Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

नेकां प्रयोगशाला में अनुसंधान स्वास्थ्य के एक राष्ट्रीय संस्थान (NIH) अनुदान R01AI24499 और ंयू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन (NJHF) अनुदान, #PC40-18 द्वारा समर्थित है ।

नोट: विस्तृत परख के पदश: प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है, और योजनाबद्ध प्रोटोकॉल चित्रा 1में दिखाया गया है ।
1. एलबीवांस संवेदनहीन और विकास की स्थिति
<ol><li>तरल खमीर निकालने में सी. एल्बी...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

bioenergetics अतिरिक्त फ्लक्स परख एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में कार्य करता है के लिए बाहर oxidative फास्फोरिलेशन (OXPHOS)-वास्तविक समय में निर्भर ऑक्सीजन की खपत को मापने से mitochondrial समारोह पढ़ें । इसके अलावा, एक glycolytic समारोह है ?...

आक्रामक कवक संक्रमण १,५००,००० लोगों को एक साल दुनिया भर में मार डालो । यह संख्या वृद्धि पर समझौता प्रतिरक्षा के साथ रहने वाले लोगों की संख्या में वृद्धि के कारण है, बुजुर्गों सहित, समयपूर्व शिशुओं, प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं, और कैंसर के रोगियों1। C. albicans एक अवसरवादी मानव कवक रोगज़नक़ है कि मानव माइक्रोफ्लोरा का एक हिस्सा है । यह भी श्लेष्मिक सतहों और एक कोमेंसल जीव के रूप में जठरांत्र संबंधी मार्ग में जलधाराओं । C. एल्बीकांस उन लोगों में गंभीर प्रणालीगत बीमारी पैदा करता है, जिनके पास प्रतिरक्षा की कमी है, जो शल्य चिकित्सा करते हैं, या जो एंटीबायोटिक दवाओं के लंबे पाठ्यक्रमों के साथ इलाज किया गया है । कैंडिडा प्रजातियों मनुष्यों में nosocomial संक्रामक रोगों (एनआईडी) के शीर्ष तीन से चार कारणों में रैंक2,3,4,5,6,7. Candida खून संक्रमण की वार्षिक वैश्विक संख्या का अनुमान है ~ ४००,००० मामलों में, 46-75%1के एसोसिएटेड की शर्तों के साथ । कैंडिडिआसिस की वार्षिक मृत्यु दर लगभग १०,००० संयुक्त राज्य अमेरिका में अकेले है । कवक के कारण एनआईडी की मात्रा भी खगोलीय रोगी व्यय5में परिलक्षित होता है । संयुक्त राज्य अमेरिका में, आक्रामक कवक संक्रमण के उपचार के लिए वार्षिक खर्च $२,०००,०००,००० से बढ़कर, पहले से ही मुलभुत स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक बड़ा दबाव जोड़ने । वर्तमान में, उपलब्ध मानक ऐंटिफंगल चिकित्सा क्योंकि विषाक्तता के सीमित हैं, तेजी से प्रचलित दवा प्रतिरोध, और नशीली दवाओं बातचीत । इसलिए, वहां एक तत्काल नए ऐंटिफंगल दवा लक्ष्य है कि उच्च जोखिम वाले रोगियों के लिए बेहतर इलाज के विकल्प में परिणाम होगा की पहचान की जरूरत है । हालांकि, कवक लक्ष्य पर काम कर रहे नई दवाओं की खोज जटिल है क्योंकि कवक यूक्योट्स हैं । यह बहुत कवक विशेष दवा लक्ष्य की संख्या को सीमित करता है ।
हाल के अध्ययनों से संकेत मिला है कि mitochondria कवक और ऐंटिफंगल दवाओं के लिए सहिष्णुता के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है mitochondria सेलुलर श्वसन के लिए महत्वपूर्ण हैं, oxidative चयापचय, संकेत transduction, और apoptosis8 ,9,10,11. दोनों glycolytic और गैर glycolytic चयापचय स्तनधारी मेजबान12,13,14,15,16में सी. ऐल्बिकन्स के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, कई सी. ऐल्बिकन म्यूटेंट में माइटोकोड्रियल प्रोटीन की कमी होती है, जैसे कि Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 आदि को फाइलेमेंटेशन में दोषपूर्ण दर्शाया गया है, c. ऐल्बिकन17 का एक महत्वपूर्ण विलक्षणकारी कारक 18 , 19 , 20 , 21 , 22. इसके अलावा, इन म्यूटेंट भी फैलाया कैंडिडिआसिस17,18,19,20,21 के एक माउस मॉडल में विरूंस के लिए क्षीणता दिखाया गया ,22. इस प्रकार, कवक mitochondria दवा की खोज के लिए एक आकर्षक लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, सी. एल्बीकेंस में माइटोकोड्रियल फंक्शन का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि c. ऐल्बिकेंस पेटिट निगेटिव23है, जिसका मतलब है कि यह माइटोकोड्रियल जीनोम के बिना जीवित नहीं रह सकता ।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि माइटोकॉनड्रिया को शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना सी. एल्बिकन्स में mitochondrial और glycolytic समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन. इस विधि के आनुवंशिक हेरफेर या रासायनिक नियन्त्रक के प्रभाव की जांच करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है माइटोकॉड्रियल और C. albicansमें glycolytic रास्ते पर ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

