Name: the galleria mellonella waxworm infection model for disseminated candidiasis
Uploaded: 2018-11-17T15:00:00
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Gli autori desidera ringraziare l'assistenza di Pamela Washington e Leah Anderson nell'ottenere Galleria mellonella per uso in questo studio.

Tutti i metodi descritti si basano sull'impiego di invertebrati marini padroni di casa e non richiedono l'approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).
1. galleria mellonella Waxworm larve
<ol><li>Larve di ordine da grossisti e fornitori che non introducono ormoni, antibiotici o altri trattamenti per le larve e che sono in grado di spedire e consegnare esemplari vivi.<ol>
<li>Essere sicuri di acquistare tutte le larve dallo stesso fornitore nel corso della sperime...

<ol>
	<li>Kauffman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+multicenter+surveillance+study+of+funguria+in+hospitalized+patients.+The+National+Institute+for+Allergy+and+Infectious+Diseases+(NIAID)+Mycoses+Study+Group.">Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group.</a> Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).</li><li>Horn, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+candidemia+in+2019+patients:+data+from+the+prospective+antifungal+therapy+alliance+registry.">Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry.</a> Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).</li><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+invasive+candidiasis:+a+persistent+public+health+problem.">Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem.</a> Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).</li><li>Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+candidiasis.">Animal models for candidiasis.</a> Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).</li><li>Heymann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+siderophore+iron+transporter+of+Candida+albicans+(Sit1p/Arn1p)+mediates+uptake+of+ferrichrome-type+siderophores+and+is+required+for+epithelial+invasion.">The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).</li><li>Priest, S. J., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Virulence-Related+Phenotypes+in+Candida+Species+of+the+CUG+Clade.">Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade.</a> Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).</li><li>Savage, D. C., Dubos, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+indigenous+yeast+in+the+murine+stomach.">Localization of indigenous yeast in the murine stomach.</a> J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).</li><li>Ewbank, J. J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+model+host+and+tool+for+antimicrobial+drug+discovery.">C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).</li><li>Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+virulence+of+Candida+albicans+transcription+factor+mutants+using+Galleria+mellonella+and+mouse+infection+models.">Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).</li><li>Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Galleria+mellonella+as+a+model+organism+to+study+Legionella+pneumophila+infection.">Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).</li><li>Jacobsen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+as+a+model+host+to+study+virulence+of+Candida.">Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida.</a> Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).</li><li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Hirakawa, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+intra-species+variation+in+Candida+albicans.">Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans.</a> Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).</li><li>Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+accompanies+gene+family+expansion+of+MED2+homologs+in+Candida+albicans.">Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans.</a> PLoS Genetics. 14 (4), (2018).</li><li>Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluconazole+Pharmacokinetics+in+Galleria+mellonella+Larvae+and+Performance+Evaluation+of+a+Bioassay+Compared+to+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Hemolymph+Specimens.">Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).</li><li>Mesa-Arango, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-mammalian+host+Galleria+mellonella+can+be+used+to+study+the+virulence+of+the+fungal+pathogen+Candida+tropicalis+and+the+efficacy+of+antifungal+drugs+during+infection+by+this+pathogenic+yeast.">The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast.</a> Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).</li><li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae.">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li><li>Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+using+Galleria+mellonella+as+a+model+host+to+study+fungal+pathogenesis.">Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis.</a> Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).</li><li>Kavanagh, K., Fallon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+larvae+as+models+for+studying+fungal+virulence.">Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence.</a> Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).</li><li>Legrand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygosity+at+the+MTL+locus+in+clinical+strains+of+Candida+albicans:+karyotypic+rearrangements+and+tetraploid+formation.">Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation.</a> Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).</li><li>Lockhart, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Candida+albicans,+white-opaque+switchers+are+homozygous+for+mating+type.">In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type.</a> Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).</li><li>Miller, M. G., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White-opaque+switching+in+Candida+albicans+is+controlled+by+mating-type+locus+homeodomain+proteins+and+allows+efficient+mating.">White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating.</a> Cell. 110 (3), 293-302 (2002).</li><li>Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterozygosity+of+genes+on+the+sex+chromosome+regulates+Candida+albicans+virulence.">Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence.</a> Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRE5+gene+null+mutant+strains+of+Candida+albicans+are+avirulent+and+have+altered+cell+wall+composition+and+hypha+formation+properties.">KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties.</a> Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).</li><li>Hall, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mnn2+mannosyltransferase+family+modulates+mannoprotein+fibril+length,+immune+recognition+and+virulence+of+Candida+albicans.">The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+in+Galleria+mellonella+hemocytes:+identification+of+proteins+homologous+to+the+NADPH+oxidase+complex+of+human+neutrophils.">Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Sequence+of+Galleria+mellonella+(Greater+Wax+Moth).">Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth).</a> Genome Announcements. 6 (2), (2018).</li><li>Krappmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lightning+up+the+worm:+How+to+probe+fungal+virulence+in+an+alternative+mini-host+by+bioluminescence.">Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence.</a> Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).</li><li>Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+Candida+auris:+'new+kid+on+the+block'+in+hospital-associated+infections.">Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections.</a> Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).</li><li>Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+a+Gaussia+princeps+Luciferase+reporter+system+in+Candida+albicans+for+in+vivo+detection+in+the+Galleria+mellonella+infection+model.">Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model.</a> Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).</li></ol>

