Name: bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

NC laboratuarında Araştırma Ulusal kurumları Sağlık (NIH) grant R01AI24499 ve bir New Jersey Sağlık Vakfı (NJHF) grant, #PC40-18 tarafından desteklenir.

Not: Testin detaylı kademeli Protokolü aşağıda anlatılan ve şematik protokolü şekil 1' de gösterilen.
1. C. albicans suşları ve büyüme koşulları
<ol><li>C. albicans suşları sıvı Maya özü-pepton-dekstroz (YPD) orta 30 °C bir kuluçka shaker gecede büyümek. Not: Candida suşları donmuş hisse senetleri olarak korumak ve YPD agar (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, %2 dekstroz ve %2 agar) büyümek.</li>
...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals:+analysis+of+24,179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study.">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants:+an+international+consensus.">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li><li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infection+rates+in+US+children's+hospitals'+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units.">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li><li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections.">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li><li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+candidemia:+risk+factors+and+attributable+mortality.">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li><li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals:+epidemiology,+clinical+features+and+susceptibilities.">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li><li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells.">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li><li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+fungal+pathogenesis:+drug+tolerance,+virulence,+and+potential+for+antifungal+therapy.">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li><li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels.">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li><li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection.">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li><li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen.">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li><li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans.">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li><li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocytes+govern+the+transcriptional+response,+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood.">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li><li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages.">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li><li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes.">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li><li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence.">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death.">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li><li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+SRR1,+a+putative+two-component+response+regulator+gene,+is+required+for+stress+adaptation,+morphogenesis,+and+virulence.">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li><li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans.">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li><li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans.">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans:+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness,+cell+wall+integrity,+and+virulence.">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li><li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida and Candidiasis. , (2002).</li><li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans.">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility.">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li><li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay.">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li></ol>

Bioenergetics mitokondriyal işlev oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ölçerek okumak için mükemmel bir araç olarak hizmet veren ilave akı tahlil-bağımlı oksijen tüketimi içinde gerçek-zaman. Buna ek olarak, bir hücre dışı asitleştirme oranı (ekstrasellüler pH değişikliği) olarak ölçülen glycolytic bir fonksiyonu da aynı anda gerçek zamanlı analiz soruşturma olmaktır.
PDL kaplamalı plakalar hücrelerde kuluçka izin verdiğinden tahlil plakasına uygun hücrelere <e...