Mitochondria सेलुलर चयापचय और अस्तित्व के लिए आवश्यक organelles हैं । प्रमुख घटनाओं की एक किस्म माइटोकॉन्ड्रिया में जगह ले, जैसे सेलुलर श्वसन, oxidative चयापचय, संकेत transduction, और apoptosis. फलस्वरूप, रोगजनक कवक के ऐंटिफंगल दवा सहिष्णुता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए mitochondrial शिथिलता की सूचना है । हाल के डेटा भी कवक रोगजनन के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता के रूप में mitochondria के महत्व की मांयता के लिए नेतृत्व किया है । कवक जीव विज्ञान में माइटोकोनड्रिया के महत्व के बावजूद, मानकीकृत तरीके से अपने कार्य को समझने के लिए खराब विकसित कर रहे हैं । यहां, हम एक प्रक्रिया के लिए बेसल ऑक्सीजन की खपत दर (OCR), माइटोकॉड्रियल श्वसन का एक उपाय है, और extracellular अडिफिकेशन दर (ECAR), सी. एल्बीकांस उपभेदों में glycolytic समारोह के एक उपाय का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं । यहां वर्णित विधि किसी भी Candidaspp. संवेदनहीन को बरकरार कवक कोशिकाओं से mitochondria शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी सी. एल्बिकन उपभेदों में mitochondrial समारोह के inhibitors के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल का ध्यान अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक द्वारा मूल्यांकन C. albicans के bioenergetic कार्यों का निर्धारण करने के लिए है । एक ग. ऐल्बिकेन्स उत्परिवर्ती का अभाव माइटोकोड्रियल प्रोटीन Mam33 भी ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

यहाँ, हम एक अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर candida एल्बिकैंस में mitochondrial श्वसन और glycolytic समारोह की जांच करने के लिए एक पदश: प्रोटोकॉल मौजूद.

Candida एल्बीकांस के जैव-ऊर्जा विज्ञान जांच वास्तविक समय Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

