Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

NC ラボで研究をサポートするには、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 R01AI24499 とニュージャージー州健康財団 (NJHF) の助成金、#PC40 18。

注: は、アッセイの詳細な段階的なプロトコルには、以下、スケマティック プロトコルは図 1に示します。
1 C. albicans菌株と成長条件。
<ol><li>一晩 30 °C インキュベーター シェーカーで液体酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) 媒体のc. アルビカンス菌を育てます。 注: 凍結する在庫としてカンジダ菌を維持し、YPD 寒天 (...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

生体エネルギー酸化的リン酸化 (OXPHOS) を測定することによってミトコンドリアの機能を読み出すための優れたツールとして余分なフラックスの試金-リアルタイム依存酸素消費量。また、リアルタイム解析で同時に細胞の酸性化率 (細胞外 pH の変更) として測定される解糖系関数を調べることがもできます。
アッセイ プレートでC. albicansの成功したメッキは、ため?...

侵襲性真菌感染症は、世界中で毎年以上 150 万人を殺します。この番号は、侵害された免疫は、高齢者、未熟児、移植、癌患者1などとともに生きる人々 の数の増加による上昇には。C. アルビカンスは人間の細菌叢の一部である日和見人間真菌の菌です。また、粘膜の表面や消化管が共生生物として生息します。C. アルビカンスは、免疫不全症、手術を受けている人や長期の抗生物質のコースと扱われている人を持っている人に深刻な全身疾患を生成します。院内感染症 (NID) 人間2,3,4,5,6、7のトップ 3 〜 4 原因のうちカンジダ種のランク。カンジダ血流感染症の年間の世界的な数は、~ 400,000 症例 46 751の関連付けられている死亡すると推定されます。カンジダ症のための年間死亡率はほぼ単独で米国で 10,000 です。菌類が原因で NID の程度も、天文学的な患者費用5に反映されます。アメリカ合衆国では、侵襲性真菌感染症の治療のための年次費用は $ 20 億、すでに負担医療システムに大きな負担を追加するを上回っています。現在、利用可能な標準的抗真菌治療は毒性、ますます普及している薬剤耐性、および薬物-薬物相互作用により制限されています。したがって、ハイリスク患者に対するより良い治療の選択肢になります新しい抗真菌薬のターゲットを識別するために緊急の必要性があります。しかし、菌は真核生物であるために、真菌ターゲットに作用する新薬の発見は複雑です。これは大きく真菌特定薬剤ターゲットの数を制限します。
最近の研究は、ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシス8 の重要なので、ミトコンドリアが耐性抗真菌薬と真菌の病原性に重要な貢献こと示されています。 ,9,10,11。解糖系と非解糖系代謝は、哺乳類のホスト12,13,14,,1516 C. albicansの生存に不可欠です。さらに、Goa1 などのミトコンドリア蛋白質に欠けているいくつかのc. アルビカンス変異 Srr1 Gem1 Sam37 等が示されている粘い、 C. albicans17,の重要な病原因子の欠陥18,19,20,21,22しますさらに、これらの変異体も示したマウス モデルにおける病原性播種性カンジダ症17,18,19,20,21 の減衰させる。 ,22。つまり、菌のミトコンドリアは、創薬のための魅力的なターゲットを表します。ただし、 C. albicansは小柄な負23、それがミトコンドリアのゲノムことがなく生き残ることはできませんを意味するためにC. albicansのミトコンドリア機能に関する研究が困難します。
ここでは、ミトコンドリアを浄化するために必要とせずC. albicansのミトコンドリアと解糖系の機能を調査するために使用することができますプロトコルについて述べる。このメソッドは、 C. albicansのミトコンドリアと解糖系の経路の遺伝的操作や化学物質の変調器の効果を調べるためも最適化することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