İnvazif mantar enfeksiyonları yılda dünya çapında 1,5 milyonun üzerinde kişi öldür. Yaşlı, prematüre bebeklerde, organ nakli alıcılar ve kanser hastaları1de dahil olmak üzere tehlikeye dokunulmazlık ile yaşayan insanların sayısında bir artış nedeniyle yükselişte sayıdır. C. albicans insan mikrofloranın parçasıdır fırsatçı bir insan mantar patojen var. Bu da Mukozal yüzeyler ve gastrointestinal sistem komensal bir organizma olarak yaşıyor. C. albicans bağışıklık eksiklikler, kim cerrahi undergone ya da kim uzun kursları antibiyotik ile tedavi edilmiş olan kişilerde ciddi sistemik hastalık üretir. Candida türleri sırası Nozokomiyal enfeksiyon hastalıkları (NID) insanlar2,3,4,5,6,7ilk üç-dört nedenleri arasında. Candida kan dolaşımına enfeksiyonların yıllık genel sayısı ~ 400.000 talepleriyle ilişkili Scotlan 46-%751olduğu tahmin edilmektedir. Kandidiyazis nedeniyle yıllık mortalite yaklaşık 10.000 ABD tek başına olduğunu. NID mantarlar tarafından neden olduğu ölçüde astronomik hasta giderleri5' da yansıtılır. Amerika Birleşik Devletleri'nde, yıllık masraf invazif mantar enfeksiyonları tedavisi için $2 milyar, zaten aşırı yüklenmiş sağlık sistemi için çok büyük bir yük ekleyerek aşan. Şu anda, mevcut standart antifungal tedavilerin toksisite, giderek yaygın ilaç direnci ve ilaç-ilaç etkileşimleri nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, yüksek riskli hastalar için daha iyi tedavi seçenekleri neden olur yeni antifungal ilaç hedefler belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır. Ancak, yeni ilaçlar mantar hedef üstünde hareket keşfi mantarlar ökaryotlarda olduğundan karmaşıktır. Bu büyük ölçüde özel mantar uyuşturucu hedef sayısını sınırlar.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda mitokondri hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve apoptosis8 için önemli olduğundan mitokondri mantar virülans için önemli bir katkı ve antifungal ilaçlar için hoşgörü olduğunu belirttiler ,9,10,11. Glycolytic ve glycolytic metabolizma C. albicans hayatta memeli ev sahibi12,13,14,15,16için önemlidir. Ayrıca, birkaç C. albicans mutantlar mitokondrial proteinler, Goa1 gibi eksik Srr1, Gem1, Sam37 vb filamentation, bir önemli virülans faktörü C. albicans17, arızalı olduğu gösterilmiştir 18 , 19 , 20 , 21 , 22. buna ek olarak, bu mutant Ayrıca, bir fare modeli virülans kandidiyazis17,18,19,20,21 Dissemine için zayıflatılmış gösterildi ,22. Böylece, mantar mitokondri ilaç keşfi için cazip bir hedef gösterir. C. albicans mitokondrial genom yaşayamaz anlamına gelir petite negatif23, çünkü ancak, C. albicans mitokondriyal işlevde çalışmanın meydan okuyor.
Burada, biz C. albicans mitokondrial ve glycolytic işlevinde mitokondri arındırmak için gerek kalmadan araştırmak için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem aynı zamanda genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörler C. albicansmitokondrial ve glycolytic yollar üzerindeki etkisini araştırmak için optimize edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT50020PB</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCN</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mito stress kit</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:84px;">Calbiochem</td>
			<td>495455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH meter</td>
			<td style="width:84px;">Accumet</td>
			<td>AR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol red</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Poly-D lysine</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rotenone</td>
			<td style="width:84px;">Santa cruz</td>
			<td>203242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100850-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SHAM</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:84px;">Amresco&#160;</td>
			<td>241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium hydroxie pellets</td>
			<td style="width:84px;">J.T Baker</td>
			<td>3722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue culture grade water</td>
			<td style="width:84px;">Gibco</td>
			<td>1523-0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">XF assay calibrant solution</td>
			<td style="width:84px;">Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose</td>
			<td>Fisher scientific,</td>
			<td>BP2469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:295px;">Yeast extract Peptone Glycerol</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-energetics investigation of candida albicans using real-time extracellular flux analysis

Mitokondri temel organellerin hücre metabolizması ve hayatta kalmak için vardır. Önemli olaylar çeşitli hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve Apoptozis gibi mitokondri içinde yer alır. Sonuç olarak, mitokondrial disfonksiyon antifungal ilaç hoşgörü ve patojenik mantar virülans önemli bir rol oynamaya bildirilmektedir. Son veri mitokondri önemini mantar patogenezinde önemli bir katkı olarak tanınması da açmıştır. Mitokondri mantar Biyolojide önemini rağmen onun işlevini anlamak için standartlaştırılmış yöntemler kötü geliştirilir. Burada, çalışma Bazal oksijen tüketim oranını (OCR), bir ölçü mitokondrial solunum ve ekstraselüler asitleştirme oranları (D.H.T.), C. albicans suşları glycolytic işlevinde bir ölçü için bir yordam mevcut. Burada açıklanan yöntemi herhangi bir soy Candidaspp. mitokondri sağlam mantar hücrelerden arındırmak için gerek kalmadan uygulanabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı Ayrıca özelleştirilebilir için C. albicans suşları mitokondriyal işlevde inhibitörleri ekran.