Il modello di waxworm g. mellonella si pone come strumento efficace per l'analisi rapida e riproducibile di virulenza di albicans del c. . Questo protocollo dettagliato si basa sulla distribuzione uniforme di una dose infettiva definita allo stesso sito attraverso un batch delle larve. Dose infettiva ha un profondo impatto sulla mortalità mellonella g. considerando che l'uso di larve tra loro arrivo iniziale e dieci giorni dal ricevimento prodotto risultati simili. Perdita dell'allele c. a...

Specie di candida sono comuni commensals umano che sono in grado di emergendo come patogeni opportunisti in severamente immunocompromised e dysbiotic pazienti. Sebbene molte specie di Candida possono causare malattia, c. albicans è la causa più prevalente di candidosi diffusa1,2. Malattia sistemica deriva da c. albicans l'accesso nella circolazione sanguigna tramite entrambi penetrazione diretta delle barriere restrittive precedentemente ospite o introduzione presso siti chirurgici e altre violazioni del corpo3. Candida specie utilizzano una gamma di processi patogeni per causare la malattia sistematica all'interno dell'ospite tra cui filamentazione, formazione di biofilm, l'evasione delle cellule immuni e fuga e ferro lo scavenging4. Esistono in vitro approcci per studiare i meccanismi patogeni individuali, ma modelli animali continuano a fornire la migliore opzione per indagare l'interezza di malattia risultato5,6. La ricerca precedente ha dettagliato molte istanze della promettente indagini in vitro della virulenza non riuscendo a riprodurre in vivo7,8. Così, modelli animali sono ancora necessari per valutare la virulenza in vivo. Maggior parte dei modelli di malattia si basano sui topi per servire come un surrogato per le infezioni umane nonostante albicans del c. impossibilità di colonizzare naturalmente sistemi murini come un commensale9. Invertebrati marini modelli della candidosi diffusa includono il nematode Caenorhabditis elegans, il frutto per volare Drosophila melanogastere la waxworm Galleria mellonella, anche se le preoccupazioni circa le differenze fondamentali in fisiologia di base, le temperature del corpo ospite e vie di esposizione hanno ostacolato la loro vasta accettazione10,11.
Più recentemente, è stato adottato il modello di infezione di waxworm g. mellonella alla patogenicità di modello di una vasta gamma di patogeni batterici e fungini12,13,14. Vantaggi di questo modello includono la relativamente basso costo, una maggiore produttività, facilitano d'uso e ridotto preoccupazioni etiche per quanto riguarda animali beneficenza rispetto ai modelli murini. Per i ricercatori, questo si traduce in una maggiore possibilità di testare più variabili, gli intervalli di confidenza più forti, più rapida sperimentazione e bypass dei protocolli degli animali. G. mellonella ha servito come una piattaforma per valutare rapidamente la virulenza di albicans del c. dopo perturbazione dei geni richiesti per regolamento di formazione, FILAMENTAZIONE e gene di biofilm in isolati clinici11,15 ,16. Studi recenti hanno incorporato indagine dell'efficacia antifungina tramite mellonella g. per valutare la farmacocinetica di attività della droga e resistenza sotto impostazioni di in vivo , che sono altrimenti impegnativo e richiede tempo 17,18. Ancora, gli studi della virulenza dei albicans del c. di g. mellonella hanno stati complicati da riferito alti livelli di variazione all'interno di esperimenti e protocolli incoerenti tra gruppi di ricerca che producono differenti fenotipi di virulenza tra topi e waxworms11,13,19,20,21. Qui, descriviamo un protocollo mellonella g. per standardizzare i albicans del c. infezioni, aumento riproducibilità in esperimenti di virulenza e dimostrare la coerenza con gli studi precedentemente descritti della virulenza di murino modelli.
Gli studi precedenti hanno dimostrato che la c. albicans accoppiamento tipo-come (MTL) locus sul cromosoma 5 regola della microcella e accoppiamento competenza simile a Saccharomyces cerevisiae e altri di funghi ascomiceti22. La maggior parte degli isolati di c. albicans è eterozigotica del locus MTL , codifica uno di ciascuno degli MTLun e MTLα alleli (MTLun/α) e è di conseguenza sterile15, 23 , 24. perdita di uno degli alleli MTL attraverso la perdita di eterozigosi (LOH) o mutazione conduce ad omozigotica MTLun o ceppi α MTLche possono subire un interruttore fenotipico dello stato sterile 'bianco' per la accoppiamento di stato competente 'opaque'25. Il lavoro precedente ha evidenziato che la perdita di eterozigosi MTL riduce anche virulenza in modelli murini di infezione sistemica per il ceppo diverso sfondi26. Qui, abbiamo dettaglio il modello di g. mellonella per candidosi diffusa utilizzando un set sperimentale geneticamente simile per rappresentare il contributo di eterozigosi MTL alla virulenza in g. mellonella. Mostriamo che configurazione MTL influenzato albicans del c. patogenicità, dove MTLα ceppi erano meno virulenti rispetto al MTLun/α sia MTLun celle, simile ai risultati all'interno di infezione murina modello26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="853">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Galleria mellonella</td>
			<td style="width:140px;">Snackworms.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Buy twice as many worms as expected to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish, 100X15 mm, 500 pack</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97062-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Ethanol absolute, &#8805;99.5% pure, 500 mL</td>
			<td style="width:140px;">Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:427px;">autoclaved ddH2O</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the galleria mellonella waxworm infection model for disseminated candidiasis

