Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

המחקר במעבדה NC נתמך על ידי מענק הלאומי מכונים לבריאות (NIH) R01AI24499 מענק קרן בריאות ניו ג'רזי (NJHF), PC40-18.

הערה: פרוטוקול stepwise מפורט וזמינותו היא כמפורט להלן, פרוטוקול סכמטית מוצג באיור1.
1. ג אלביקנס זנים ותנאי גידול
<ol><li>גדלים זנים אלביקנס ג נוזלי בינוני תמצית-Peptone-Dextrose שמרים (YPD) ב- 30 °C ב שייקר אינקובטור בן לילה. הערה: לשמור על זנים של קנדידה מ...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

ביואנרגיה השטף נוספת assay משמש כלי מצוין כדי לקרוא את הפונקציה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת זרחון חמצוני (OXPHOS)-צריכת חמצן התלויים בזמן אמת. בנוסף, פונקציה glycolytic, אשר נמדד כמו שיעור חוץ-תאית acidification (שינוי ב- pH חוץ-תאית) יכול ייחקרו גם במקביל בניתוח בזמן אמת.
ציפוי מוצלחת של אלבי?...

זיהומים פטרייתיים פולשנית להרוג מעל 1.5 מיליון אנשים בשנה ברחבי העולם. המספר הזה הוא בעלייה בשל עלייה במספר האנשים החיים עם חסינות פרוץ, לרבות תינוקות קשישים, מוקדמת, השתלת הנמענים, חולי סרטן1. ג אלביקנס הוא הזדמנותית פטריות פתוגניות זה חלק microflora האדם. הוא שוכן גם ומשטחים הרירית של מערכת העיכול כאורגניזם commensal. אלביקנס ג מייצרת מחלה מערכתית קשה אצל אנשים שיש להם ליקויים החיסונית, אשר עברו ניתוח, או מי שטופלו עם קורסים ארוכים של אנטיביוטיקה. הדרגה מינים קנדידה בין הגורמים המובילים שלושה או ארבעה nosocomial מחלות זיהומיות (ניד) ב בני אדם2,3,4,5,6,7. מספר זיהומים קנדידה למחזור הדם העולמי השנתי מוערך ~ 400,000 מקרים, עם בהירושימה המשויך של 46-75%1. התמותה השנתי עקב קנדידה הוא בערך 10,000 בארצות הברית לבדה. היקף ניד הנגרמת על ידי פטריות משתקפת גם הוצאות אסטרונומיות החולה5. בארצות הברית, על הטיפול של זיהומים פטרייתיים פולשנית הוצאות שנתי עולה 2 מיליארד דולר, הוספת זן ענק כבר עומס מערכת הבריאות. כיום, טיפולים נגד פטריות סטנדרטיים זמינים מוגבלות בשל רעילות, תרופתיים נפוץ יותר ויותר, סמים-תרופתיות. לכן, יש צורך דחוף לזיהוי מטרות תרופה נגד פטריות חדש זה יביא באפשרויות טיפול טוב יותר לחולים בסיכון גבוה. עם זאת, הגילוי של תכשירים חדשים על מטרות פטרייתי הוא מסובך כי פטריות פרוקריוטים. זה מאוד מגביל את מספר מטרות ספציפיות פטרייתי סמים.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המיטוכונדריה הם תורם קריטי לאלימות ולגרימת פטרייתי עמידות לתרופות נגד פטריות מאז המיטוכונדריה חשובים נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות של אפופטוזיס8 ,9,10,11. מטבוליזם glycolytic והן הלא-glycolytic חיוניים להישרדותה של אלביקנס ג המארח בתרבית של12,13,14,15,16. יתר על כן, מספר מוטציות אלביקנס ג חסר חלבונים מיטוכונדריאלי, כגון Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 וכו ' הוכחו להיות פגום בתוך filamentation, גורם חשוב התקפה אלימה של אלביקנס ג17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. בנוסף, המוטנטים האלה הוצגו גם כדי להיות הקלוש של התקפה אלימה במודל של עכברים של המופץ קנדידה17,18,19,20,21 ,22. לפיכך, המיטוכונדריה פטרייתי מייצגים ליעד אטרקטיבי עבור גילוי תרופות. עם זאת, המחקר של פונקציית מיטוכונדריאלי אלביקנס ג הוא מאתגר כי אלביקנס ג פטיט שלילי23, מה שאומר כי זה לא יכול לשרוד בלי גנום מיטוכונדריאלי.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את פונקציית מיטוכונדריאלי, glycolytic אלביקנס ג ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה. ניתן למטב בשיטה זו גם כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית או מאפננים כימי על מסלולים מיטוכונדריאלי ו glycolytic ב ג אלביקנס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