ミトコンドリアは、細胞の代謝と生存の重要な細胞内小器官です。ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシスなどのさまざまな主要なイベントが起こる。その結果、ミトコンドリア機能障害とされる抗真菌薬耐性と病原菌の病原性に重要な役割を果たします。最近のデータは真菌の病原性に重要な貢献としてミトコンドリアの重要性の認識にもつながっています。真菌の生物学におけるミトコンドリアの重要性にもかかわらずその機能を理解する標準化された方法の発達は悪い。基底酸素消費量 (OCR) ミトコンドリア呼吸の測定と細胞の酸性化率 (ecar と)、 C. albicans系統における解糖系機能の測定を研究するための手順を紹介します。記載方法は、そのまま真菌細胞からミトコンドリアを浄化することがなく任意のサーベイランス。系統に適用できます。さらに、このプロトコルをカスタマイズすることができますc. アルビカンス菌のミトコンドリア機能阻害剤の画面に。

このプロトコルの焦点c. アルビカンス余分なフラックス アナライザーによって評価の生物エネルギー関数を決定することです。ミトコンドリア蛋白質 Mam33 に欠けているC. albicansの変異体は、その補数のひずみ、 mam33Δ/Δ::MAM33 OCR と ecar とミトコンドリア蛋白質の削除の影響を研究すると共に含まれています。推定酸性ミトコンドリア蛋白質のMAM...

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Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

