Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
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NC 랩에서 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 R01AI24499와 뉴저지 건강 재단 (NJHF) 부여, #PC40-18에 의해 지원 됩니다.

참고: 분석 결과의 상세한 stepwise 프로토콜은 아래, 설명 하 고 도식 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다.
1. C. albicans 긴장 및 성장 조건
<ol><li>C. albicans 긴장 성장 30 °C에서 인큐베이터 쉐이 커에 액체 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 매체에서 하룻밤. 참고: 냉동된 주식으로 칸디 다 긴장을 유지 하 고 YPD agar (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2%...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

생체 외 유출 분석 결과 산화 인 산화 (OXPHOS)를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 읽을 수 있는 훌륭한 도구 역할-실시간으로 종속 산소 소비. 또한, extracellular 산성화 속도 (extracellular pH 변화)로 측정 한 glycolytic 기능 또한 실시간 분석에 동시에 조사 수 있습니다.
PDL 코팅 접시에 셀의 인큐베이션 허용 시험 접시에 셀 시험 접시에 C. albicans 의 성공적인 도금 분석 결과에...

침입 균 감염 전세계 1 년 이상의 1.5 백만 명 죽 일. 이 번호는 손상 된 면역, 암 환자1, 이식 받는 사람, 노인, 조기 유아를 포함 하 여 생활 하는 사람들의 숫자에 증가 때문에. C. albicans 는 기회주의적 인간의 곰 팡이 병원 체 인간 microflora의 일부입니다. 그것은 또한 공생 생물으로 점 막 표면 및 위장에 서식. C. albicans 심각한 조직 질병 면역 결핍증, 누가 수술을 받은 또는 누가 항생제의 긴 과정을 함께 취급 하 고 있는 사람들을 생성 합니다. 병원내 감염 증 (NID) 인간2,3,4,5,,67의 상위 3 ~ 4 원인 중 칸디 다 종 차수입니다. 칸디 다 혈 류 량 감염의 연례 글로벌 수 ~ 400000 경우, 46-751의 연결된 mortalities로 추정 된다. 칸디 다 증 때문에 연간 사망률 약 미국 에서만 10, 000입니다. 곰 팡이로 인 한 NID의 범위는 천문 환자 비용5에 반영 됩니다. 미국에서는, 침입 균 감염의 치료에 대 한 연간 비용 $2 십억, 이미 overburdened 의료 시스템을 거 대 한 긴장을 추가 능가 한다. 현재, 사용할 수 있는 표준 항진균 치료 독성, 점점 널리 약물 저항, 및 약물-약물 상호 작용으로 인해 제한 됩니다. 따라서, 고 위험 환자에 대 한 더 나은 치료 옵션 귀 착될 것 이다 새로운 항진균 약물 목표를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다. 그러나, 곰 팡이 목표에 행동 하는 새로운 약물의 발견은 곰 팡이 진핵생물 복잡 합니다. 이 크게 특정 곰 팡이 약물 목표의 수를 제한합니다.
최근 연구는 미토 콘 드리 아는 곰 팡이 독성에 중요 한 기여자 및 항진균 약물에 내성 때문에 미토 콘 드리 아는 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환 및 apoptosis8에 대 한 중요 한 표시 ,9,,1011. Glycolytic 및 비 glycolytic 대사는 포유류 호스트12,,1314,,1516 C. albicans 의 생존을 위해 필수적입니다. 또한, Goa1, 같은 미토 콘 드리 아 단백질 부족 여러 C. albicans 돌연변이 Srr1, Gem1, Sam37 등 표시 되었습니다 filamentation, C. albicans17, 의 중요 한 독성 요소에에서 결함이 있는 것을 18 , 19 , 20 , 21 , 22. 또한, 이러한 돌연변이 또한 독성의 마우스 모델에서 칸디 다17,,1819,20,21 전파에 대 한 감쇠를 표시 했다 ,22. 따라서, 곰 팡이 미토 콘 드리 아 약물 발견에 대 한 매력적인 대상을 나타냅니다. 그러나, C. albicans 에 미토 콘 드리 아 기능 연구는 C. albicans 는 몸집이 작은 부정적인23, 미토 콘 드리 아 게놈 없이 살아남을 수 없다 의미 때문에 도전적 이다.
여기, 우리는 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 C. albicans 에 glycolytic 미토 콘 드리 아 기능을 조사 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 또한 C. albicans에 미토 콘 드리 아와 glycolytic 경로에 유전자 조작 이나 화학 변조기의 효과 조사 하기 위해 최적화할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

