Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Forschung im NC-Editor wird unterstützt durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 und einen Zuschuss von New Jersey Health Foundation (NJHF), #PC40-18.

Hinweis: Das detaillierte schrittweise Protokoll des Assays ist weiter unten beschrieben und die schematische Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. C. Albicans -Stämme und Wachstumsbedingungen
<ol><li>Wachsen Sie C. Albicans -Stämme in flüssige Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Medium bei 30 °C in einem Inkubator-Shaker über Nacht. Hinweis: Candida -Stämme als gefrorene Bestände zu erhalten und wachsen au...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

Die Bioenergetik zusätzliches Flussmittel Assay dient als ein hervorragendes Tool zum Auslesen der mitochondrialen Funktion durch Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) messen-abhängige Sauerstoffverbrauch in Echtzeit. Darüber hinaus kann eine glykolytische Funktion, die als eine extrazelluläre Übersäuerung Rate (Veränderung des extrazellulären pH) gemessen wird auch gleichzeitig in Echtzeit-Analyse untersucht werden.
Erfolgreiche Beschichtung von C. Albicans in der Assay-Platte ...

Invasive Pilzinfektionen töten mehr als 1,5 Millionen Menschen pro Jahr weltweit. Diese Nummer ist auf dem Vormarsch durch eine Erhöhung der Anzahl der Menschen, die mit infizierten Immunität, einschließlich älterer, vorzeitige Säuglinge, Transplantationspatienten und Krebs Patienten1. C. Albicans ist eine opportunistische menschlichen pilzliche Erreger, die ein Teil der menschlichen Mikroflora ist. Er bewohnt auch Schleimhaut-Oberflächen und den Magen-Darm-Trakt als Kommensalen Organismus. C. Albicans produziert schwere systemische Erkrankung bei Menschen mit Immunschwäche, die Operation unterzogen haben, oder wer mit langen Kurse der Antibiotika behandelt wurden. Der Candida Spezies zählen zu den Top drei bis vier Ursachen nosokomialer Infektionskrankheiten (NID) in Menschen2,3,4,5,6,7. Die jährliche globale Anzahl von Candida -Infektionen Blutkreislauf wird voraussichtlich ~ 400.000 Fälle mit damit verbundenen Todesfälle von 46-75 %1. Die jährliche Sterblichkeit wegen Candidiasis ist etwa 10.000 in den Vereinigten Staaten allein. Das Ausmaß der durch Pilze hervorgerufenen NID spiegelt sich auch im astronomischen Patienten Kosten5. In den USA übertrifft die jährlichen Kosten für die Behandlung von invasiven Pilzinfektionen $ 2 Milliarden, bereits überlasteten Gesundheitssystem eine große Belastung hinzufügen. Derzeit verfügbare standard antimykotische Therapien begrenzt wegen der Toxizität, immer häufiger Resistenzen und Wechselwirkungen. Daher ist dringend erforderlich, neue Angriffspunkte für antimykotische Medikamente zu identifizieren, die bessere Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit hohem Risiko führt. Die Entdeckung neuer Medikamente auf Pilz Ziele ist jedoch komplizierter, weil Pilze Eukaryoten sind. Dies schränkt erheblich die Zahl der Pilz-spezifische Drogeziele.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass Mitochondrien einen kritischen Beitrag zu den Pilz Virulenz und Toleranz gegenüber Antimykotika da Mitochondrien wichtig für die Zellatmung, oxidativen Stoffwechsel, Signaltransduktion und Apoptose8 sind ,9,10,11. Glykolytische und nicht glykolytischen Stoffwechsel sind essentiell für das Überleben von C. Albicans im Säugetier-Wirt12,13,14,15,16. Darüber hinaus haben mehrere C. Albicans Mutanten fehlt mitochondrialen Proteine, wie z.B. Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. erwiesen, in Filamentierung, einem wichtigen Virulenzfaktor von C. Albicans17, defekt 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Darüber hinaus diese Mutanten zeigten auch abgeschwächt werden, denn in einem Mausmodell der Virulenz Candidiasis17,18,19,20,21 verbreitet ,22. Pilze Mitochondrien stellen somit, ein attraktives Ziel für die Arzneimittelforschung. Die Untersuchung der Funktion der Mitochondrien in C. Albicans ist jedoch schwierig, da C. Albicans ist petite negative23, was bedeutet, dass es ohne das mitochondriale Genom nicht überleben kann.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zu untersuchen, mitochondriale und glykolytische Funktion in C. Albicans ohne die Notwendigkeit, die Mitochondrien zu reinigen. Diese Methode kann auch optimiert werden, um die Auswirkungen der Genmanipulation oder chemische Modulatoren auf mitochondriale und glykolytische Wege in C. Albicansuntersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