Specie di candida sono comuni fungine commensals degli esseri umani colonizzando superfici mucose, pelle e tratto gastrointestinale. In determinate condizioni, la Candida può Erbaiuto loro nicchie naturali conseguente debilitante infezioni delle mucose come bene come pericolose infezioni sistemiche, che sono degli obiettivi principali di indagine a causa di loro associati alti tassi di mortalità. Modelli animali di infezione diffusa esistano per studiare la progressione della malattia e le caratteristiche di patogenicità di Candida di dissezione. Di questi, il modello di infezione waxworm Galleria mellonella fornisce un conveniente strumento sperimentale per le indagini di alto-rendimento di virulenza sistemica. Molti altri agenti infettivi batterici ed eucariotici sono state studiate in modo efficace in g. mellonella capire patogenicità, che lo rende un sistema di modello ampiamente accettato. Eppure, variazione nel metodo utilizzato per infettare g. mellonella può alterare i risultati fenotipici e complicare l'interpretazione dei risultati. Qui, descriviamo i vantaggi e svantaggi del modello waxworm per studiare la patogenesi di Candida sistemica e un approccio per migliorare la riproducibilità di dettaglio. I nostri risultati selezionare l'intervallo di cinetica di mortalità in g. mellonella e descrivono le variabili che possono modulare questi cinetica. In definitiva, questo metodo si pone come un approccio etico, rapido e conveniente per lo studio di virulenza in un modello della candidosi diffusa.

Qui, dimostriamo un metodo riproducibile per l'uso di waxworms g. mellonella per studiare un modello di candidosi diffusa di infezione usando c. albicans. Il deposito appropriato, la manutenzione e la selezione delle larve per infezione sono una componente fondamentale di assicurare la riproducibilità della mortalità mellonella g. (Figura 1A). Larve sane che sono attive, hanno una luce di colore giallo/tan, e patc...

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The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serve come un modello di invertebrati marini per candidosi diffusa. Qui, abbiamo dettaglio l'infezione protocollo e fornire dati di supporto per l'efficacia del modello.

Il modello di infezione del Waxworm di Galleria mellonella per candidosi disseminata

