Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Pesquisa no laboratório de NC é suportada por uma concessão do National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e uma bolsa da Fundação de saúde de Nova Jersey (NJHF), #PC40-18.

Nota: O protocolo detalhado passo a passo do ensaio é descrito abaixo, e o protocolo esquemático é mostrado na Figura 1.
1. cepas de c. albicans e condições de crescimento
<ol><li>Crescem as cepas de c. albicans em meio de levedura extrato-peptona-Dextrose (YPD) líquido a 30 °C em um shaker incubadora durante a noite. Nota: Manter cepas de Candida como estoques congelados e crescem em ágar YPD (extrato de levedura 1...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

A bioenergética ensaio de fluxo extra serve como uma excelente ferramenta para ler a função mitocondrial medindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxigênio dependente em tempo real. Além disso, uma função glicolítico que é medida como uma taxa de acidificação do extracelular (alteração do pH extracelular) também pode ser investigada ao mesmo tempo em análise em tempo real.
Bem sucedido chapeamento de c. albicans em placa de ensaio é um dos passos críticos n...

Infecções fúngicas invasivas matam mais 1,5 milhões de pessoas por ano em todo o mundo. Este número está a aumentar devido ao aumento do número de pessoas que vivem com imunidade comprometida, incluindo os idosos, prematuros bebês, transplantados e pacientes de câncer1. C. albicans é um patógeno oportunista de fungo humano que faz parte da microflora humana. Habita também superfícies mucosas e do trato gastrointestinal como um organismo comensal. C. albicans produz doença sistêmica grave em pessoas que têm deficiências imunitárias, que se submeteram à cirurgia, ou que tenham sido tratados com longos cursos de antibióticos. A classificação de espécies de Candida entre as causas de topo três ou quatro das doenças infecciosas nosocomiais (NID) em seres humanos,2,3,4,5,6,7. O número global anual de infecções da corrente sanguínea por Candida é estimado em ~ 400.000 casos, com mortalidade associada de 46-75%1. A mortalidade anual por causa da candidíase é aproximadamente 10.000 nos Estados Unidos sozinho. A extensão do NID causada por fungos também se reflete em gastos astronômicos de paciente5. Nos Estados Unidos, a despesa anual para o tratamento de infecções fúngicas invasivas supera US $ 2 bilhões, adicionando um esforço enorme para o sistema de saúde já sobrecarregado. Atualmente, terapias antifúngicas padrão disponíveis são limitadas por causa da resistência a drogas cada vez mais prevalente, toxicidade e interações medicamentosas. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar novos alvos de drogas antifúngicas que resultarão em melhores opções de tratamento para pacientes de alto risco. No entanto, a descoberta de novas drogas atuando em alvos fúngicos é complicada, porque os fungos são eucariontes. Isto grandemente limita o número de alvos de drogas de fungos específicos.
Estudos recentes têm indicado que as mitocôndrias são um contribuinte crítico para a virulência de fungo e tolerância às drogas antifúngicas, desde que as mitocôndrias são importantes para a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico e não-glicolíticas são essenciais para a sobrevivência de c. albicans no hospedeiro mamífero12,13,14,15,16. Além disso, vários mutantes de c. albicans , falta de proteínas mitocondriais, tais como Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc foram mostrados para ser defeituoso em filamentação, um factor de virulência importante de c. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Além disso, esses mutantes também foram mostrados para ser atenuado para virulência em um modelo do rato disseminada candidíase17,18,19,20,21 ,22. Assim, fungosas mitocôndrias representam um alvo atraente para a descoberta da droga. No entanto, o estudo da função mitocondrial em c. albicans é um desafio porque c. albicans é petite negativo23, que significa que não pode sobreviver sem o genoma mitocondrial.
Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para investigar a função mitocondrial e glicolítico em c. albicans , sem a necessidade de purificar as mitocôndrias. Esse método também pode ser otimizado para investigar o efeito da manipulação genética ou moduladores químicos sobre vias mitocondriais e glicolíticas em c. albicans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

