Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Исследования в лаборатории НК поддерживается национальных институтов здравоохранения (НИЗ) Грант R01AI24499 и Грант фонда здравоохранения Нью-Джерси (NJHF), #PC40-18.

Примечание: Ниже приводится подробный поэтапный протокол assay, и схема протокол показано на рисунке 1.
1. штаммы C. albicans и условия роста
<ol><li>Растут штаммов C. albicans в жидкой среде дрожжевой экстракт-Пептон-декстрозы (YPD) при 30 °C в шейкер инкубатор...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

Биоэнергетика дополнительный поток пробирного служит прекрасным инструментом для чтения из митохондрий путем измерения Оксидативное фосфорилирование (OXPHOS)-потребление зависит от кислорода в режиме реального времени. Кроме того гликолитических функция, которая измеряется как показ?...

Инвазивные грибковые инфекции убить более 1,5 миллиона человек в год во всем мире. Этот номер находится на подъеме благодаря увеличению числа людей, живущих с нарушенной иммунитет, в том числе пожилых, недоношенных младенцев, пересадка получателей и раковых больных1. C. albicans является оппортунистических человека грибкового патогена, которая является частью человеческого микрофлоры. Он также обитает слизистой поверхности и желудочно-кишечного тракта как синантропных организм. C. albicans производит серьезное системное заболевание у людей, которые имеют иммунные недостатки, которые подверглись операции, или которые были обработаны с длиной курсы антибиотиков. Ранг видов Candida среди топ три-четыре причин внутрибольничных инфекционных заболеваний (NID) в люди2,3,4,5,6,7. Ежегодные глобальные количество Candida инфекций кровотока оценивается в ~ 400 000 случаев, с связанные смертности 46-75%1. Ежегодная смертность вследствие кандидоз — примерно 10 000 в одних только Соединенных Штатах. Степень NID, вызванные грибками отражена также в астрономические расходы пациента5. В Соединенных Штатах ежегодные расходы для лечения инвазивных грибковых инфекций превышает $2 млрд, добавляя огромную нагрузку на уже перегруженные системы здравоохранения. В настоящее время доступны стандартные противогрибковой терапии ограничены из-за токсичности, все более широкое распространение лекарственной устойчивости и наркотиков лекарственных взаимодействий. Таким образом существует настоятельная необходимость определить новые цели противогрибковый препарат, которые приведут к более вариантов лечения для пациентов высокого риска. Однако открытие новых препаратов, действующих на грибковые целей является сложным, потому что грибы являются эукариотами. Это значительно ограничивает количество наркотиков грибковых конкретных целей.
Недавние исследования показали, что Митохондрии являются критический вклад грибковых вирулентности и терпимости к противогрибковых препаратов, поскольку митохондрии имеют важное значение для клеточного дыхания, окислительного метаболизма, сигнала и апоптоза8 ,9,10,11. Метаболизм гликолитических и не гликолитических имеют важное значение для выживания C. albicans в млекопитающих принимающей12,13,14,,1516. Кроме того несколько мутантов C. albicans , хватает митохондриальных протеинов, таких как Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 и т.д. было показано неисправен в филаментацию, является важным вирулентности фактором C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Кроме того, эти мутанты были также продемонстрированы быть ослаблены для вирулентности в модели мыши распространение кандидоз17,18,19,20,21 ,22. Таким образом грибковых митохондрий представляют привлекательной мишенью для обнаружения наркотиков. Однако изучение митохондриальной функции в C. albicans является сложной задачей, потому что маленькая негативные23, что означает, что она не может выжить без митохондриального генома C. albicans .
Здесь мы описываем протокол, который может использоваться для изучения функции митохондрий и гликолитических в C. albicans без необходимости очистки митохондрий. Этот метод также может быть оптимизирован для исследовать влияние генетических манипуляций или химические модуляторы на митохондриальной и гликолитических путей в C. albicans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