कैंडिडा एल्बिकान में ग्लाइकोलिटिक फंक्शन और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का निर्धारण करने के लिए यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह कैंडिडा एल्बिकान से माइटोकॉन्ड्रिया को शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापा जा सकता है। कैंडिडा एल्बिकान या अन्य फंगल रोगजनकों में माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलिटिक रास्तों पर आनुवंशिक हेरफेर या रासायनिक मॉड्यूलर के प्रभावों की जांच करने के लिए इस विधि को अनुकूलित किया जा सकता है।यह तकनीक अपेक्षाकृत सरल है। या जीव के आधार पर, उनका उपयोग कोशिका संख्या और उनकी परख में माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों की एकाग्रता को अनुकूलित करने में मदद कर सकता है। एक लैमिनार फ्लो हुड में, ऊतक ग्रिड पानी में पॉली-डी-लाइसिन को 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में भंग करें।समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं और इसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में डालें जिससे कम से कम 1.3 मिलीलीटर प्रति ट्यूब होना सुनिश्चित हो। परख प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, ढक्कन को कवर करें और कमरे के तापमान पर एक से दो घंटे तक इनक्यूबेट करें। फिर समाधान को एस्पिरेट करें।परख प्लेट के कुओं को एक बार बाँझ ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी के ५०० माइक्रोलीटर के साथ कुल्ला, ढक्कन खोलने के लिए और कुओं हवा सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं । यदि प्लेट का उपयोग उस दिन तैयार नहीं किया जाता है, तो इसे अधिकतम दो से तीन दिनों के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रयोग से एक दिन पहले, अतिरिक्त प्रवाह परख किट खोलें और सामग्री को हटा दें।सेंसर कारतूस को यूटिलिटी प्लेट के बगल में उल्टा रखें। कैलिब्रेंट के एक मिलीलीटर के साथ उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरें और फिर सेंसर कारतूस वापस रखें। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोफोरस वाले सेंसर कैलिब्रेंट में डूबे हुए हैं।रात भर एक गैर कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेंसर कारतूस इनक्यूबेट । परख से एक दिन पहले, YPD शोरबा में तैयार सी एल्बिकान टीका और २०० आरपीएम पर एक शेखर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ जाना । परख के दिन, परख माध्यम में कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या को पतला करने के लिए १००, 000 कोशिकाओं प्रति १०० माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता उपज ।कुओं A1, B4, C3, और D6 को छोड़कर परख प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला कोशिकाओं के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । इन कुओं में, पृष्ठभूमि सुधार के लिए परख माध्यम के केवल 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। 60 मिनट के लिए एक गैर कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट करने के लिए कोशिकाओं को थाली की सतह का पालन करते हैं। पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित इसी परख माध्यम में 10X एकाग्रता पर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन परख के लिए यौगिकों को तैयार करें।पोर्ट ए में शम के 50 माइक्रोलीटर, पोर्ट बी में ओलिगोमाइसिन के 50 माइक्रोलीटर, पोर्ट सी में पोटेशियम सायनाइड के 62 माइक्रोलीटर, और एंटीमाइसिन ए के 68 माइक्रोलीटर पोर्ट डी नेक्स्ट में जोड़ें, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित माध्यम में 10X एकाग्रता में ग्लाइकोलिटिक तनाव के लिए यौगिक तैयार करें। पोर्ट ए में ग्लूकोज के 50 माइक्रोलीटर, पोर्ट बी में ओलिगोमाइसिन के 55 माइक्रोलीटर, पोर्ट सी में 2-डीजी के 62 माइक्रोलीटर, और एंटीमाइसिन ए के 68 माइक्रोलीटर को परख से पहले पोर्ट डी में जोड़ें, अतिरिक्त फ्लक्स एनालाइजर खोलें और परख जादूगर टैब का उपयोग करके परख टेम्पलेट स्थापित करें। चरण-दर-कदम निर्देशों का पालन करें और सेटअप के दौरान पॉप आउट होने वाली सभी जानकारी भरें।एक समूह लेआउट उत्पन्न करें और टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रोटोकॉल स्थापित करें। परख से पहले इन लेआउट को सहेजें। परख के समय, परख जादूगर टैब में खुली फ़ाइल विकल्प में इसी फ़ाइल को खोलकर सहेजे गए प्रोटोकॉल को बहाल करें।फिर कैलिब्रेंट युक्त हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस के संबंधित बंदरगाहों में 10X यौगिकों लोड। अतिरिक्त प्रवाह विश्लेषक के वाहक ट्रे में सेंसर कारतूस लोड करें। स्क्रीन पर स्टार्ट बटन पर क्लिक करके अंशांकन शुरू करें।