنب مع سلالة مكملاً لها، mam33Δ/Δ::MAM33 لدراسة آثار حذف البروتين المتقدرية على التعرف الضوئي على الح...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

هنا، نقدم بروتوكول التدرجي للتحقيق في التنفس المتقدرية والدالة جليكوليتيك في المبيضات البيض استخدام محلل تدفق إضافي.

علم الطاقة الحيوية التحقيق المبيضات البيض "باستخدام" الوقت الحقيقي خارج الخلية التمويه التحليل

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

هذا البروتوكول مهم لتحديد وظيفة جليكوليك والتنفس الميتوكوندريا في المبيضات ألبيكانس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لقياس وظيفة الميتوكوندريا دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من المبيضات ألبيكان. يمكن تحسين هذه الطريقة للتحقيق في آثار التلاعب الجيني أو التضمينات الكيميائية على مسارات الميتوكوندريا والجليكوليك في المبيضات ألبيكان أو غيرها من مسببات الأمراض الفطرية.هذه التقنية بسيطة نسبيا. أو اعتمادا على الكائن الحي، واستخدامها قد تساعد على تحسين عدد الخلايا وتركيز مثبطات الميتوكوندريا في فحصها. في غطاء تدفق لارينار، قم بحل بولي-د-ليسين في مياه شبكة الأنسجة إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل ملليلتر.مزيج من الحل جيدا و aliquot إلى 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنابيب التأكد من aliquot على الأقل 1.3 ملليلتر لكل أنبوب. إضافة 50 ميكرولترات من هذا الخليط إلى كل بئر من لوحة المقايسة، وتغطي الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين. ثم استلهم الحل.شطف آبار لوحة المقايسة مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من المياه الصف زراعة الأنسجة العقيمة، وفتح الغطاء والسماح للآبار لتجفيف الهواء. إذا لم يكن استخدام لوحة اليوم الذي يتم إعداده، تخزينها في أربع درجات مئوية لمدة أقصاها من يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم السابق للتجربة، افتح مجموعة فحص التدفق الإضافي وأزل المحتويات.ضع خرطوشة المستشعر رأسًا على عقب بجوار لوحة الأدوات المساعدة. ملء كل بئر من لوحة فائدة مع ملليلتر واحد من الفرجان ومن ثم وضع خرطوشة الاستشعار مرة أخرى. تأكد من أن أجهزة الاستشعار التي تحتوي على الفلوروفور مغمورة في الكاليبانت.احتضان خرطوشة الاستشعار في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير بين عشية وضحاها. في اليوم السابق للمكاصير، تلقيح albicans C المعدة في مرق YPD وتنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية في شاكر في 200 دورة في الدقيقة. في يوم الفحص ، تمييع عدد مناسب من الخلايا في وسط الفحص لتسفر عن تركيز نهائي من 100 ، 000 خلية لكل 100 ميكرولترات.أضف 100 ميكرولترات من الخلايا المخففة في كل بئر من صفيحة المقايسة باستثناء الآبار A1 و B4 و C3 و D6. إلى هذه الآبار، إضافة 100 ميكرولترات فقط من وسيط مقايسة لتصحيح الخلفية. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير لمدة 60 دقيقة للسماح للخلايا التمسك سطح لوحة. إعداد المركبات لم مقايسة الدالة الميتوكوندريا في تركيز 10X في وسيط فحص المقابلة على النحو المبين في بروتوكول النص.إضافة 50 ميكرولتردات من الشام في ميناء A، 50 ميكرولترات من أوليغوميسين في ميناء B، 62 ميكرولترات من سيانيد البوتاسيوم في ميناء C، و 68 ميكرولترات من أنتيميسين A في ميناء D.Next، وإعداد المركبات لمقايس الإجهاد جليكوليك في تركيز 10X في وسيلة فحص المقابلة كما هو مبين في بروتوكول النص. إضافة 50 ميكرولتررس من الجلوكوز إلى ميناء A، 55 ميكرولترسيس من Oligomycin في ميناء B، 62 ميكرولترات من 2-DG في ميناء C، و 68 ميكرولترات من أنتيميسين A في ميناء D.Before الفحص، وفتح محلل تدفق إضافية وإعداد قالب فحص باستخدام علامة التبويب المعالج المقايسة. اتبع الإرشادات خطوة بخطوة وملء كافة المعلومات التي تخرج أثناء الإعداد.