Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Forskning i NC lab støttes av National Institutes of Health (NIH) stipend R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) stipend, #PC40-18.

Merk: Detaljert gradvis protokollen til analysen er beskrevet nedenfor, og skjematisk protokollen er vist i figur 1.
1. C. albicans stammer og vekst betingelser
<ol><li>Vokse C. albicans stammene i flytende gjær ekstrakt-pepton-druesukker (YPD) medium på 30 °C i en inkubator shaker over natten. Merk: Opprettholde Candida stammer som frosne aksjer og vokse på YPD agar (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% druesukker og 2% aga...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

Bioenergi ekstra fluks analysen fungerer som et utmerket verktøy for å lese ut funksjonen mitokondrie ved å måle oxidative fosforylering (OXPHOS)-avhengige oksygenforbruk i sanntid. I tillegg kan en glycolytic funksjon som måles som en ekstracellulære forsuring rate (endre i ekstracellulære pH) også undersøkes samtidig i sanntid analyse.
Vellykket plating av C. albicans i analysen platen er en av de viktige trinnene i analysen fordi inkubasjonstiden for cellene i PDL belagt p...

Invasiv soppinfeksjoner drepe over 1,5 millioner mennesker hvert år over hele verden. Dette nummeret er på økningen skyldes en økning i antall mennesker med nedsatt immunitet, inkludert eldre, premature spedbarn, transplantasjon mottakere og kreft pasienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige fungal patogen som er en del av menneskelig mikroflora. Det bor også mucosal overflater og fordøyelsessystemet som en commensal organisme. C. albicans produserer alvorlig systemisk sykdom i folk som har immun mankoen, som har gjennomgått kirurgi eller som har blitt behandlet med lang kurs av antibiotika. Candida arter rangerer blant topp tre til fire årsakene til nosocomial smittsomme sykdommer (NID) i Human2,3,4,5,6,7. Det årlige globale antallet Candida blodbanen infeksjoner er anslått til ~ 400 000 tilfeller med tilknyttede dødelighet 46-75%1. Den årlige dødeligheten på grunn av candidiasis er omtrent 10 000 i USA alene. Omfanget av NID forårsaket av sopp gjenspeiles i astronomiske pasienten utgifter5. I USA overgår årlige kostnaden for behandlingen av invasiv soppinfeksjoner $2 milliarder, legger en enorm belastning til allerede overbelastet helsevesenet. Foreløpig er tilgjengelig standard soppdrepende terapi begrenset på grunn av toksisitet, stadig mer utbredt resistens og narkotika-interaksjoner. Derfor er det et presserende behov for å identifisere nye soppdrepende narkotika mål som fører til bedre behandlingstilbud for høy-risiko pasienter. Oppdagelsen av nye stoffer opptrer på sopp mål er imidlertid komplisert fordi sopp eukaryoter. Dette begrenser sterkt antall sopp-spesifikke narkotika mål.
Nyere studier har indikert at mitokondrier er en viktig bidragsyter til sopp virulens og toleranse soppdrepende narkotika siden mitochondria er viktig for cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose8 ,9,10,11. Både glycolytic og ikke-glycolytic metabolisme er avgjørende for overlevelse av C. albicans i de pattedyr vert12,13,14,15,16. Videre har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrie proteiner, slik som Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist seg å være defekt i filamentation, en viktig virulens faktor C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. I tillegg disse mutanter ble også vist å dempes for virulens i en musemodell spres candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Dermed representerer fungal mitokondrier et attraktivt mål for medisiner. Imidlertid er studiet av mitokondrie funksjon i C. albicans utfordrende fordi C. albicans er petite negative23, som betyr at det ikke kan overleve uten mitokondrie genomet.
Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å undersøke mitokondrie og glycolytic funksjon i C. albicans uten å rense mitokondrier. Denne metoden kan også optimeres for å undersøke effekten av genetisk manipulasjon eller kjemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic stier i C. albicans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

Mitokondrier er viktig organelles for cellenes stoffskifte og overlevelse. En rekke viktige hendelser skje i mitokondrier, som cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose. Følgelig rapporteres mitokondrie dysfunksjon å spille en viktig rolle i soppdrepende narkotika toleranse og virulens av patogene sopp. Nyere data har også ført til anerkjennelse av betydningen av mitokondrier som en viktig bidragsyter til sopp patogenesen. Til tross for betydningen av mitokondrier i fungal biologi, er standardiserte metoder å forstå dens funksjon dårlig utviklet. Her presenterer vi en prosedyre for å studere basale oksygen forbruksraten (OCR), et mål på mitokondrie åndedrett, og ekstracellulære forsuring priser (ECAR), et mål på glycolytic funksjon i C. albicans stammer. Metoden beskrevet her kan brukes på alle Candidaspp. stammer uten å rense mitokondrier fra intakt fungal cellene. Videre denne protokollen kan også tilpasses til skjermen for hemmere av mitokondrie funksjon i C. albicans stammer.