Mitochondrien sind wesentliche Organellen für den Zellstoffwechsel und das Überleben. Eine Vielzahl von wichtigen Veranstaltungen finden statt in den Mitochondrien, z. B. oxidativen Stoffwechsel, Zellatmung, Signaltransduktion und Apoptose. Infolgedessen wird die mitochondriale Dysfunktion berichtet, eine wichtige Rolle in der pilzbefallverhütende Droge Toleranz und Virulenz von pathogenen Pilzen. Die jüngsten Daten führten auch die Anerkennung der Bedeutung der Mitochondrien als ein wichtiger Faktor für Pilz Pathogenese. Trotz der Bedeutung der Mitochondrien in Pilz-Biologie sind standardisierte Methoden, um seine Funktion zu verstehen schlecht entwickelt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um die basalen Sauerstoff-Verbrauch (OCR), ein Maß für die mitochondriale Atmung und extrazelluläre Übersäuerung Preise (ECAR), ein Maß für die glykolytischen Funktion in C. Albicans -Stämmen zu studieren. Die hier beschriebene Methode kann auf alle Candidaspp. Stämme ohne Mitochondrien von den intakten Pilzzellen zu reinigen angewendet werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch angepasst werden zum Bildschirm für Inhibitoren der mitochondrialen Funktion in C. Albicans -Stämmen.

Im Mittelpunkt dieses Protokolls ist zu bestimmen, der bioenergetischen Funktionen von C. Albicans durch zusätzliches Flussmittel Analyzer bewertet. Eine mitochondriale Protein Mam33 fehlt C. Albicans -Mutante ist auch zusammen mit seiner Ergänzung Belastung, mam33Δ/Δ::MAM33 Studie zu den Auswirkungen der Löschung eines mitochondrialen Proteins auf OCR und ECAR enthalten. MAM33 kodiert für eine vermeintliche mitochondriale sauren Matrix-Protein un...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Hier präsentieren wir eine schrittweise Protokoll um die mitochondriale Atmung und glykolytische Funktion in Candida Albicans untersuchen mit ein zusätzliches Flussmittel-Analyzer.

Bio-Energetik-Untersuchung von Candida Albicans mittels Real-Time extrazelluläre Flux Analyse