As mitocôndrias são organelas essenciais para o metabolismo celular e a sobrevivência. Uma variedade de eventos chaves ocorrem nas mitocôndrias, tais como a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose. Por conseguinte, disfunção mitocondrial é relatada para desempenhar um papel importante na tolerância de droga antifúngica e virulência de fungos patogênicos. Dados recentes também levaram ao reconhecimento da importância das mitocôndrias como um contribuinte importante para a patogênese fúngica. Apesar da importância das mitocôndrias em biologia de fungosa, métodos padronizados para entender sua função estão pouco desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento para estudar a taxa de consumo de oxigênio basal (OCR), uma medida da respiração mitocondrial e taxas de acidificação do extracelular (ECAR), uma medida da função glicolítico em cepas de c. albicans . O método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer Candidaspp. tensões sem a necessidade de purificar a mitocôndria das células fúngicas intactas. Além disso, esse protocolo também pode ser personalizado para triagem de inibidores da função mitocondrial em cepas de c. albicans .

O foco do presente protocolo é para determinar as funções bioenergética de c. albicans avaliados pelo analisador de fluxo extra. Um mutante de c. albicans , falta proteína mitocondrial Mam33 também está incluído, juntamente com a sua estirpe de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial em OCR e ECAR. MAM33 codifica para uma proteína putativa matriz mitocondrial de ácidos e sua função na...

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Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.

Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Este protocolo é significativo para determinar a função glicolítico e a respiração mitocondrial em candida albicans. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que a função mitocondrial seja medida sem a necessidade de purificar mitocôndrias de candida albicans. Este método pode ser otimizado para investigar os efeitos da manipulação genética ou moduladores químicos em vias mitocondriais e glicolíticas em abicanos candida ou outros patógenos fúngicos.Esta técnica é relativamente simples. Ou dependendo do organismo, seu uso pode ajudar a otimizar o número celular e a concentração de inibidores mitocondriais em seu ensaio. Em uma capa de fluxo laminar, dissolva a Poly-D-Lysine na água da rede de tecidos para uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.Misture bem a solução e aliquot-la em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro, certificando-se de alíquotar de pelo menos 1,3 mililitros por tubo. Adicione 50 microliters desta mistura a cada poço da placa de ensaio, cubra a tampa e incubar à temperatura ambiente por uma a duas horas. Então aspire a solução.Enxágüe os poços da placa de ensaio uma vez com 500 microliters de água de grau de cultura tecidual estéril, abra a tampa e deixe os poços secarem. Se não estiver usando a placa no dia em que estiver preparada, armazene-a a quatro graus Celsius por um máximo de dois a três dias. Um dia antes do experimento, abra o kit de ensaio de fluxo extra e remova o conteúdo.Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade. Encha cada poço da placa de utilidade com um mililitro de calibrante e, em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta. Certifique-se de que os sensores que contêm fluoroforos estão submersos no calibrante.Incubar o cartucho do sensor a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono durante a noite. Um dia antes do ensaio, inocular os albicanos C preparados no caldo YPD e crescer durante a noite a 30 graus Celsius em um shaker a 200 rpm. No dia do ensaio, diluir um número adequado de células no meio de ensaio para produzir uma concentração final de 100.000 células por 100 microliters.Adicione 100 microliters das células diluídas em cada poço da placa de ensaio, exceto os poços A1, B4, C3 e D6. A esses poços, adicione apenas 100 microliters de meio de ensaio para correção de fundo. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 60 minutos para deixar as células aderirem à superfície da placa. Prepare os compostos para o ensaio da função mitocondrial na concentração de 10X no meio de ensaio correspondente, conforme descrito no protocolo de texto.Adicione 50 microliters de SHAM na porta A, 50 microliters de Oligomicina na porta B, 62 microliters de cianeto de potássio na porta C, e 68 microliters de Antimicina A na porta D.Next, prepare os compostos para o ensaio de estresse glicolítico na concentração de 10X no meio de ensaio correspondente, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 50 microliters de glicose à porta A, 55 microliters de Oligomicina na porta B, 62 microliters de 2-DG na porta C e 68 microliters de Antimicina A na porta D.Antes do ensaio, abra o analisador de fluxo extra e configure o modelo de ensaio usando o assistente de guia de ensaio. Siga as instruções passo a passo e preencha todas as informações que aparecem durante a configuração.Gere um layout de grupo e configure o protocolo conforme descrito no protocolo de texto. Salve esses layouts antes do ensaio. No momento do ensaio, restaure o protocolo salvo abrindo o arquivo correspondente na opção arquivo aberto na guia assistente de ensaio.Em seguida, carregue os compostos de 10X nas respectivas portas do cartucho hidratado contendo o calibrante. Carregue o cartucho do sensor na bandeja portadora do analisador de fluxo extra. Inicie a calibração clicando no botão iniciar na tela.Em seguida, adicione suavemente 350 microliters do meio de ensaio à placa celular ao longo da lateral das paredes para minimizar a perturbação celular, trazendo o volume final para 450 microliters. Substitua a placa de utilidade contendo o calibrante com a placa de ensaio e continue o ensaio. Uma vez que o ensaio esteja concluído, remova o cartucho do sensor e a placa.Salve o arquivo na pasta de destino apropriada. Neste estudo, as funções bioenérgicas dos albicanos C são avaliadas por analisador de fluxo extra. Um mutante sem a proteína mitocondrial mam33 também está incluído junto com sua cepa complementar para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial na taxa de consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular.O tipo selvagem de C albicans mostra uma taxa de consumo de oxigênio de 145 picomoles por minuto que está bem dentro da faixa ideal para qualquer ensaio de fluxo extracelular. A taxa de consumo de oxigênio basal do tipo selvagem, as cepas mam33 mutantes e mam33 complementadas não mostram diferenças. Da mesma forma, não são observadas diferenças significativas nas taxas de acidificação extracelular basal entre as cepas.No entanto, ao inibir o complexo-IV com cianeto de potássio, do tipo selvagem e do mutante mam33, as cepas complementadas mam33 mostram uma mudança significativa em direção à glicólise. A cepa mutante mam33, no entanto, não mostrou uma mudança glicolítico compensatória sugerindo que a via dependente composta-IV está prejudicada nesta cepa. No teste de estresse glicolítico, as células estão famintas de glicose por uma hora e a taxa de consumo de oxigênio basal e a taxa de acidificação extracelular são medidas.Após a fome, a cepa mutante mam33 mostra um consumo significativamente menor de oxigênio e taxas de acidificação extracelular em comparação com as outras cepas. Isso sugere uma utilização prejudicada da glicose para respiração e glicolise quando as células são forçadas à condição de fome. Após a injeção de glicose, todas as cepas mostram estimulação tanto de sua taxa de consumo de oxigênio quanto da taxa de acidificação extracelular.O revestimento da placa de ensaio permite que as células de candida albicans aderam à placa. A adesão inadequada das células de candida albicans afetará o resultado do ensaio. Após o desenvolvimento dessa técnica, ela tem sido empregada em uma ampla gama de tipos e doenças celulares que abordam como as mitocôndrias funcionam durante as condições fisiológicas e patológicas.Por exemplo, empregando células de controle e derivadas do paciente neste ensaio, é possível abordar as questões específicas de como a função mitocondrial é alterada. Deve-se tomar cuidado durante a preparação de inibidores mitocondriais, como cianeto de potássio e antimicina A, porque esses compostos são extremamente venenosos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medicina

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

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We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

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Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

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Movimento Reciclagem com feedback em tempo real do desempenho

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

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Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

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Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de Impairment Vessel

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

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