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo Candida sulla virulenza del ceppo e sui contributi di geni specifici a questi processi. I principali vantaggi di questa tecnica sono che evita preoccupazioni per quanto riguarda l'uso degli animali, è robusto, veloce, economico e fornisce un alto numero di animali per esperimento. In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo probabilmente avranno difficoltà un po 'perché avranno qualche difficoltà a valutare la vitalità del worm prima dell'inizio dell'esperimento o potrebbero avere alcuni problemi con l'iniezione incoerente dei worm.Ordina larve da grossisti e fornitori che non introducono ormoni, antibiotici o altri trattamenti alle larve e che sono in grado di spedire e consegnare campioni vivi. Quando arrivano le larve, controlla ogni contenitore per confermare la salute e la vitalità delle larve. Le larve sane saranno completamente sommerse sotto la biancheria da letto, muovendosi e possedendo una colorazione gialla e marrone chiaro con poche larve contenenti segni neri o scolorimenti lungo il corpo.Le larve possono essere conservate nei loro contenitori in uno spazio ventilato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane. Per preparare le cellule di lievito per l'infezione da Galleria mellonella, far crescere i ceppi di C.albicans da iniettare durante la notte in tre millilitri di brodo fresco di lievito-peptone-destrosio per ceppo in tubi di coltura standard su un tamburo rotante a media velocità e 30 gradi Celsius. La mattina seguente, raccogliere le cellule per centrifugazione e lavare il lievito tre volte in cinque millilitri di PBS fresco per centrifugazione.Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare le cellule in un millilitro di PBS fresco e trasferire il lievito in un tubo di microcentrifugo. Diluire serialmente le cellule in PBS aggiuntivo a una-100, uno a 1.000 e una a 100.000 concentrazioni e contare le cellule da una a 100 e una a 1.000 diluizioni. Regolare le cellule a un 2,5 per 10 alla settima parte per millilitro della concentrazione di PBS in un nuovo tubo di microcentrifugo e confermare l'accuratezza della dose infettiva placcando il volume appropriato della diluizione da uno a 100.000 per ottenere 100 unità di formazione di colonie su una piastra di agar lievito-peptone-destrosio per ogni coltura da utilizzare nell'infezione.Per infettare le larve con le cellule Candida, prima stendere una piccola quantità di lettiera di waxworm in una piastra di Petri sterile vuota da 100 per 15 centimetri per replica biologica e sterilizzare una siringa da 10 microlitri dotata di un ago a 26 calibro tre volte con 10 microlitri di etanolo al 70% e tre volte con 10 microlitri di PBS per lavaggio. Successivamente, vortice la diluizione di inoculazione di C.albicans, e caricare 10 microlitri di cellule nella siringa. Apri un contenitore di larve di G.mellonella e usa un dito per capovolgire attentamente la biancheria da letto per scoprire le larve, selezionando larve gialle e abbronzate di dimensioni simili che sono in buona salute con una mancanza di pigmentazione nera sui corpi, usando le dita centrali e indice e il pollice per raccogliere una larva in un modo simile a afferrare una matita.Arrotolare la larva sulla schiena in modo che le gambe siano rivolte verso l'alto, tenendo l'intera lunghezza del corpo tra le dita e il pollice in modo che la larva non sia in grado di arricciarsi o allontanarsi dall'iniezione. Con l'altra mano, ruotare la siringa in modo che la smussatura dell'ago sia rivolta verso l'alto e inserire lentamente l'intera lunghezza della smussatura nel corpo alla giunzione con la gamba sinistra più arretrata, assicurando che l'ago penetri nel corpo e non spingi semplicemente il corpo della larva verso l'interno. Il passaggio più critico in questa procedura è l'iniezione del waxworm in modo tale che il danno al corpo larvale sia ridotto al minimo e il bolo pieno sia inoculato.Quindi iniettare i 10 microlitri completi di Candida inoculo ed estrarre l'ago. Co-ospita fino a 10 larve iniettate dalla stessa coltura di Candida in ogni piastra di Petri di 100 per 15 millimetri dopo l'inoculazione e incuba la larva a 37 gradi Celsius per otto giorni. Controlla i piatti ogni 24 ore per monitorare la morte.La mortalità può inizialmente essere valutata dalla pigmentazione oscurata, dalla formazione di macchie o corpi neri e dalla mancanza di movimento. Per confermare la mortalità, usa le pinzette per rotolare delicatamente le larve moribonda sulla schiena e colpire leggermente la parte inferiore della larva con le pinzette. Le larve che iniziano a impuparsi nelle tarme possono essere incluse nell'analisi ma dovrebbero essere rimosse se iniziano a muta.Non esiste alcuna differenza significativa nella cinetica della morte di G.mellonella tra larve infette zero o 10 giorni dopo l'arrivo. I segni caratteristici della malattia sorgono nelle larve di entrambe le età che soccombono all'infezione, a partire dallo scolorimento che lascia il posto alle macchie nere prima di una totale perdita di motilità e infine della morte. L'infezione da C.albicans accelera questo processo di scolorimento e morbilità, ma non altera significativamente la cascata di marcatori fenotipici che portano alla morte rispetto alle larve non infette o iniettate da PBS.In particolare, l'infezione di G.mellonella con omo-o eterozigoti simili ad accoppiamento da uno qualsiasi dei ceppi di C.albicans clinicamente isolati testati produce alti tassi di mortalità rispetto agli animali iniettati da PBS, mentre le iniezioni di ceppi derivati prototrofici attenuano l'effetto letale in questo modello. È importante ricordare di scegliere larve sane e di essere gentili nel maneggiare le larve. Se più ceppi verranno inoculati, fare attenzione a non lasciare che le cellule Candida si sieda nel PBS per troppo tempo.Seguendo questa procedura, altri metodi come la profilazione immunologica e la localizzazione di Candida all'interno delle larve possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sulle interazioni tra l'ospite e l'agente patogeno fungino durante un'infezione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la patogenesi di Candida utilizzando formati ad alta produttività. Non dimenticare che lavorare con Candida albicans richiede attenzione e che le precauzioni standard, inclusa l'usura delle attrezzature di protezione personale, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

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The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

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L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

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