Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Ricerca nel laboratorio di NC è sostenuta da una sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e una sovvenzione di New Jersey Health Foundation (NJHF), n #PC40-18.

Nota: Il protocollo dettagliato e graduale del dosaggio è descritto di seguito, e il protocollo schematico è illustrato nella Figura 1.
1. ceppi di c. albicans e le condizioni di crescita
<ol><li>Crescono i ceppi di c. albicans in terreno liquido di lievito estratto-Peptone-destrosio (YPD) a 30 °C in un agitatore incubatore durante la notte. Nota: Mantenere ceppi di Candida come gli stock congelati e crescono sull'agar Y...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

La bioenergetica analisi flusso supplementare serve come un ottimo strumento per leggere la funzione mitocondriale misurando la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)-consumo di ossigeno dipendenti in tempo reale. Inoltre, una funzione glicolitica che viene misurata come un tasso di acidificazione extracellulare (cambiamento del pH extracellulare) può anche essere studiata allo stesso tempo nell'analisi in tempo reale.
Placcatura successo di c. albicans nella piastra di dosaggio è uno d...

Infezioni fungine invasive uccidono oltre 1,5 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo. Questo numero è in aumento a causa di un aumento del numero di persone che vivono con immunità compromessa, inclusi i neonati prematuri, anziani, destinatari del trapianto e cancro pazienti1. C. albicans è un patogeno opportunista di fungo umano che fa parte della microflora umana. Abita anche le superfici mucose e il tratto gastrointestinale come un organismo commensale. C. albicans produce malattia sistemica grave in persone che hanno deficit immunitari, che hanno subito la chirurgia, o che sono state trattate con lunghi cicli di antibiotici. Il rango di specie di Candida tra le tre cause principali di malattie infettive nosocomiali (NID) in esseri umani2,3,4,5,6,7. Il numero globale annuale delle infezioni da Candida flusso sanguigno è stimata intorno a ~ 400.000 casi, con mortalità associata di 46-75%1. La mortalità annua a causa della candidosi è all'incirca 10.000 negli Stati Uniti da solo. Nella misura del NID causate da funghi si riflette anche nella astronomico spese paziente5. Negli Stati Uniti, la spesa annua per il trattamento di infezioni fungine invasive supera $ 2 miliardi, l'aggiunta di uno sforzo enorme per sistema sanitario già oberati di lavoro. Attualmente, le terapie antifungine standard disponibili sono limitate a causa di tossicità, sempre più diffuso di farmacoresistenza e interazioni farmaco-farmaco. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di identificare nuovi bersagli di farmaco antifungino che si tradurrà in migliori opzioni di trattamento per pazienti ad alto rischio. Tuttavia, la scoperta di nuovi farmaci che agiscono su bersagli fungine è complicata perché i funghi sono eucarioti. Questo limita notevolmente il numero di bersagli farmacologici specifici fungine.
Recenti studi hanno indicato che i mitocondri sono un contributo critico alla virulenza fungina e la tolleranza alle droghe antifungose poiché i mitocondri sono importanti per la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi8 ,9,10,11. Metabolismo glicolitico sia non-glicolitico sono essenziali per la sopravvivenza dei albicans del c. nel mammifero ospite12,13,14,15,16. Inoltre, diversi mutanti di c. albicans carente di proteine mitocondriali, come Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 ecc. sono stati indicati per essere difettoso in filamentazione, un fattore di virulenza importante di albicans del c.17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Inoltre, questi mutanti inoltre sono stati indicati per essere attenuato per virulenza in un modello murino di diffusi candidosi17,18,19,20,21 ,22. Così, i mitocondri fungini rappresentano un obiettivo attraente per la scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, lo studio della funzione mitocondriale in c. albicans è impegnativo, perché c. albicans è petite negativo23, che significa che essa non può sopravvivere senza il genoma mitocondriale.
Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per studiare la funzione mitocondriale e glicolitica a albicans del c. senza la necessità di purificare i mitocondri. Questo metodo può anche essere ottimizzato per studiare l'effetto della manipolazione genetica o modulatori chimici sulle vie mitocondriale e glicolitiche in c. albicans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