إنشاء تخطيط مجموعة وإعداد البروتوكول كما هو موضح في بروتوكول النص. حفظ هذه التخطيطات قبل الفحص. في وقت الفحص، استعادة البروتوكول المحفوظة عن طريق فتح الملف المقابل في خيار الملف المفتوح في علامة التبويب معالج المقايسة.ثم قم بتحميل مركبات 10X في المنافذ الخاصة بخراطيش الاستشعار المرطبة التي تحتوي على الفرجانت. قم بتحميل خرطوشة المستشعر في علبة الحامل الخاصة بـ Analyzer تدفق إضافي. ابدأ المعايرة بالنقر على زر البدء على الشاشة.بعد ذلك، أضف بلطف 350 ميكرولترات من الوسيلة المقايسة إلى لوحة الخلية على طول جانب الجدران لتقليل اضطراب الخلية ليصل الحجم النهائي إلى 450 ميكرولترات. استبدال لوحة فائدة تحتوي على calibrant مع لوحة المقايسة ومواصلة الفحص. بمجرد اكتمال الفحص، قم بإزالة خرطوشة الاستشعار واللوحة.حفظ الملف في المجلد الوجهة المناسبة. في هذه الدراسة، يتم تقييم الوظائف الحيوية الحيوية من albicans C من قبل محلل تدفق إضافية. كما يتم تضمين متحولة تفتقر إلى بروتين الميتوكوندريا mam33 جنبا إلى جنب مع سلالة مكملة لدراسة آثار حذف بروتين الميتوكوندريا على معدل استهلاك الأكسجين ومعدلات التحمض خارج الخلية.نوع البرية C albicans يظهر معدل استهلاك الأكسجين من 145 picomoles في الدقيقة الواحدة التي هي أيضا ضمن النطاق الأمثل لأي مقايسة تدفق خارج الخلية. معدل استهلاك الأكسجين القاعدي من النوع البري، mam33 متحولة و mam33 سلالات مكملة تظهر أي اختلافات. وبالمثل، لا توجد فروق كبيرة في معدلات التحمض القاعدي خارج الخلية بين السلالات.ومع ذلك ، عن طريق تثبيط معقدة الرابع مع سيانيد البوتاسيوم ، ونوع البرية و mam33 متحولة ، وسلالات مكملة mam33 تظهر تحولا كبيرا نحو تحلل. ومع ذلك فشلت سلالة متحولة mam33 لإظهار تحول جليكوليك تعويضي مما يشير إلى أن المسار التابع المركب الرابع يضعف في هذه السلالة. في اختبار الإجهاد الغليكوليكي، تجوع الخلايا من الجلوكوز لمدة ساعة واحدة ويتم قياس معدل استهلاك الأكسجين القاعدي ومعدل التحمض خارج الخلية.عند المجاعة ، تظهر سلالة mam33 المتحولة انخفاضًا ملحوظًا في استهلاك الأكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية مقارنة بالسلالات الأخرى. وهذا يشير إلى ضعف استخدام الجلوكوز لكل من التنفس وتحلل الدم عندما يتم إجبار الخلايا على حالة المجاعة. بعد حقن الجلوكوز، تظهر جميع السلالات تحفيز كل من معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية.طلاء لوحة المقايسة يسمح لخلايا المبيضات ألبيكانز التمسك لوحة. سوف الالتزام غير لائق من خلايا المبيضات ألبيكانس تؤثر على نتيجة الفحص. بعد تطوير هذه التقنية ، تم استخدامه في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأمراض التي تعالج كيفية عمل الميتوكوندريا أثناء الظروف الفسيولوجية والمرضية.على سبيل المثال، باستخدام الخلايا المشتقة من المريض والتحكم في هذا الفحص، من الممكن معالجة أسئلة محددة حول كيفية تغيير وظيفة الميتوكوندريا. وينبغي توخي الحذر أثناء إعداد مثبطات الميتوكوندريا مثل سيانيد البوتاسيوم ومضادات السموم A لأن هذه المركبات سامة للغاية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

في الوقت الحقيقي بيوفيدباك الرنين المغناطيسي الوظيفي استهداف القشرة الأمامية المدارية للقلق التلوث

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

حركة إعادة التدريب في الوقت الحقيقي باستخدام ملاحظات من الأداء

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

الناجم عن العلاج الكيميائي الأوعية الدموية سمية - في الوقت الحقيقي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من سفينة انخفاض

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

في الوقت الحقيقي السمسة فحوصات في الدم الكامل بالبشر

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...