Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Forskning i NC lab er støttet af en National Institutes of Health (NIH) grant R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) tilskud, #PC40-18.

Bemærk: Detaljeret trinvis protokollen af analysen er beskrevet nedenfor, og den skematiske protokol er vist i figur 1.
1. C. albicans stammer og vækstbetingelser
<ol><li>Vokse C. albicans stammer i flydende gær Extract-pepton-Dextrose (YPD) medium ved 30 °C i en inkubator shaker natten over. Bemærk: Fastholde Candida stammer som frosne bestande og vokse på YPD agar (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% dextrose og 2% agar)...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

Bioenergetik ekstra flux assay fungerer som et fremragende værktøj til at læse den mitokondrielle funktion ved at måle oxidativ fosforylering (OXPHOS)-afhængig af iltforbrug i realtid. En glycolytic funktion, som måles som en ekstracellulære forsuring sats (ændring af ekstracellulære pH) kan derudover også undersøges på samme tid i realtid analyse.
Vellykket plating af C. albicans i assay plade er en af de afgørende trin i analysen fordi inkubation af celler i PDL overtru...

Invasive svampeinfektioner dræbe over 1,5 millioner mennesker om året på verdensplan. Dette tal er stigende på grund af en stigning i antallet af mennesker, der lever med kompromitteret immunitet, herunder ældre, forhastet spædbørn, transplanterede og kræft patienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige svampe patogen, der er en del af den menneskelige mikroflora. Det lever også slimhindeinfektioner og mave-tarmkanalen som en commensal organisme. C. albicans producerer alvorlig systemisk sygdom i mennesker, der har immun mangler, der har gennemgået kirurgi, eller der er blevet behandlet med lange kurser af antibiotika. Candida arter rang blandt de top tre til fire årsager til nosokomielle infektionssygdomme (NID) i mennesker2,3,4,5,6,7. Årlige globale antallet af Candida infektioner i blodet er anslået til at være tilfælde, ~ 400.000, med tilknyttede MORTALITET på 46-75%1. Den årlige dødelighed på grund af candidiasis er omtrent 10.000 i USA alene. Omfanget af NID forårsaget af svampe afspejles også i astronomiske patient udgifter5. I USA overgår den årlige udgift til behandling af invasive svampeinfektioner $2 milliarder, tilføje en stor stamme til allerede overbebyrdet sundhedsvæsen. I øjeblikket er tilgængelige standard svampedræbende behandlingsformer begrænset på grund af toksicitet, stadig mere udbredt resistens og stof-drug interaktioner. Derfor er der et presserende behov for at identificere nye svampedræbende stof mål, der vil resultere i bedre behandlingsmuligheder for højrisiko patienter. Opdagelsen af nye lægemidler på svampe mål er imidlertid komplicerede, fordi svampe er eukaryoter. Dette begrænser stærkt antallet af svampe-specifikke stof mål.
Nylige undersøgelser har vist, at mitokondrier er en kritisk bidragyder til svampe virulence og tolerance at svampemidler da mitokondrier er vigtig for cellulære respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose8 ,9,10,11. Både glykolytiske og ikke-glycolytic stofskifte er afgørende for overlevelse af C. albicans i pattedyr vært12,13,14,15,16. Desuden har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrielle proteiner, såsom Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist sig at være defekt i filamentation, en vigtig virulens faktor af C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Desuden disse mutanter blev også vist sig at være svækket til virulens i en musemodel af formidlet candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Svampe mitokondrier udgør således, et attraktivt mål for drug discovery. Men studiet af mitokondrie-funktionen i C. albicans udfordrende for C. albicans er petite negative23, hvilket betyder, at det ikke kan overleve uden den mitokondrielle genom.
Her, beskriver vi en protokol, der kan bruges til at undersøge mitokondrie og glycolytic funktion i C. albicans uden at skulle rense mitokondrier. Denne metode kan også være optimeret til at undersøge effekten af genetiske manipulation eller kemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic veje i C. albicans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