Митохондрии являются основные органеллы для клеточного метаболизма и выживания. Целый ряд ключевых событий происходят в митохондрии, например клеточного дыхания, окислительного метаболизма, сигнала и апоптоз. Следовательно митохондриальной дисфункции, как сообщается, играть важную роль в противогрибковый препарат терпимости и вирулентности патогенных грибов. Последние данные также привели к признанию важности митохондрий как важный вклад грибковых патогенеза. Несмотря на важное значение митохондрий в грибковых биологии стандартизированные методы, чтобы понять ее функции развиты плохо. Здесь мы представляем процедуру для изучения базальной кислорода расхода (OCR), мера митохондриальное дыхание и внеклеточной подкисления ставок (ECAR), мера гликолитических функции штаммов C. albicans . Метод, описанный здесь может применяться к любой Candidaspp. штаммы без необходимости очистки митохондрий от нетронутыми грибковых клеток. Кроме того, этот протокол также может быть настроен на экран ингибиторов митохондриальных функции штаммов C. albicans .

В центре внимания настоящего Протокола заключается в определении биоэнергетический функции C. albicans оценку анализатором дополнительный поток. C. albicans мутант хватает митохондриальных белок Mam33 входит также вместе с его дополнением штамм, mam33Δ/Δ::MAM33 для изу...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Здесь мы представляем поэтапного протокол митохондриальное дыхание и гликолитических функции в Candida Albicans расследовать с помощью анализатора дополнительный поток.

Биоэнергетика расследование Candida albicans с помощью реального времени внеклеточного потока анализа