המיטוכונדריה הם organelles חיוני כדי להפוך את חילוף החומרים הסלולר הישרדות. מגוון רחב של אירועי מפתח יתקיים המיטוכונדריה, כגון נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות אפופטוזיס. כתוצאה מכך, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא דיווח יש תפקיד חשוב סבילות נגד פטריות, התקפה אלימה של פטריות פתוגניים. נתונים עדכניים הובילו גם ההכרה על החשיבות של המיטוכונדריה כמו תורם חשוב בפתוגנזה פטרייתי. למרות החשיבות של המיטוכונדריה בביולוגיה פטרייתי, שיטות מתוקננים כדי להבין את הפונקציה שלה הן מפותחות. כאן, אנו מציגים את הליך ללמוד שיעור צריכת החמצן הבזליים (OCR), מידת הנשימה מיטוכונדריאלי, ו המחירים חוץ-תאית acidification (ECAR), מדד של פונקציית glycolytic אלביקנס ג זנים. השיטה המתוארת במסמך זה ניתן ליישם כל זני Candidaspp. ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה מתאי פטרייתי ללא פגע. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם אישית עבור מעכבי של פונקציית מיטוכונדריאלי זנים אלביקנס ג מסך.

המוקד של פרוטוקול זה היא לקבוע את הפונקציות bioenergetic של ג אלביקנס מוערך על ידי מנתח השטף נוספת. מוטציה אלביקנס ג חסר חלבון מיטוכונדריאלי Mam33 נכלל גם יחד עם זן המשלים שלו, mam33Δ/Δ::MAM33 לחקור את ההשפעות של המחיקה של חלבון מיטוכונדריאלי OCR, ECAR. MAM33 מקודד על חלבון ...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול stepwise לחקור את הנשימה מיטוכונדריאלי והתפקוד glycolytic ב קנדידה אלביקנס באמצעות עם מנתח נוסף השטף.