C. albicans ilave akı Çözümleyicisi tarafından değerlendirildi biyo-enerjetik işlevlerini belirlemek için bu iletişim kuralını odak noktasıdır. Mitokondrial protein Mam33 eksik bir C. albicans mutant Ayrıca onun tamamlayıcı zorlanma, mitokondriyal bir protein silme etkilerini OCR ve D.H.T. çalışmaya mam33Δ/Δ::MAM33 ile birlikte bulunur. MAM33 için sözde mitokondrial asidik matris protein kodlar ve Candida onun işlevinde ...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Burada, mitokondrial solunum ve Candida Albicans glycolytic işlevinde araştırmak için kademeli bir protokol bir ilave akı çözümleyicisini kullanarak mevcut.

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Bu protokol Candida albicans glikolitik fonksiyon ve mitokondriyal solunum belirlenmesi için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, mitokondriyal fonksiyonun Candida albicans'dan mitokondriyi arındırmaya gerek kalmadan ölçülmesine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, candida albicans veya diğer mantar patojenlerinde mitokondriyal ve glikolitik yollar üzerinde genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörlerin etkilerini araştırmak için optimize edilebilir.Bu teknik nispeten basittir. Ya da organizmaya bağlı olarak, onların kullanımı hücre numarasını ve onların tsay mitokondriyal inhibitörlerin konsantrasyonu optimize etmek için yardımcı olabilir. Bir laminar akış kaputunda, doku ızgara susında ki Poli-D-Lizin'i mililitre başına 50 mikrogramlık son konsantrasyona eritin.Çözeltiyi iyice karıştırın ve 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere yerleştirin ve tüp başına en az 1,3 mililitre aliquot olmasını unutmayın. Bu karışımın 50 mikrolitresini her bir kuyuya tazyik plakasının her kuyusuna ekleyin, kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Sonra çözelti aspire.500 mikrolitre steril doku kültürü sınıfı su ile bir kez yüzer, kapağı açın ve kuyuların kurumasını bekleyin. Plakayı hazırlandığı gün kullanmıyorsanız, en fazla iki ila üç gün süreyle dört derece saklayın. Denemeden bir gün önce, ekstra akı temizleme kitini açın ve içeriğini çıkarın.Sensör kartuşu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin. Yardımcı plakanın her kuyusunu bir mililitre kalibrrant ile doldurun ve sensör kartuşu geri yerleştirin. Florofor içeren sensörlerin kalibreğe batırDığından emin olun.Sensör kartuşu bir gecede karbondioksit olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir gün önce, YPD suyu hazırlanan C albicans aşılamak ve 200 rpm bir shaker 30 derece santigrat gecede büyümek. Tahlil günü, 100 mikrolitre başına 100, 000 hücre nihai konsantrasyon verim tahlil orta hücrelerin uygun sayıda seyreltmek.A1, B4, C3 ve D6 kuyuları dışında, sulandırılmış hücrelerin her bir kuyuya 100 mikrolitre sini ekleyin. Bu kuyular için, arka plan düzeltme için sadece 100 mikrolitre araştırma ortamı ekleyin. Hücreleri plaka yüzeyine yapışmasını sağlamak için 60 dakika boyunca karbondioksit olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede plaka kuluçka. Metin protokolünde belirtildiği gibi karşılık gelen test orta 10X konsantrasyonda mitokondriyal fonksiyon tsay için bileşikler hazırlayın.A limanına 50 mikrolitre SHAM, B limanına 50 mikrolitre Oligomisin, C limanına 62 mikrolitre potasyum siyanür ve 68 mikrolitre Antimisin A'yı port D.Next'e ekleyin, metprotokolde belirtildiği gibi ilgili test te 10X konsantrasyonunda glikolitik stres analizi için bileşikleri hazırlayın. A limanına 50 mikrolitre glikoz, B limanına 55 mikrolitre Oligomisin, C limanına 62 mikrolitre 2-DG ve 68 mikrolitre Antimisin A'yı port D.Before porta ekleyin, ekstra akı analizörü açın ve