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Этот протокол имеет важное значение для определения гликолитической функции и митохондриального дыхания в Candida albicans. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет измерять митохондриальную функцию без необходимости очищения митохондрий от Candida albicans. Этот метод может быть оптимизирован для исследования влияния генетических манипуляций или химических модуляторов на митохондриальные и гликолитические пути в альбиканах Candida или других грибковых патогенах.Этот метод относительно прост. Или в зависимости от организма, их использование может помочь оптимизировать количество клеток и концентрацию митохондриальных ингибиторов в их анализе. В ламинарном капюшоне растворяют Поли-Д-лизин в тканевой сетке воды до конечной концентрации 50 микрограмм на миллилитр.Смешайте раствор хорошо и aliquot его в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки убедившись, что aliquot по крайней мере 1,3 миллилитров на трубку. Добавьте 50 микролитров этой смеси к каждому колодец анализной пластины, накройте крышкой и инкубировать при комнатной температуре в течение одного-двух часов. Затем аспирировать раствор.Промыть колодцы анализной пластины один раз с 500 микролитров стерильной ткани культуры класса воды, открыть крышку и дать скважинам высохнуть. Если тарелку не использовать в день ее готовности, храните ее при четырех градусах по Цельсию максимум два-три дня. За день до эксперимента откройте дополнительный набор анализов потока и удалите содержимое.Поместите сенсорный картридж вверх дном рядом с утилитой пластины. Заполните каждый колодец утилиты пластины с одним миллилитром калибранта, а затем поместить датчик картридж обратно. Убедитесь, что датчики, содержащие фторфоры, погружены в калибрант.Инкубировать картридж датчика при 37 градусах по Цельсию в неуглеродного диоксида инкубатора на ночь. За день до анализа, привить подготовленные C albicans в бульоне YPD и расти на ночь при 30 градусов по Цельсию в шейкере при 200 об/мин. В день анализа разбавляют соответствующее количество клеток в среде анализа, чтобы дать окончательную концентрацию 100 000 клеток на 100 микролитров.Добавьте 100 микролитров разбавленных клеток в каждую скважину анализной пластины, за исключением скважин A1, B4, C3 и D6. К этим скважинам добавьте всего 100 микролитров среды анализа для фоновой коррекции. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в неуглеродный инкубатор диоксида в течение 60 минут, чтобы клетки придерживаться поверхности пластины. Подготовь соединения для анализа митохондриальной функции при концентрации 10X в соответствующей среде анализа, изложенной в текстовом протоколе.Добавьте 50 микролитров SHAM в порт А, 50 микролитров олигомицина в порт B, 62 микролитров цианида калия в порт С и 68 микролитров антимицина А в порт D.Next, подготовьте соединения для анализа гликолитического стресса при концентрации 10X в соответствующей среде анализа, изложенной в текстовом протоколе. Добавьте 50 микролитров глюкозы в порт А, 55 микролитров олигомицина в порт B, 62 микролитров 2-DG в порт C и 68 микролитров Антимицина А в порт D.Before the assay откройте дополнительный анализатор потока и наладив шаблон анализа анализа, используя вкладку мастера анализа, используя вкладку мастера анализа. Следуйте пошаговому инструкции и заполнить всю информацию, которая выскочить во время установки.Создать макет группы и настроить протокол, изложенный в текстовом протоколе. Сохраните эти макеты до анализа. Во время анализа восстановите сохраненный протокол, открыв соответствующий файл в варианте открытого файла во вкладке мастера анализа.Затем загрузите соединения 10X в соответствующие порты гидратированного сенсорного картриджа, содержащего калибрант. Загрузите сенсорный картридж в лоток несущей дополнительного анализатора потока. Начните калибровку, нажав кнопку «Пуск» на экране.Затем аккуратно добавьте 350 микролитров среды анализа к клеточной пластине вдоль стенок, чтобы свести к минимуму нарушение работы клеток, доведя конечный объем до 450 микролитров. Замените утилиту, содержащую калибрант, на анализную пластину и продолжайте анализ. Как только анализ будет завершен, удалите сенсорный картридж и пластину.Сохраните файл в соответствующей папке назначения. В этом исследовании, био-энергетические функции C albicans оцениваются дополнительным анализатором потока. Мутант не хватает митохондриального белка mam33 также включен вместе с его дополнением штамма для изучения влияния удаления митохондриального белка на уровень потребления кислорода и внеклеточного подкисления.Дикий тип C albicans показывает скорость потребления кислорода 145 пикомолов в минуту, что находится в пределах оптимального диапазона для любого внеклеточного анализа потока. Базальная скорость потребления кислорода дикого типа, mam33 мутантов и mam33 дополненных штаммов не показывают никаких различий. Аналогичным образом, никаких существенных различий в базальных внеклеточных темпов подкисления между штаммами не наблюдается.Однако, путем ингибирования комплекса-IV с цианидом калия, дикий тип и mam33 мутант, mam33 дополненные штаммы показывают значительный сдвиг в сторону гликолиза. Mam33 мутант штамм однако не удалось показать компенсационный гликолитический сдвиг, предполагая, что соединение-IV зависимый путь нарушается в этом штамме. В гликолитический стресс-тест, клетки голодают глюкозы в течение одного часа и базальной скорости потребления кислорода и внеклеточной подкисления измеряется.После голодания штамм мутантов mam33 значительно снижает потребление кислорода и показатели внеклеточного подкисления по сравнению с другими штаммами. Это говорит о нарушении использования глюкозы как для дыхания, так и для гликолиза, когда клетки вынуждены голодать. После введения глюкозы, все штаммы показывают стимуляцию как их скорости потребления кислорода и внеклеточной скорости подкисления.Покрытие анализной пластины позволяет клеткам Candida albicans прилипать к пластине. Неправильное соблюдение Candida Albicans клетки будут влиять на результат анализа. После разработки этого метода, он был использован в широком диапазоне типов клеток и заболеваний, касаясь того, как митохондрии функции во время физиологических и патологических состояний.Например, используя в этом анализе клетки, полученные пациентом, и контрольные клетки, можно решить конкретные вопросы о том, как изменяется митохондриальная функция. Следует позаботиться о подготовке митохондриальных ингибиторов, таких как цианид калия и антимицин А, потому что эти соединения чрезвычайно ядовиты.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Оценка наночастиц в опухоли в реальном времени с помощью Прижизненные изображения

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

В реальном времени МРТ Биологическая обратная связь Ориентация орбитофронтальной коры за загрязнение Тревога

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Обнаружение микроРНК в опухолях простаты количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Движение переподготовки использовании в режиме реального времени обратная связь о производительности

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Спинномозговой жидкости профилирования микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Химиотерапия индуцированных Сосудистая токсичность - в режиме реального времени<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображений судна обесценение

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Оценка Рак яичников Сфероид Приложении и Вторжение мезотелиальной клетки в реальном времени

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

В режиме реального времени на цитотоксичность в человека цельной крови

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida Albicans биопленки развития на медицинской актуальных инородных тел в мышиной подкожной модели с последующим биолюминесценции изображений