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

פרוטוקול זה משמעותי לקביעת התפקוד הגליקוליטי והנשימה המיטוכונדרית בקנדידה אלביקנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של תפקוד המיטוכונדריאלי ללא צורך לטהר מיטוכונדריה מקנדידה אלביקנים. שיטה זו יכולה להיות אופטימיזציה כדי לחקור את ההשפעות של מניפולציה גנטית או אפנונים כימיים על מסלולים מיטוכונדריאליים גליקוליטיים קנדידה אלביקנים או פתוגנים פטרייתיים אחרים.טכניקה זו פשוטה יחסית. או בהתאם לאורגניזם, השימוש בהם עשוי לעזור לייעל את מספר התא ואת הריכוז של מעכבי המיטוכונדריה בהסטה שלהם. במכסה המנוע של זרימה למינארית, ממיסים פולי-D-ליסין במים רשת רקמות לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר.מערבבים היטב את הפתרון ו aliquot אותו לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר הקפדה aliquot לפחות 1.3 מיליליטר לצינור. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת זו לכל באר של צלחת ההתסקרות, מכסים את המכסה ודורגים בטמפרטורת החדר במשך שעה עד שעתיים. אז שאף את הפתרון.לשטוף את בארות צלחת ההתזה פעם אחת עם 500 microliters של מים כיתה רקמות סטריליות, לפתוח את המכסה ולאפשר בארות אוויר יבש. אם לא משתמשים בצלחת ביום שבו היא מוכנה, מאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שלושה ימים לכל היותר. יום לפני הניסוי, לפתוח את ערכת בדיקה שטף נוסף ולהסיר את התוכן.מקם את מחסנית החיישן במהופך ליד לוחית השירות. מלא כל באר של צלחת השירות עם מיליליטר אחד של כיול ולאחר מכן למקם את מחסנית החיישן בחזרה. ודאו שהחיישנים המכילים פלואורופורים שקועים בכיול.דגירה מחסנית החיישן ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני לילה. יום לפני ההתמדה, לחסן את אלביקנים C מוכן במרק YPD ולגדול לילה ב 30 מעלות צלזיוס בשייקר ב 200 סל"ד. ביום ההתמדה, לדלל מספר מתאים של תאים במדיום המבחן להניב ריכוז סופי של 100, 000 תאים לכל 100 microliters.הוסף 100 מיקרוליטרים של התאים המדוללים לכל באר של צלחת ההתבנות למעט בארות A1, B4, C3 ו- D6. ל בארות אלה, להוסיף רק 100 microliters של מדיום בדיקה לתיקון רקע. חגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני במשך 60 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק על פני השטח של הצלחת. הכינו את התרכובות לתפקוד המיטוכונדריאלי בריכוז של פי 10 במדיום ההתמדה המתאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.הוסף 50 מיקרוליטרים של SHAM ליציאה A, 50 מיקרוליטרים של אוליגומיצין ליציאה B, 62 מיקרוליטרים של אשלגן ציאניד ליציאה C, ו-68 מיקרוליטרים של אנטימיצין A ליציאה D.Next, הכינו את התרכובות למבחן הלחץ הגליקוליטי בריכוז של פי 10 במדיום המבחן המתאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. הוסף 50 מיקרוליטרים של גלוקוז ליציאה A, 55 מיקרוליטרים של אוליגומיצין ליציאה B, 62 מיקרוליטרים של 2-DG ליציאה C, ו-68 מיקרוליטרים של אנטימיצין A ליציאה D.Before ההתמדה, פתח את מנתח השטף הנוסף והגדר את תבנית ההתמדה באמצעות לשונית אשף ההתמדה. בצע את ההוראות שלב אחר שלב ומלא את כל המידע המוקפץ במהלך ההתקנה.צור פריסת קבוצה והגדר את הפרוטוקול כמפורט בפרוטוקול הטקסט. שמור פריסות אלה לפני ההתנגדות. בזמן ההתרקשה, שחזר את הפרוטוקול שנשמר על-ידי פתיחת הקובץ המתאים באפשרות הקובץ הפתוח בכרטיסיה אשף ההתנסויות.לאחר מכן לטעון את תרכובות 10X לתוך היציאות המתאימות של מחסנית חיישן hydrated המכיל את הכיול. טען את מחסנית החיישן למגש המוביל של מנתח השטף הנוסף. הפעל את הכיול על-ידי לחיצה על לחצן 'התחל' על המסך.לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 350 מיקרוליטרים של מדיום המבחן לצלחת התא לאורך צד הקירות כדי למזער את ההפרעה לתאים ולהביא את הנפח הסופי ל-450 מיקרוליטרים. החלף את לוחית השירות המכילה את הכיול בצלחת ההתנסויות והמשך בהסטה. לאחר השלמת הבדיקה, הסר את מחסנית החיישן ואת הצלחת.שמור את הקובץ בתיקיית היעד המתאימה. במחקר זה, הפונקציות הביו-אנרגטיות של האלביקנים C מוערכים על ידי מנתח שטף נוסף. מוטציה חסרה חלבון מיטוכונדריאלי mam33 נכלל גם יחד עם הזן המשלים שלה כדי לחקור את ההשפעות של מחיקת חלבון מיטוכונדריאלי על קצב צריכת החמצן ואת שיעורי חומציות חוץ תאית.סוג הבר C albicans מראה שיעור צריכת חמצן של 145 picomoles לדקה אשר נמצא גם בטווח האופטימלי עבור כל מראי שטף חוץ תאי. קצב צריכת החמצן הבסיסי של סוג הבר, מוטציה mam33 ו mam33 זנים משלימים להראות שום הבדלים. באופן דומה, לא נראים הבדלים משמעותיים בשיעורי החומציות החוץ-תאית הבסיסית בין הזנים.עם זאת, על ידי עיכוב קומפלקס-IV עם אשלגן ציאניד, סוג הבר מוטציה mam33, mam33 זנים משלימים להראות שינוי משמעותי לכיוון גליקוליזה. עם זאת, זן המוטנטים mam33 לא הצליח להראות שינוי גליקוליטי מפצה המצביע על כך שהתרכובת-IV תלויה במסלול לקוי בזן זה. במבחן הלחץ הגליקוליטי, התאים מורעבים מגלוקוז למשך שעה אחת וקצב צריכת החמצן הבסיסי וקצב החומציות החוץ-תאית נמדדים.לאחר רעב, זן המוטנטים mam33 מראה צריכת חמצן נמוכה משמעותית ו שיעורי חומציות חוץ תאית בהשוואה זנים אחרים. זה מרמז על ניצול לקוי של גלוקוז הן לנשימה והן לגליקוליזה כאשר תאים נאלצים למצב רעב. לאחר הזרקת גלוקוז, כל הזנים מראים גירוי של קצב צריכת החמצן שלהם ואת שיעור חומציות חוץ תאית.ציפוי צלחת ההתזה מאפשר לתאי קנדידה אלביקנים לדבוק בצלחת. דבקות לא נכונה של תאי קנדידה אלביקנים תשפיע על תוצאת ההתקנה. לאחר התפתחות טכניקה זו, היא הועסקה במגוון רחב של סוגי תאים ומחלות המתייחסות לאופן שבו המיטוכונדריה מתפקדת בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.לדוגמה, העסקת תאים שמקורם במטופל ובקרה בהסטה זו, ניתן לענות על השאלות הספציפיות של אופן השינוי בתפקוד המיטוכונדריאלי. יש לדאוג בעת הכנת מעכבי המיטוכונדריה כגון אשלגן ציאניד ו antimycin A כי תרכובות אלה הם רעילים מאוד.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

בזמן אמת fMRI ביופידבק מיקוד Cortex orbitofrontal עבור חרדה זיהום

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

תנועת סבה באמצעות משוב בזמן אמת של ביצועים

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

בעקבות כימותרפיה כלי דם רעילות - בזמן אמת<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של ירידת ערך כלי

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

בזמן אמת Cytotoxicity מבחני בדם כל אדם

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...