Fokus for denne protokollen er å avgjøre bioenergetisk funksjoner C. albicans vurdert av ekstra fluks analyzer. En C. albicans mutant mangler mitokondrie protein Mam33 er også inkludert sammen med sin supplement belastning, mam33Δ/Δ::MAM33 å studere virkningene av sletting av en mitokondrie protein på OCR og ECAR. MAM33 koder for et antatte mitokondrie surt matrix protein og dens funksjon Candida er ikke kjent.
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Her presenterer vi en gradvis protokoll for å undersøke mitokondrie åndedrett og glycolytic funksjonen i Candida Albicans bruker en ekstra fluks analyserer.

Bio-energetikk undersøkelse av Candida albicans bruker Real-time ekstracellulære Flux analyse

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Denne protokollen er viktig for å bestemme glykolytisk funksjon og mitokondrieånding i Candida albicans. Den største fordelen med denne teknikken er at det gjør det mulig for mitokondriefunksjon som skal måles uten å måtte rense mitokondrier fra Candida albicans. Denne metoden kan optimaliseres for å undersøke effekten av genetisk manipulasjon eller kjemiske modulatorer på mitokondrie- og glykolytiske veier i Candida albicans eller andre sopppatogener.Denne teknikken er relativt enkel. Eller avhengig av organismen, kan deres bruk bidra til å optimalisere cellenummeret og konsentrasjonen av mitokondriehemmere i analysen. I en laminær strømningshette oppløser poly-D-lysin i vevsgittvann til en endelig konsentrasjon på 50 mikrogram per milliliter.Bland løsningen godt og aliquot den i 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, og sørg for å aliquot minst 1,3 milliliter per rør. Tilsett 50 mikroliter av denne blandingen til hver brønn av analyseplaten, dekk lokket og inkuber ved romtemperatur i en til to timer. Deretter aspirerer løsningen.Skyll brønnene på analyseplaten en gang med 500 mikroliter sterilt vevskultur, åpne lokket og la brønnene lufttørke. Hvis du ikke bruker platen den dagen den er forberedt, lagre den på fire grader Celsius i maksimalt to til tre dager. Dagen før eksperimentet åpner du det ekstra fluksanalysesettet og fjerner innholdet.Plasser sensorkassetten opp ned ved siden av nytteplaten. Fyll hver brønn av nytteplaten med en milliliter kalifar, og plasser deretter sensorkassetten tilbake. Kontroller at sensorene som inneholder fluoroforer er nedsenket i kalifaren.Inkuber sensorkassetten ved 37 grader Celsius i en ikke-karbondioksidinkubator over natten. Dagen før analysen inokulerer de forberedte C albicans i YPD kjøttkraft og vokser over natten ved 30 grader Celsius i en shaker ved 200 rpm. På analysedagen fortynnes et passende antall celler i analysemediet for å gi en endelig konsentrasjon på 100 000 celler per 100 mikroliter.Tilsett 100 mikroliter av de fortynnede cellene i hver brønn av analyseplaten unntatt brønner A1, B4, C3 og D6. Til disse brønnene, legg bare 100 mikroliter av analysemedium for bakgrunnskorrigering. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i en ikke-karbondioksidinkubator i 60 minutter for å la cellene holde seg til plateoverflaten. Forbered forbindelsene for mitokondriefunksjonsanalysen ved 10X-konsentrasjon i det tilsvarende analysemediet som beskrevet i tekstprotokollen.Legg til 50 mikroliter sham i port A, 50 mikroliter oligomycin i port B, 62 mikroliter kaliumcyanid i port C, og 68 mikroliter Antimycin A i port D.Next, klargjør forbindelsene for glykolytisk stressanalyse ved 10X konsentrasjon i det tilsvarende analysemediet som beskrevet i tekstprotokollen. Legg til 50 mikroliter glukose i port A, 55 mikroliter oligomycin i port B, 62 mikroliter 2-DG i port C og 68 mikroliter Antimycin A i port D.Før analysen åpner du den ekstra fluksanalysatoren og setter opp analysemalen ved hjelp av analyseveiviserfanen. Følg de trinnvise instruksjonene, og fyll ut all informasjonen som vises under oppsettet.Generer et gruppeoppsett og konfigurer protokollen som beskrevet i tekstprotokollen. Lagre disse oppsettene før analysen. På tidspunktet