Mitokondrier er væsentlige organelles for cellulære metabolisme og overlevelse. En række vigtige begivenheder sted i mitokondrierne, cellulær respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose. Derfor er mitokondriel dysfunktion rapporteret til at spille en vigtig rolle i svampedræbende stof tolerance og virulens af patogene svampe. De seneste data har også ført til anerkendelse af betydningen af mitokondrier som en vigtig bidragyder til svampe patogenese. Trods vigtigheden af mitokondrier i svampe biologi, er standardiserede metoder til at forstå dens funktion dårligt udviklet. Vi præsenterer her, en procedure for at studere basal ilt forbrugssats (OCR), en foranstaltning af mitokondrie respiration og ekstracellulære forsuring satser (ECAR), en foranstaltning af glykolytiske funktion i C. albicans stammer. Den metode beskrevet heri kan anvendes til enhver Candidaspp. stammer uden at skulle rense mitokondrier fra de intakte svampe celler. Desuden, denne protokol kan også tilpasses til skærmen for hæmmere af mitokondrie-funktionen i C. albicans stammer.

Fokus i denne protokol er at fastslå de bioenergetic funktioner af C. albicans vurderet af ekstra flux analyzer. En C. albicans mutant mangler mitokondrie protein Mam33 er også inkluderet sammen med dens komplement stamme, mam33Δ/Δ::MAM33 at studere virkningerne af sletning af en mitokondrie protein på OCR og ECAR. MAM33 koder til en formodede mitokondrie sure matrix protein og dens funktion i Candida er ikke kendt.
<p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Vi præsenterer her, en trinvis protokol for at undersøge den mitokondrielle respiration og glycolytic funktion i Candida Albicans ved hjælp af en ekstra flux analyzer.

Bio-energetik undersøgelse af Candida albicans ved hjælp af Real-time ekstracellulære Flux analyse