I mitocondri sono organelli essenziali per il metabolismo cellulare e la sopravvivenza. Una varietà di eventi chiave si svolgono nei mitocondri, come la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale è segnalata per svolgere un ruolo importante nella tolleranza al farmaco antifungino e virulenza dei patogeni fungini. Dati recenti hanno anche portato al riconoscimento dell'importanza dei mitocondri come un importante contributo alla patogenesi fungine. Nonostante l'importanza dei mitocondri in biologia fungina, sono scarsamente sviluppati metodi standardizzati per capire la sua funzione. Qui, presentiamo una procedura per studiare il tasso di consumo di ossigeno basale (OCR), una misura della respirazione mitocondriale e tassi di acidificazione extracellulare (ECAR), una misura della funzione glicolitica in ceppi di c. albicans . Il metodo descritto qui può essere applicato per eventuali ceppi Candidaspp. senza la necessità di purificare i mitocondri da cellule fungine intatte. Inoltre, questo protocollo può anche essere personalizzato alla schermata per inibitori della funzione mitocondriale in ceppi di c. albicans .

Il fuoco di questo protocollo è quello di determinare le funzioni bioenergetiche di albicans del c. valutata dall'analizzatore di flusso supplementare. Un mutante di albicans del c. che mancano della proteina mitocondriale Mam33 inoltre è incluso insieme al relativo sforzo di complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 per studiare gli effetti dell'eliminazione di una proteina mitocondriale su OCR ed ECAR. MAM33 codifica per una proteina di matrice silicea mitocon...

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Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Qui, presentiamo un protocollo graduale per studiare la respirazione mitocondriale e la funzione glicolitica in Candida Albicans utilizzando un analizzatore di flusso supplementare.

Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Questo protocollo è significativo per determinare la funzione glicolitica e la respirazione mitocondriale in Candida albicans. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di misurare la funzione mitocondriale senza la necessità di purificare i mitocondri dagli albicani di Candida. Questo metodo può essere ottimizzato per indagare gli effetti della manipolazione genetica o dei modulatori chimici sulle vie mitocondriali e glicolitiche negli albicani Candida o in altri agenti patogeni fungini.Questa tecnica è relativamente semplice. O a seconda dell'organismo, il loro uso può aiutare a ottimizzare il numero di cellule e la concentrazione di inibitori mitocondriali nel loro saggio. In una cappa di flusso laminare, sciogliere la poli-D-lisina nell'acqua della griglia tissutale fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.Mescolare bene la soluzione e aliquotarla in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri assicurandosi di aliquota di almeno 1,3 millilitri per tubo. Aggiungere 50 microlitri di questa miscela a ciascun pozzo della piastra di dosaggio, coprire il coperchio e incubare a temperatura ambiente per una o due ore. Quindi aspirare la soluzione.Risciacquare i pozzi della piastra di dosaggio una volta con 500 microlitri di acqua sterile di coltura tissutale, aprire il coperchio e lasciare asciugare all'aria i pozzi. Se non si utilizza il piatto il giorno in cui viene preparato, conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di due o tre giorni. Il giorno prima dell'esperimento, aprire il kit di dosaggio del flusso extra e rimuovere il contenuto.Posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di utilità. Riempire ogni pozzo della piastra di utilità con un millilitro di calibrant e quindi riposizionare la cartuccia del sensore. Assicurarsi che i sensori che contengono fluorofori siano immersi nel calibante.Incubare la cartuccia del sensore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica durante la notte. Il giorno prima del saggio, inoculare gli albicani C preparati nel brodo YPD e crescere durante la notte a 30 gradi Celsius in uno shaker a 200 giri/min. Il giorno del saggio, diluire un numero appropriato di cellule nel mezzo di dosaggio per produrre una concentrazione finale di 100.000 cellule per 100 microlitri.Aggiungere 100 microlitri delle cellule diluite in ogni pozzo della piastra di dosaggio ad eccezione dei pozzi A1, B4, C3 e D6. A questi pozzi, aggiungere solo 100 microlitri di mezzo di dosaggio per la correzione dello sfondo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per 60 minuti per lasciare che le cellule aderiscano alla superficie della piastra. Preparare i composti per il saggio della funzione mitocondriale a concentrazione 10X nel mezzo di dosaggio corrispondente come delineato nel protocollo di testo.Aggiungere 50 microlitri di SHAM nella porta A, 50 microlitri di Oligomicina nella porta B, 62 microlitri di cianuro di potassio nella porta C e 68 microlitri di antimicina A nella porta D.Successivamente, preparare i composti per il saggio di stress glicolitico a concentrazione 10X nel mezzo di dosaggio corrispondente come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere 50 microlitri di glucosio alla porta A, 55 microlitri di Oligomicina nella porta B, 62 microlitri di 2-DG nella porta C e 68 microlitri di Antimicina A nella porta D.Prima del test, aprire l'analizzatore di flusso aggiuntivo e impostare il modello di saggio utilizzando la scheda della procedura guidata di dosaggio. Seguire le istruzioni dettagliate e compilare tutte le informazioni visualizzate durante l'installazione.Generare un layout di gruppo e impostare il protocollo come descritto nel protocollo di testo. Salvare questi layout prima del test. Al momento del test, ripristinare il protocollo salvato aprendo il file corrispondente nell'opzione open file nella scheda creazione guidata test.Quindi caricare i composti 10X nelle rispettive porte della cartuccia del sensore idratata contenente il calibrant. Caricare la cartuccia del sensore nel vassoio portante dell'analizzatore di flusso aggiuntivo. Avviare la calibrazione facendo clic sul pulsante start sullo schermo.Successivamente, aggiungere delicatamente 350 microlitri del mezzo di dosaggio alla piastra cellulare lungo il lato delle pareti per ridurre al minimo il disturbo cellulare portando il volume finale a 450 microlitri. Sostituire la piastra di utilità contenente il calibrant con la piastra di dosaggio e continuare il saggio. Una volta completato il test, rimuovere la cartuccia del sensore e la piastra.Salvare il file nella cartella di destinazione appropriata. In questo studio, le funzioni bio-energetiche degli albicani C sono valutate dall'analizzatore di flusso extra. Un mutante privo della proteina mitocondriale mam33 è anche incluso insieme al suo ceppo complementare per studiare gli effetti della cancellazione di una proteina mitocondriale sul tasso di consumo di ossigeno e sui tassi di acidificazione extracellulare.Il tipo selvatico C albicans mostra un tasso di consumo di ossigeno di 145 picomoli al minuto che è ben all'interno dell'intervallo ottimale per qualsiasi saggio di flusso extracellulare. Il tasso di consumo basale di ossigeno del tipo selvatico, i ceppi mutanti mam33 e mam33 non mostrano differenze. Allo stesso modo, non si vedono differenze significative nei tassi di acidificazione extracellulare basale tra i ceppi.Tuttavia, inibendo il complesso IV con cianuro di potassio, il tipo selvatico e il mutante mam33, i ceppi integrati mam33 mostrano uno spostamento significativo verso la glicolisi. Il ceppo mutante mam33 tuttavia non ha mostrato uno spostamento glicolitico compensativo che suggerisse che la via dipendente dal composto IV è compromessa in questo ceppo. Nella prova di stress glicolitico, le cellule sono affamate di glucosio per un'ora e viene misurato il tasso di consumo basale di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare.Dopo la fame, il ceppo mutante mam33 mostra un consumo significativamente inferiore di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare rispetto agli altri ceppi. Ciò suggerisce un uso alterato del glucosio sia per la respirazione che per la glicolisi quando le cellule sono costrette alla condizione di fame. Dopo aver iniettato glucosio, tutti i ceppi mostrano stimolazione sia del loro tasso di consumo di ossigeno che del tasso di acidificazione extracellulare.Il rivestimento della piastra di dosaggio consente alle cellule di Candida albicans di aderire alla piastra. L'aderenza impropria delle cellule di Candida albicans influenzerà il risultato del test. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, è stato impiegato in una vasta gamma di tipi cellulari e malattie affrontando come funzionano i mitocondri durante le condizioni fisiologiche e patologiche.Ad esempio, impiegando cellule derivate dal paziente e di controllo in questo saggio, è possibile affrontare le domande specifiche su come la funzione mitocondriale viene alterata. Prestare attenzione durante la preparazione di inibitori mitocondriali come cianuro di potassio e antimicina A perché questi composti sono estremamente velenosi.

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