미토 콘 드리 아 세포 물질 대사 및 생존을 위한 필수적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아, 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환, apoptosis 등 다양 한 주요 행사 개최. 따라서, 미토 콘 드 리아 기능 장애는 항진균 약물 내성 및 병원 성 곰 팡이의 독성에 중요 한 역할을 보고 됩니다. 최근 데이터는 또한 곰 팡이 병의 중요 한 기여자는 미토 콘 드리 아의 중요성의 인식을 이끌어 냈다. 곰 팡이 생물학에서 미토 콘 드리 아의 중요성에도 불구 하 고 표준화 된 방법의 기능을 이해 하는 가난 하 게 개발 되었다. 여기, 기저 산소 소비 속도 (OCR), 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 및 extracellular 산성화 요금 (ECAR), C. albicans 긴장 glycolytic 기능 측정 연구 절차 선물이. 여기 설명 하는 방법은 그대로 곰 팡이 세포에서 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 긴장 Candidaspp. 어떤에 적용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 또한 사용자 정의할 수 있습니다 C. albicans 긴장에 미토 콘 드리 아 기능 억제제에 대 한 화면으로.

이 프로토콜의 추가 유출 분석기에 의해 평가 되는 C. albicans 의 bioenergetic 기능을 결정 하는. C. albicans 돌연변이 미토 콘 드리 아 단백질 Mam33 부족의 보완 스트레인, OCR 및 ECAR 미토 콘 드리 아 단백질의 삭제의 효과 공부 mam33Δ/Δ::MAM33 함께 포함 되어 있습니다. MAM33 상 상속 미토 콘 드 리아 산 성 매트릭스 단백질 인코딩하고 칸디 다 에 그것...

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Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

여기, 선물이 미토 콘 드리 아 호흡 및 Candida Albicans 에 glycolytic 기능 조사 stepwise 프로토콜 추가 유출 분석기를 사용 하 여.

칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스의 글리코리악 기능 및 미토콘드리아 호흡을 결정하기 위해 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 칸디다 알비칸에서 미토콘드리아를 정화할 필요 없이 미토콘드리아 기능을 측정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 칸디다 알비칸스 또는 기타 곰팡이 병원균의 미토콘드리아 및 글리코리컬 경로에 대한 유전 조작 또는 화학 변조기의 영향을 조사하기 위해 최적화 될 수 있습니다.이 기술은 비교적 간단합니다. 또는 유기체에 따라, 그들의 사용은 세포 수 와 그들의 분석에서 미토콘드리아 억제제의 농도를 최적화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 라미나르 플로우 후드에서 티슈 그리드 워터에 폴리-D-리신을 용해하여 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도를 유지합니다.용액을 잘 섞고 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에 알리쿼트하여 튜브 당 적어도 1.3 밀리리터를 알리쿼트하십시오. 이 혼합물의 50 마이크로리터를 분석 판의 각 웰에 넣고 뚜껑을 덮고 실온에서 1~2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 솔루션을 흡인합니다.멸균 조직 배양 등급의 물 500 마이크로 리터와 한 번 분석 플레이트의 우물을 헹구고 뚜껑을 열고 우물이 공기 건조할 수 있도록 합니다. 준비된 날에 접시를 사용하지 않을 경우 최대 2~3일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오. 실험 전날, 여분의 플럭스 분석 키트를 열고 내용을 제거합니다.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 유틸리티 플레이트의 각 웰을 1밀리리터의 교정으로 채운 다음 센서 카트리지를 다시 배치합니다. 형광이 포함된 센서가 교정판에 침수되어 있는지 확인합니다.밤새 이산화탄소 가 아닌 인큐베이터에서 센서 카트리지를 섭씨 37도에서 배양합니다. 분석 전날, YPD 국물에 준비 된 C 알비칸을 접종하고 200 rpm에서 셰이커에서 섭씨 30도에서 하룻밤 사이에 자랍니다. 분석 당일, 분석 배지에 적절한 수의 세포를 희석하여 100 마이크로리터 당 100, 000 세포의 최종 농도를 산출한다.우물 A1, B4, C3 및 D6을 제외한 분석 플레이트의 각 웰에 희석 된 세포의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 이러한 우물에 배경 보정을 위해 분석 매체의 마이크로리터 100개만 추가합니다. 비 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 플레이트를 60분 간 배양하여 세포가 플레이트 표면에 부착하도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 해당 분석 매체에서 10배 농도에서 미토콘드리아 기능 분석에 대한 화합물을 준비한다.포트 A에 SHAM 50 마이크로리터, 포트 B에 올리고마이신 50 마이크로리터, 항C에 시안화 칼륨 62 마이크로리터, 항마이신 A의 68 마이크로리터를 포트 D.Next에 추가하여, 해당 의정서에 명시된 바와 같이 10배 농도의 글리코리스틱 응력 분석체에 대한 화합물을 준비한다. 항만 B에 50 마이크로리터, 포트 B에 올리고마이신 55마이크로리터, 항만 C에 2-DG의 62 마이크로리터, 항제 A의 68 마이크로리터를 포트 D.assay 전에 추가 플럭스 분석기를 열고 분석 마법사 태브를 사용하여 분석 템플릿을 설정합니다. 단계별 지침을 따르고 설정 중에 나오는 모든 정보를 작성합니다.그룹 레이아웃을 생성하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로토콜을 설정합니다. 분석 전에 이러한 레이아웃을 저장합니다. 분석 시 분석 마법사 탭에서 열린 파일 옵션에서 해당 파일을 열어 저장된 프로토콜을 복원합니다.그런 다음 교정판을 포함하는 수화 센서 카트리지의 각 포트에 10X 화합물을 로드합니다. 센서 카트리지를 추가 플럭스 분석기의 캐리어 트레이에 로드합니다. 화면의 시작 버튼을 클릭하여 교정을 시작합니다.다음으로, 350마이크로리터를 벽면에 세포판에 부드럽게 추가하여 450마이크로리터에 최종 부피를 가져오는 세포 방해를 최소화한다. 교정판을 포함하는 유틸리티 플레이트를 분석 판으로 교체하고 분석을 계속합니다. 분석이 완료되면 센서 카트리지와 플레이트를 제거합니다.파일을 적절한 대상 폴더에 저장합니다. 이 연구에서는 C 알비칸의 생체 에너지 기능이 추가 플럭스 분석기로 평가됩니다. 미토콘드리아 단백질 mam33이 부족한 돌연변이는 또한 산소 소비율 및 세포외 산성화율에 미토콘드리아 단백질의 삭제효과를 연구하기 위한 보완균질과 함께 포함되어 있습니다.C 알비칸 야생 유형은 분당 145피코몰의 산소 소비율을 나타내며, 이는 세포외 플럭스 분석에 대한 최적의 범위 내에 있습니다. 야생형, 맘33 돌연변이 및 맘33의 기저 산소 소비율은 균주를 보완하여 차이가 없다. 유사 하 게, 유의 한 차이 균주 사이 기저 세포 외 산성화 속도에서 볼 수 없습니다.그러나, 시안화칼륨, 야생형 및 맘33 돌연변이를 함유한 복합IV를 억제함으로써, 맘33의 보완균주는 글리코리시스쪽으로 상당한 변화를 보여준다. mam33 돌연변이 균주는 그러나 화합물 IV 의존경로가 이 긴장에서 손상되었다는 것을 건의하는 보상 적인 당분해변을 보여주지 못했습니다. 글리코리스틱 스트레스 테스트에서 세포는 1시간 동안 포도당을 굶주리고 기저 산소 소비율및 세포외 산성화율을 측정한다.기아 시, mam33 돌연변이 균주는 다른 균주에 비해 상당히 낮은 산소 소비와 세포외 산성화 비율을 보여줍니다. 이것은 세포가 기아 조건에 강요될 때 호흡과 글리코리시둘 다에 대한 포도당의 손상한 이용을 건의합니다. 포도 당을 주입 한 후, 모든 균주는 산소 소비 속도와 세포 외 산성화 속도 모두의 자극을 보여줍니다.분석 판의 코팅은 칸디다 알비칸스 세포가 플레이트에 부착 할 수 있습니다. 칸디다 알비칸스 세포의 부적절한 준수는 분석 결과에 영향을 미칠 것입니다. 이 기술의 발달 후에, 그것은 생리적이고 병리학적인 조건 도중 미토콘드리아가 어떻게 작동하는지 를 해결하는 세포 모형 및 질병의 넓은 범위에서 채택되었습니다.예를 들어, 이 분석에서 환자 유래 및 제어 세포를 채용하는 것은 미토콘드리아 기능이 어떻게 변경되는지에 대한 구체적인 질문을 해결할 수 있다. 이러한 화합물은 매우 유독하기 때문에 시안화 칼륨 및 항마이신 A와 같은 미토콘드리아 억제제를 준비하는 동안 주의해야 한다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

연구

의학

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

오염 불안에 대한 Orbitofrontal 접속을 타겟팅 실시간 fMRI의 생체 자기 제어 중이죠

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

운동은 성능의 실시간 피드백을 사용하여 재교육

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

화학 요법에 의한 혈관 독성 - 실시간<em&gt; 생체 내</em&gt; 선박 손상의 영상

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...