ここでは、余分なフラックス アナライザーを使用してミトコンドリア呼吸とカンジダで解糖系の機能を調査するための段階的なプロトコルを提示します。

カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

このプロトコルは、カンジダ・アルビカンスにおける解糖機能およびミトコンドリア呼吸を決定する上で重要である。この技術の主な利点は、それがカンジダアルビカンからミトコンドリアを浄化する必要なしにミトコンドリア機能を測定することを可能にすることです.この方法は、カンジダアルビカンスまたは他の真菌病原体におけるミトコンドリアおよび解糖経路に対する遺伝子操作または化学変調剤の影響を調べるように最適化することができる。この手法は比較的簡単です。または、生物に応じて、その使用は、細胞数およびそれらのアッセイ中のミトコンドリア阻害剤の濃度を最適化するのに役立つ可能性があります。層流フードで、ポリD-リジンを組織グリッド水に溶解し、1ミリリットル当たり50マイクログラムの最終濃度にします。溶液をよく混ぜて1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにアリコートし、チューブあたり少なくとも1.3ミリリットルをアリクォートします。アッセイプレートの各ウェルにこの混合物の50マイクロリットルを追加し、蓋をカバーし、1〜2時間室温でインキュベートします。その後、溶液を吸引します。500マイクロリットルの無菌組織培養グレードの水でアッセイプレートのウェルを一度すすい、蓋を開けて井戸を空気乾燥させます。準備した日にプレートを使用しない場合は、最大2〜3日間摂氏4度で保管してください。実験の前日に、余分なフラックスアッセイキットを開き、内容物を取り除きます。ユーティリティプレートの横にセンサーカートリッジを上下逆さまに置きます。ユーティリティプレートの各ウェルに1ミリリットルの校正剤を充填し、センサーカートリッジを元に戻します。蛍光体を含むセンサーがキャリバーに沈んでいるか確認してください。一晩、非二酸化炭素インキュベーターで37°Cでセンサーカートリッジをインキュベートします。アッセイの前日、YPDスープで調製したCアルビカンを接種し、200rpmのシェーカーで摂氏30度で一晩成長させる。アッセイの日に、アッセイ培地中の適切な数の細胞を希釈し、100マイクロリットル当たり100,000個の細胞の最終濃度を得る。希釈した細胞の100マイクロリットルを、ウェルA1、B4、C3、およびD6を除くアッセイプレートの各ウェルに加えます。これらの井戸には、バックグラウンド補正用のアッセイ媒体を100マイクロリットルだけ添加します。非二酸化炭素インキュベーターで37°Cでプレートを60分間インキュベートし、細胞をプレート表面に付着させます。テキストプロトコルに概説されているように、対応するアッセイ媒体中の10倍濃度でミトコンドリア関数アッセイ用の化合物を調製する。ポートAに50マイクロリットルのSHAM、ポートBにオリゴマイシンの50マイクロリットル、ポートCにシアン化カリウム62マイクロリットル、およびアンティマイシンAの68マイクロリットルをポートD.Nextに加え、テキストプロトコルで概説されているように、対応するアッセイ培地で10X濃度で解糖分解性ストレスアッセイの化合物を調製します。ポートAに50マイクロリットルのグルコース、ポートBにオリゴマイシンの55マイクロリットル、ポートCに2-DGの62マイクロリットル、および68マイクロリットルのAntimycin AをポートD.アッセイの前に、追加のフラックス分析装置を開き、アッセイウィザードタブを使用してアッセイテンプレートを設定します。手順に従って、セットアップ中にポップアウトしたすべての情報を入力します。グループレイアウトを生成し、テキストプロトコルで概説されているようにプロトコルを設定します。アッセイの前にこれらのレイアウトを保存します。アッセイ時に、アッセイウィザードタブのオープンファイルオプションで対応するファイルを開いて、保存されたプロトコルを復元します。次に、10X化合物を、キャリブラントを含む水和センサーカートリッジのそれぞれのポートに積み込みます。センサーカートリッジを追加フラックスアナライザのキャリアトレイに取り付けます。画面の開始ボタンをクリックして、調整を開始します。次に、壁の側面に沿ってセルプレートにアッセイ媒体の350マイクロリットルを静かに加え、最終的な体積を450マイクロリットルにする細胞の乱れを最小限に抑えます。キャリブラントを含むユーティリティプレートをアッセイプレートに交換し、アッセイを続けます。アッセイが完了したら、センサーカートリッジとプレートを取り外します。ファイルを適切な保存先フォルダに保存します。本研究では、Cアルビカンの生体エネルギー機能を、余計なフラックス分析装置によって評価する。ミトコンドリアタンパク質mam33を欠く変異体も、その補体株と共に含まれており、ミトコンドリアタンパク質の欠失が酸素消費率および細胞外酸性化速度に及ぼす影響を研究する。Cアルビカンス野生型は、細胞外フラックスアッセイに最適な範囲内にある1分間あたり145ピコモールの酸素消費率を示しています。野生型の基底酸素消費率は、mam33変異体およびmam33相補菌株は違いを示さない。同様に、株間の基底細胞外酸性化率には有意な差は見られない。しかしながら、シアン化カリウムを用いた複合体-IVを阻害することにより、野生型およびmam33変異体を、mam33相補菌株は、解糖に向かって有意なシフトを示す。mam33変異株は、しかし、化合物-IV依存経路がこの株で損なわれることを示唆する代償解糖シフトを示すことができなかった。解糖解析試験では、細胞は1時間のグルコースを使い果たし、基底酸素消費率と細胞外酸性化率を測定します。飢餓時に、mam33変異株は、他の株と比較して酸素消費量および細胞外酸性化率を有意に低く示す。これは、細胞が飢餓状態に強制されるとき、呼吸と解糖の両方のためのグルコースの利用障害を示唆しています。グルコースを注入した後、すべての株は、それらの酸素消費率と細胞外酸性化率の両方の刺激を示す。アッセイプレートのコーティングにより、カンディダ・アルビカンス細胞がプレートに付着します。カンディダ・アルビカンス細胞の不適切な付着は、アッセイ結果に影響を与える。この技術の開発後、生理学的および病理学的状態の間にミトコンドリアがどのように機能するかを扱う幅広い細胞型および疾患に採用されている。例えば、このアッセイにおいて患者由来および対照細胞を採用し、ミトコンドリア機能がどのように変化するのかの具体的な問題に対処することができる。これらの化合物は非常に有毒であるため、シアン化カリウムや抗ミシンAなどのミトコンドリア阻害剤を調製しながら注意する必要があります。

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

汚染の不安のために眼窩前頭皮質をターゲットに、リアルタイムfMRIのバイオフィードバック

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

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定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

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Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

パフォーマンスのリアルタイムのフィードバックを使用して再教育運動

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

化学療法誘発性血管毒性 - リアルタイム<em&gt;インビボ</em船舶減損の&gt;イメージング

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査

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