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Denne protokol er signifikant for bestemmelse af den glykolytiske funktion og mitokondrielt åndedræt hos Candida albicans. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for mitokondriel funktion, der skal måles uden behov for at rense mitokondrier fra Candida albicans. Denne metode kan optimeres til at undersøge virkningerne af genetisk manipulation eller kemiske modulatorer på mitokondrielle og glykolytiske veje i Candida albicans eller andre svampepatogener.Denne teknik er forholdsvis enkel. Eller afhængigt af organismen, deres anvendelse kan bidrage til at optimere cellenummer og koncentrationen af mitokondrielle hæmmere i deres analyse. I en laminar flow hætte opløses Poly-D-Lysin i vævsgittervand til en endelig koncentration på 50 mikrogram pr. milliliter.Bland opløsningen godt og aliquot det i 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og sørg for at aliquot mindst 1,3 milliliter pr rør. Tilsæt 50 mikroliter af denne blanding til hver brønd af analysen plade, dække låget og inkubere ved stuetemperatur i en til to timer. Derefter aspirere opløsningen.Skyl analysens brønde én gang med 500 mikroliter sterilt vævskulturvand, åbn låget og lad brøndene lufttørre. Hvis du ikke bruger pladen den dag, den er forberedt, opbevares den ved fire grader Celsius i højst to til tre dage. Dagen før eksperimentet skal du åbne det ekstra fluxanalysesæt og fjerne indholdet.Placer sensorpatronen på hovedet ved siden af bryggeren. Fyld hver brønd på bryggepladen med en milliliter kalikal, og placer derefter sensorpatronen tilbage. Sørg for, at de sensorer, der indeholder fluorophores er nedsænket i kalibranten.Inkuber sensorpatronen ved 37 grader Celsius i en ikke-kuldioxid inkubator natten over. Dagen før analysen, vaccinere de forberedte C albicans i YPD bouillon og vokse natten over ved 30 grader Celsius i en shaker på 200 rpm. På analysedagen fortyndes et passende antal celler i analysemediet for at give en endelig koncentration på 100.000 celler pr. 100 mikroliter.Der tilsættes 100 mikroliter af de fortyndede celler i hver brønd af analysepladen undtagen brønde A1, B4, C3 og D6. Til disse brønde, tilføje kun 100 mikroliter af analyse medium for baggrundskorrektion. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i en ikke-kuldioxid inkubator i 60 minutter for at lade cellerne klæbe til pladens overflade. Forbered forbindelserne til mitokondriel funktion assay ved 10X koncentration i den tilsvarende analyse medium som skitseret i tekstprotokollen.Der tilsættes 50 mikroliter SHAM i port A, 50 mikroliter Oligomycin i port B, 62 mikroliter kaliumcyanid i port C og 68 mikroliter Antimycin A i port D.Next, klargør forbindelserne til den glykolytiske stressanalyse ved 10X-koncentrationen i det tilsvarende analysemedium som beskrevet i tekstprotokollen. Tilføj 50 mikroliter af glukose til port A, 55 mikroliter Oligomycin i port B, 62 mikroliter af 2-DG i port C, og 68 mikroliter af Antimycin A i port D.Before analysen, åbne den ekstra flux analysator og oprette analysen skabelon ved hjælp af asrinteratoren fanen. Følg de trinvise instruktioner, og udfyld alle de oplysninger, der vises under installationen.Generér et gruppelayout, og konfigurer protokollen som beskrevet i tekstprotokollen. Gem disse layouts før analysen. På tidspunktet for analysen skal du gendanne den gemte protokol ved at åbne den tilsvarende fil i indstillingen åben fil under fanen Analyseguide.Læg derefter 10X-forbindelserne i de respektive porte på den hydrerede sensorpatron, der indeholder kalibrenet. Læg sensorpatronen i bærebakken på den ekstra fluxanalysator. Start kalibreringen ved at klikke på startknappen på skærmen.Dernæst forsigtigt tilføje 350 mikroliter af analysen medium til cellepladen langs siden af væggene for at minimere celleforstyrrelser bringe det endelige volumen til 450 mikroliter. Udskift brugspladen, der indeholder kalibren, med analysepladen, og fortsæt analysen. Når analysen er afsluttet, skal du fjerne sensorpatronen og pladen.Gem filen i den relevante destinationsmappe. I denne undersøgelse, den bio-energiske funktioner af C albicans vurderes ved ekstra flux analysator. En mutant, der mangler mitokondrielt protein mam33, er også inkluderet sammen med dens komplementstamme for at undersøge virkningerne af sletningen af et mitokondrielt protein på iltforbrugshastigheden og ekstracellulære forsuringsrater.C albicans vilde type viser en iltforbrug på 145 picomoles per minut, som er godt inden for det optimale område for enhver ekstracellulær flux assay. Den basale iltforbrug sats af den vilde type, mam33 mutant og mam33 suppleret stammer viser ingen forskelle. Tilsvarende er der ingen væsentlige forskelle i de basale ekstracellulære forsuringsrater mellem stammerne.Men ved at hæmme kompleks-IV med kaliumcyanid, den vilde type og mam33 mutant, mam33 suppleret stammer viser et betydeligt skift i retning af glykolyse. Den mam33 mutant stamme dog undladt at vise en kompenserende glykolytisk skift tyder på, at den sammensatte IV afhængige vej er svækket i denne stamme. I den glykolytiske stresstest sultes cellerne af glukose i en time, og den basale iltforbrugshastighed og den ekstracellulære forsuringshastighed måles.Ved sult viser mam33-mutantstammen betydeligt lavere iltforbrug og ekstracellulær forsuring sammenlignet med de andre stammer. Dette tyder på en nedsat udnyttelse af glukose for både respiration og glykolyse, når cellerne er tvunget til sult tilstand. Efter injektion glukose, alle stammer viser stimulation af både deres iltforbrug sats og ekstracellulær forsuring sats.Belægningen af analysepladen gør det muligt for Candida albicansceller at holde sig til pladen. Forkert overholdelse af Candida albicans celler vil påvirke analysen resultat. Efter udviklingen af denne teknik, det har været ansat i en bred vifte af celletyper og sygdomme, der beskæftiger sig med, hvordan mitokondrier funktion under fysiologiske og patologiske forhold.For eksempel, beskæftiger patient-afledte og kontrolceller i denne analyse, er det muligt at behandle de specifikke spørgsmål om, hvordan mitokondrielle funktion er ændret. Der skal være forsigtighed under tilberedning af mitokondrielle hæmmere såsom kaliumcyanid og antimycin A, fordi disse forbindelser er ekstremt giftige.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

Real-time fMRI Biofeedback Målretning af orbitofrontal Cortex for forurening Angst

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA Påvisning i prostata tumorer ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Bevægelse Omskoling med Real-time feedback af Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Kemoterapi-induceret vaskulær toksicitet - Real-time<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Vessel Nedskrivninger

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Vurdering af kræft i æggestokkene Sfæroide Attachment og invasion af mesotelceller i Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time cytotoksicitetsassays i humant fuldblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...