tahmin sihirbazı sekmesini kullanarak analiz şablonu ayarlayın. Adım adım yönergeleri izleyin ve kurulum sırasında ortaya çıkan tüm bilgileri doldurun.Bir grup düzeni oluşturun ve metin protokolünde belirtildiği gibi protokolü ayarlayın. Bu düzenleri tramadan önce kaydedin. Tarama sırasında, ilgili dosyayı test sihirbazı sekmesinde açık dosya seçeneğinde açarak kaydedilen protokolü geri yükleyin.Daha sonra 10X bileşikleri, kalibrant içeren sulu sensör kartuşu ilgili portlarına yükleyin. Sensör kartuşunu ekstra akı analizörünün taşıyıcı tepsisine yükleyin. Ekrandaki başlat düğmesine tıklayarak kalibrasyonu başlatın.Daha sonra, son hacmi 450 mikrolitreye çıkaran hücre bozulmasını en aza indirmek için duvarların yan tarafındaki hücre plakasına 350 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Kalibrant içeren yardımcı plakayı, kalıtım plakası ile değiştirin ve taramaya devam edin. Tsama tamamlandıktan sonra sensör kartuşu ve plakayı çıkarın.Dosyayı uygun hedef klasörüne kaydedin. Bu çalışmada, C albicans biyo-enerjik fonksiyonları ekstra akı analizörü tarafından değerlendirilir. Mitokondriyal protein mam33'ten yoksun bir mutant, mitokondriyal proteinin oksijen tüketimi ve hücre dışı asitleşme oranları üzerindeki etkilerini incelemek için tamamlayıcı suşuyla birlikte dahildir.C albicans yabani türü herhangi bir ekstrasellüler akı tsay için en uygun aralık içinde de dakikada 145 pikomoles bir oksijen tüketim oranı gösterir. Yabani tip, mam33 mutant ve mam33 tamamlayıcı suşları bazal oksijen tüketim oranı hiçbir fark göstermektedir. Benzer şekilde, suşlar arasında bazal ekstrasellüler asitleşme oranlarında anlamlı bir fark görülmez.Ancak, potasyum siyanür ile kompleks-IV inhibe ederek, yabani tip ve mam33 mutant, mam33 tamamlayıcı suşları glikolizine doğru önemli bir kayma göstermektedir. Mam33 mutant suşu ancak bileşik-IV bağımlı yolu bu zorlanma bozulmuş olduğunu düşündüren bir telafi glikolitik değişim göstermek için başarısız oldu. Glikolitik stres testinde hücreler bir saat boyunca glikozdan yoksun kalınır ve bazal oksijen tüketim hızı ve ekstrasellüler asitleşme oranı ölçülür.Açlık üzerine, mam33 mutant suşu diğer suşlara göre önemli ölçüde daha düşük oksijen tüketimi ve ekstrasellüler asitleşme oranları göstermektedir. Bu hücreler açlık durumuna zorlandığında hem solunum hem de glikoliz için glikoz kullanımının bozulduğunu düşündürmektedir. Glikoz enjekte ettikten sonra, tüm suşlar hem oksijen tüketim hızı hem de hücre dışı asitleşme oranının uyarılmasını gösterir.Asay makinasının kaplaması, Candida albicans hücrelerinin plakaya yapışmasını sağlar. Candida albicans hücrelerinin uygunsuz yapışması, sonuç sonucunu etkileyecektir. Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra, fizyolojik ve patolojik durumlarda mitokondrinin nasıl işlediğini ele alan çok çeşitli hücre tipleri ve hastalıklarında kullanılmaktadır.Örneğin, bu testte hasta kaynaklı ve kontrol hücreleri istihdam, mitokondriyal fonksiyonun nasıl değiştirildiğine ilgili belirli soruları ele almak mümkündür. Bu bileşikler son derece zehirli olduğu için potasyum siyanür ve antimisin A gibi mitokondriyal inhibitörleri hazırlanırken dikkatli olunmalıdır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

Gerçek zamanlı fMRI Biofeedback Kirlilik Anksiyete orbitofrontal korteks Hedefleme

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Hareket Performans Gerçek zamanlı geri bildirim ile yeniden eğitimi

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Kemoterapi kaynaklı Vasküler Toksisite - Gerçek zamanlı<em&gt; In vivo</em&gt; Gemi Düşüklüğü Görüntüleme

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...