इसके बाद, धीरे-धीरे 450 माइक्रोलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने सेल अशांति को कम करने के लिए दीवारों के किनारे सेल प्लेट के लिए परख माध्यम के 350 माइक्रोलीटर जोड़ें। परख प्लेट के साथ अंशांकन युक्त उपयोगिता प्लेट को बदलें और परख जारी रखें। परख पूरी हो जाने के बाद सेंसर कारतूस और प्लेट निकाल लें।फाइल को उपयुक्त गंतव्य फ़ोल्डर में सहेजें। इस अध्ययन में सी एल्बिकान के बायो एनर्जेटिक कार्यों का आकलन एक्स्ट्रा फ्लक्स एनालाइजर से किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन mam33 की कमी वाले उत्परिवर्ती को ऑक्सीजन खपत दर और बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दरों पर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के विलोपन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इसके पूरक तनाव के साथ भी शामिल किया गया है।सी एल्बिकान जंगली प्रकार प्रति मिनट 145 पिकोमोल्स की ऑक्सीजन खपत दर दिखाता है जो किसी भी बाह्य प्रवाह परख के लिए इष्टतम सीमा के भीतर अच्छी तरह से है। जंगली प्रकार की बेसल ऑक्सीजन खपत दर, mam33 उत्परिवर्ती और mam33 पूरित उपभेदों कोई अंतर नहीं दिखा । इसी तरह, उपभेदों के बीच बेसल एक्स्ट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन दरों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा जाता है।हालांकि, पोटेशियम सायनाइड, जंगली प्रकार और mam33 उत्परिवर्ती के साथ जटिल-IV को बाधित करके, mam33 पूरित उपभेदों ग्लाइकोलिसिस की ओर एक महत्वपूर्ण बदलाव दिखाते हैं। Mam33 उत्परिवर्ती तनाव हालांकि एक प्रतिपूरक ग्लायोटिक बदलाव दिखाने में विफल रहा है सुझाव है कि यौगिक-चतुर्थ निर्भर मार्ग इस तनाव में बिगड़ा हुआ है । ग्लाइटोलिटिक स्ट्रेस टेस्ट में कोशिकाओं को ग्लूकोज से एक घंटे तक भूखा रखा जाता है और बेसल ऑक्सीजन खपत दर और एक्स्ट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन रेट को मापा जाता है।भुखमरी पर, mam33 उत्परिवर्ती तनाव अन्य उपभेदों की तुलना में काफी कम ऑक्सीजन की खपत और बाहेल अम्लीकरण दरों को दिखाता है। यह श्वसन और ग्लाइटोलिसिस दोनों के लिए ग्लूकोज के बिगड़ा उपयोग का सुझाव देता है जब कोशिकाओं को भुखमरी की स्थिति के लिए मजबूर किया जाता है। ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद, सभी उपभेदों उनके ऑक्सीजन की खपत दर और बाह्राश एसिडिफिकेशन दर दोनों की उत्तेजना दिखाते हैं ।परख प्लेट की कोटिंग कैंडिडा एल्बिकान कोशिकाओं को प्लेट का पालन करने की अनुमति देती है। कैंडिडा एल्बिकान कोशिकाओं का अनुचित पालन परख परिणाम को प्रभावित करेगा। इस तकनीक के विकास के बाद, इसे कोशिका प्रकारों और बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला में नियोजित किया गया है जो शारीरिक और रोग स्थितियों के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया कैसे कार्य करते हैं।उदाहरण के लिए, इस परख में रोगी-व्युत्पन्न और नियंत्रण कोशिकाओं को नियोजित करना, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को कैसे बदला जाता है, इसके विशिष्ट प्रश्नों का समाधान करना संभव है। पोटेशियम सायनाइड और एंटीमाइसिन ए जैसे माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों को तैयार करते समय देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि ये यौगिक बेहद जहरीले होते हैं।

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

रीयल टाइम में ट्यूमर में Nanoparticle तेज intravital इमेजिंग का प्रयोग का मूल्यांकन

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

वास्तविक समय fMRI Biofeedback संदूषण चिंता के लिए orbitofrontal प्रांतस्था का लक्ष्य निर्धारण

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA प्रोस्टेट ट्यूमर में मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) द्वारा जांच

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

आंदोलन प्रदर्शन का वास्तविक समय प्रतिक्रिया का उपयोग पुनर्प्रशिक्षण

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करने के लिए एक प्रतियोगी murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में दाता कोशिका engraftment निर्धारित

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग मस्तिष्कमेरु द्रव MicroRNA रूपरेखा

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

कीमोथेरेपी प्रेरित संवहनी विषाक्तता - वास्तविक समय<em&gt; Vivo</em&gt; पोत हानि की इमेजिंग

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

रीयल टाइम में mesothelial कोशिकाओं की डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल अनुलग्नक और आक्रमण का आकलन

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

मानव पूरे रक्त में वास्तविक समय cytotoxicity Assays

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...