for analysen gjenoppretter du den lagrede protokollen ved å åpne den tilsvarende filen i alternativet åpne filer i kategorien analyseveiviser.Deretter legger du 10X-forbindelsene inn i de respektive portene på den hydrerte sensorkassetten som inneholder kalifaren. Legg sensorkassetten i bærebrettet på den ekstra fluksanalysatoren. Start kalibreringen ved å klikke startknappen på skjermen.Deretter legger du forsiktig til 350 mikroliter av analysemediet til celleplaten langs siden av veggene for å minimere celleforstyrrelser som bringer det endelige volumet til 450 mikroliter. Sett på bruksplaten som inneholder kalibranten med analyseplaten, og fortsett analysen. Når analysen er fullført, fjerner du sensorkassetten og platen.Lagre filen i riktig målmappe. I denne studien vurderes de bio-energiske funksjonene til C albicans av ekstra fluxanalysator. En mutant som mangler mitokondrieproteinmaul33 er også inkludert sammen med sin komplementbelastning for å studere effekten av sletting av et mitokondrieprotein på oksygenforbruk og ekstracellulære forsuringsrater.C albicans vill type viser et oksygenforbruk på 145 picomoles per minutt som er godt innenfor det optimale området for enhver ekstracellulær fluksanalyse. Den basale oksygenforbruket av vill type, mam33 mutant og mam33 supplert stammer viser ingen forskjeller. På samme måte er det ikke sett noen signifikante forskjeller i de basale ekstracellulære forsuringsratene mellom stammene.Men ved å hemme kompleks-IV med kaliumcyanid, vill type og mam33 mutant, mam33 supplert stammer viser en betydelig endring mot glycolyse. Mam33 mutert stamme klarte imidlertid ikke å vise et kompenserende glykolytisk skifte som tyder på at den sammensatte-IV-avhengige banen er svekket i denne belastningen. I den glykolytiske stresstesten sultes cellene av glukose i en time, og basal oksygenforbruk og ekstracellulær forsuring måles.Ved sult viser mam33 mutert stamme betydelig lavere oksygenforbruk og ekstracellulære forsuringshastigheter sammenlignet med de andre stammene. Dette antyder en nedsatt utnyttelse av glukose for både respirasjon og glykose når celler tvinges til sulttilstanden. Etter injeksjon av glukose viser alle stammer stimulering av både oksygenforbruket og ekstracellulær forsuringshastighet.Belegget av analyseplaten gjør at Candida albicans-celler kan feste seg til platen. Feil overholdelse av Candida albicans celler vil påvirke analyseresultatet. Etter utviklingen av denne teknikken har den vært ansatt i et bredt spekter av celletyper og sykdommer som tar for seg hvordan mitokondrier fungerer under fysiologiske og patologiske forhold.For eksempel, ved å ansette pasientavledede og kontrollere celler i denne analysen, er det mulig å ta opp de spesifikke spørsmålene om hvordan mitokondriefunksjonen endres. Forsiktighet bør tas under utarbeidelse av mitokondriehemmere som kaliumcyanid og antimycin A fordi disse forbindelsene er ekstremt giftige.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

Real-time fMRI Biofeedback Targeting den Orbitofrontal Cortex for forurensning Angst

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MikroRNA Detection i prostatakreft ved Kvantitativ Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Movement Omskolering ved Real-time Tilbakemelding of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bruke kvantitativ real-time PCR fastslår Donor Cell engraftment i en konkurransedyktig Murine benmargstransplantasjon Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæsken MikroRNA Profilering Bruke Kvantitativ Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Cytostatikaindusert Vaskulær Toxicity - Real-time<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Vessel Nedskrivning

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Vurdering av Ovarian Cancer Spheroid Vedlegg og invasjon av mesothelial celler i sanntid

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time cytotoksisitetsanalyser i humant fullblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...