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Dieses Protokoll ist wichtig für die Bestimmung der glykolytischen Funktion und der mitochondrialen Atmung bei Candida albicans. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es ermöglicht, die mitochondriale Funktion zu messen, ohne die Notwendigkeit, Mitochondrien von Candida albicans zu reinigen. Diese Methode kann optimiert werden, um die Auswirkungen von genetischer Manipulation oder chemischen Modulatoren auf mitochondriale und glykolytische Wege bei Candida Albicans oder anderen Pilzerregern zu untersuchen.Diese Technik ist relativ einfach. Oder je nach Organismus, ihre Verwendung kann helfen, die Zellzahl und die Konzentration von mitochondrialen Inhibitoren in ihrem Assay zu optimieren. In einer laminaren Strömungshaube poly-D-Lysin in Gewebegitterwasser auf eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter auflösen.Mischen Sie die Lösung gut und aliquot es in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre, die sicherstellen, dass mindestens 1,3 Milliliter pro Tube aliquotieren. 50 Mikroliter dieser Mischung in jeden Brunnen der Assayplatte geben, den Deckel bedecken und bei Raumtemperatur ein bis zwei Stunden brüten. Dann die Lösung ansaugen.Spülen Sie die Brunnen der Assayplatte einmal mit 500 Mikroliter sterilem Gewebekultur-Grade-Wasser, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Brunnen trocknen. Wenn Sie die Platte nicht am Tag der Präparat verwenden, lagern Sie sie bei vier Grad Celsius für maximal zwei bis drei Tage. Öffnen Sie am Tag vor dem Experiment das zusätzliche Fluss-Assay-Kit und entfernen Sie den Inhalt.Stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Gebrauchsschild. Füllen Sie jeden Brunnen der Gebrauchsplatte mit einem Milliliter Kalibrant und legen Sie dann die Sensorpatrone wieder auf. Stellen Sie sicher, dass die Sensoren, die Fluorophore enthalten, in das Kalibrant eingetaucht sind.Inkubieren Sie die Sensorpatrone über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Am Tag vor dem Test impfen Sie die vorbereiteten C-Albicans in der YPD-Brühe und wachsen über Nacht bei 30 Grad Celsius in einem Shaker bei 200 U/min. Am Tag des Assays eine angemessene Anzahl von Zellen im Testmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro 100 Mikroliter zu ergeben.Fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Zellen in jeden Brunnen der Assayplatte mit Ausnahme der Brunnen A1, B4, C3 und D6 hinzu. Zu diesen Brunnen, fügen Sie nur 100 Mikroliter Assay-Medium für Hintergrundkorrektur. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator für 60 Minuten, damit die Zellen an der Plattenoberfläche haften. Bereiten Sie die Verbindungen für den mitochondrialen Funktionstest mit 10-facher Konzentration im entsprechenden Assaymedium vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Fügen Sie 50 Mikroliter SHAM in Port A, 50 Mikroliter Oligomycin in Port B, 62 Mikroliter Kaliumcyanid in Port C und 68 Mikroliter Antimycin A in Port D.Next, bereiten Sie die Verbindungen für den glykolytischen Stresstest bei 10-facher Konzentration im entsprechenden Assaymedium vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie 50 Mikroliter Glukose in Port A, 55 Mikroliter Oligomycin in Port B, 62 Mikroliter 2-DG in Port C und 68 Mikroliter Antimycin A in Port D.Vor dem Test, öffnen Sie den zusätzlichen Flussanalysator und richten Sie die Assay-Vorlage mithilfe der Registerkarte Assay-Assistent ein. Befolgen Sie die Schritt-für-Schritt-Anleitung und füllen Sie alle Informationen aus, die während des Setups angezeigt werden.Generieren Sie ein Gruppenlayout, und richten Sie das Protokoll wie im Textprotokoll beschrieben ein. Speichern Sie diese Layouts vor dem Test. Stellen Sie zum Zeitpunkt des Assays das gespeicherte Protokoll wieder her, indem Sie die entsprechende Datei in der Option "Geöffnete Datei" auf der Registerkarte Assay-Assistent öffnen.Dann laden Sie die 10X Verbindungen in die entsprechenden Anschlüsse der hydratisierten Sensorpatrone, die das Kalibrant enthält. Laden Sie die Sensorpatrone in das Trägerfach des zusätzlichen Flussanalysators. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie auf die Starttaste auf dem Bildschirm klicken.Als nächstes fügen Sie 350 Mikroliter des Assaymediums vorsichtig auf die Zellplatte an der Seite der Wände, um Zellstörungen zu minimieren, wodurch das endige Volumen auf 450 Mikroliter ankommt. Ersetzen Sie die Gebrauchsplatte, die das Kalibrant enthält, durch die Assayplatte und setzen Sie den Assay fort. Sobald der Test abgeschlossen ist, entfernen Sie die Sensorpatrone und die Platte.Speichern Sie die Datei im entsprechenden Zielordner. In dieser Studie werden die bioenergetischen Funktionen der C-Albicans durch einen zusätzlichen Flussanalysator bewertet. Ein Mutant, dem das mitochondriale Protein mam33 fehlt, ist ebenfalls enthalten, zusammen mit seinem Komplementstamm, um die Auswirkungen der Deletion eines mitochondrialen Proteins auf die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazellulären Versauerungsraten zu untersuchen.Der C albicans Wildtyp zeigt eine Sauerstoffverbrauchsrate von 145 Picomolen pro Minute, die gut im optimalen Bereich für jeden extrazellulären Flusstest liegt. Die Basalsauerstoffverbrauchsrate der Wildart, mam33 mutiert und mam33 ergänzte Stämme zeigen keine Unterschiede. In ähnlicher Weise sind keine signifikanten Unterschiede in den basalen extrazellulären Versauerungsraten zwischen den Stämmen zu beobachten.Durch die Hemmung von Komplex-IV mit Kaliumcyanid, dem Wildtyp und mam33-Mutanten zeigen mam33-Ergänzungsstämme jedoch eine signifikante Verschiebung in Richtung Der Glykolyse. Der mam33 mutierte Stamm zeigte jedoch keine kompensatorische glykolytische Verschiebung, die darauf hindeutet, dass der verbindungs-IV-abhängige Weg in diesem Stamm beeinträchtigt ist. Im glykolytischen Stresstest werden die Zellen eine Stunde lang an Glukose verhungert und die Basalsauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Versauerungsrate gemessen.Nach dem Hungertod zeigt der mam33 mutierte Stamm deutlich niedrigere Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Versauerungsraten im Vergleich zu den anderen Stämmen. Dies deutet auf eine beeinträchtigte Verwendung von Glukose für Atmung und Glykolyse hin, wenn Zellen zum Hungerzustand gezwungen werden. Nach der Injektion von Glukose zeigen alle Stämme eine Stimulation sowohl ihrer Sauerstoffverbrauchsrate als auch ihrer extrazellulären Versauerungsrate.Die Beschichtung der Assayplatte ermöglicht Candida albicans Zellen, auf der Platte zu haften. Unsachgemäße Haftung von Candida albicans Zellen wird das Assay-Ergebnis beeinflussen. Nach der Entwicklung dieser Technik, Es wurde in einer Breitenpalette von Zelltypen und Krankheiten verwendet, die sich damit befassen, wie Mitochondrien unter physiologischen und pathologischen Bedingungen funktionieren.Beispielsweise ist es unter Verwendung von patientenabgeleiteten und Kontrollzellen in diesem Test möglich, die spezifischen Fragen zu beantworten, wie die mitochondriale Funktion verändert wird. Bei der Herstellung von mitochondrialen Inhibitoren wie Kaliumcyanid und Antimycin A ist Vorsicht geboten, da diese Verbindungen extrem giftig sind.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Forschung

Medizin

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

Real-time fMRI Biofeedback Targeting des orbitofrontalen Cortex für die Kontamination Anxiety

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Movement Umschulung mit Echtzeit-Feedback von Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapie-induzierte vaskuläre Toxizität - Echtzeit-<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt