Name: the galleria mellonella waxworm infection model for disseminated candidiasis
Uploaded: 2018-11-17T15:00:00
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Os autores gostaria de reconhecer a ajuda de Pamela Washington e Leah Anderson na obtenção de Galleria mellonella para uso neste estudo.

Todos os métodos descritos dependem do uso de hospedeiros invertebrados e não requerem aprovação institucional Cuidado Animal e usar Comité (IACUC).
1. larvas de Waxworm galleria mellonella
<ol><li>Ordem de larvas de atacadistas e fornecedores que não introduza hormonas, antibióticos ou outros tratamentos para as larvas e que são capazes de enviar e entregar espécimes vivos.<ol>
<li>Certifique-se de comprar todas as larvas do mesmo fornecedor durante o curso da experimenta?...

<ol>
	<li>Kauffman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+multicenter+surveillance+study+of+funguria+in+hospitalized+patients.+The+National+Institute+for+Allergy+and+Infectious+Diseases+(NIAID)+Mycoses+Study+Group.">Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group.</a> Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).</li><li>Horn, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+candidemia+in+2019+patients:+data+from+the+prospective+antifungal+therapy+alliance+registry.">Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry.</a> Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).</li><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+invasive+candidiasis:+a+persistent+public+health+problem.">Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem.</a> Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).</li><li>Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species:+current+epidemiology,+pathogenicity,+biofilm+formation,+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options.">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).</li><li>Segal, E., Frenkel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+in+Vivo+Models+of+Candidiasis.">Experimental in Vivo Models of Candidiasis.</a> J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).</li><li>Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+candidiasis.">Animal models for candidiasis.</a> Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).</li><li>Heymann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+siderophore+iron+transporter+of+Candida+albicans+(Sit1p/Arn1p)+mediates+uptake+of+ferrichrome-type+siderophores+and+is+required+for+epithelial+invasion.">The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).</li><li>Priest, S. J., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Virulence-Related+Phenotypes+in+Candida+Species+of+the+CUG+Clade.">Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade.</a> Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).</li><li>Savage, D. C., Dubos, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+indigenous+yeast+in+the+murine+stomach.">Localization of indigenous yeast in the murine stomach.</a> J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).</li><li>Ewbank, J. J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+model+host+and+tool+for+antimicrobial+drug+discovery.">C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).</li><li>Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+virulence+of+Candida+albicans+transcription+factor+mutants+using+Galleria+mellonella+and+mouse+infection+models.">Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).</li><li>Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Galleria+mellonella+as+a+model+organism+to+study+Legionella+pneumophila+infection.">Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).</li><li>Jacobsen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+as+a+model+host+to+study+virulence+of+Candida.">Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida.</a> Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).</li><li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Hirakawa, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+intra-species+variation+in+Candida+albicans.">Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans.</a> Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).</li><li>Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+accompanies+gene+family+expansion+of+MED2+homologs+in+Candida+albicans.">Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans.</a> PLoS Genetics. 14 (4), (2018).</li><li>Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluconazole+Pharmacokinetics+in+Galleria+mellonella+Larvae+and+Performance+Evaluation+of+a+Bioassay+Compared+to+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Hemolymph+Specimens.">Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).</li><li>Mesa-Arango, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-mammalian+host+Galleria+mellonella+can+be+used+to+study+the+virulence+of+the+fungal+pathogen+Candida+tropicalis+and+the+efficacy+of+antifungal+drugs+during+infection+by+this+pathogenic+yeast.">The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast.</a> Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).</li><li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae.">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li><li>Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+using+Galleria+mellonella+as+a+model+host+to+study+fungal+pathogenesis.">Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis.</a> Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).</li><li>Kavanagh, K., Fallon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+larvae+as+models+for+studying+fungal+virulence.">Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence.</a> Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).</li><li>Legrand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygosity+at+the+MTL+locus+in+clinical+strains+of+Candida+albicans:+karyotypic+rearrangements+and+tetraploid+formation.">Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation.</a> Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).</li><li>Lockhart, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Candida+albicans,+white-opaque+switchers+are+homozygous+for+mating+type.">In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type.</a> Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).</li><li>Miller, M. G., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White-opaque+switching+in+Candida+albicans+is+controlled+by+mating-type+locus+homeodomain+proteins+and+allows+efficient+mating.">White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating.</a> Cell. 110 (3), 293-302 (2002).</li><li>Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterozygosity+of+genes+on+the+sex+chromosome+regulates+Candida+albicans+virulence.">Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence.</a> Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRE5+gene+null+mutant+strains+of+Candida+albicans+are+avirulent+and+have+altered+cell+wall+composition+and+hypha+formation+properties.">KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties.</a> Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).</li><li>Hall, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mnn2+mannosyltransferase+family+modulates+mannoprotein+fibril+length,+immune+recognition+and+virulence+of+Candida+albicans.">The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+in+Galleria+mellonella+hemocytes:+identification+of+proteins+homologous+to+the+NADPH+oxidase+complex+of+human+neutrophils.">Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Sequence+of+Galleria+mellonella+(Greater+Wax+Moth).">Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth).</a> Genome Announcements. 6 (2), (2018).</li><li>Krappmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lightning+up+the+worm:+How+to+probe+fungal+virulence+in+an+alternative+mini-host+by+bioluminescence.">Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence.</a> Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).</li><li>Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+Candida+auris:+'new+kid+on+the+block'+in+hospital-associated+infections.">Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections.</a> Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).</li><li>Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+a+Gaussia+princeps+Luciferase+reporter+system+in+Candida+albicans+for+in+vivo+detection+in+the+Galleria+mellonella+infection+model.">Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model.</a> Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).</li></ol>

O modelo de waxworm g. mellonella permanece como uma ferramenta eficaz para a análise rápida e reprodutível de virulência de c. albicans . Este protocolo detalhado baseia-se no momento da entrega consistente de uma dose infecciosa definida para o mesmo site através de um lote de larvas. Dose infecciosa tem um profundo impacto sobre a mortalidade mellonella g. Considerando que a utilização de larvas entre sua chegada inicial e dez dias após a recepção produziu resultados semelhantes. P...

Espécies de Candida são comensais humanas comuns que são capazes de emergir como patógenos oportunistas em severamente imunocomprometidos e pacientes disbióticas. Embora muitas espécies de Candida podem causar doença, c. albicans é a causa mais prevalente de candidíase disseminada1,2. Doença sistêmica resulta da c. albicans acessando na corrente sanguínea através de qualquer penetração directa das barreiras restritivas anteriormente anfitrião ou introdução em sítios cirúrgicos e outras violações do corpo3. Espécies de Candida utilizam uma variedade de processos patogênicos para causar doença sistêmica dentro do host, incluindo filamentação, formação de biofilmes, evasão de células imunes e fuga e ferro4de eliminação. Existem em vitro abordagens para investigar mecanismos patogénicos individuais, mas modelos animais continuam a fornecer a melhor opção para investigar a totalidade do resultado de doença5,6. Pesquisas anteriores detalhou muitas instâncias do promissor em vitro investigações de virulência falhando reproduzir na vivo7,8. Assim, modelos animais ainda são necessários para avaliar a virulência in vivo. A maioria dos modelos da doença dependem de ratos para servir como um substituto para infecções humanas apesar da incapacidade de c. albicans naturalmente colonizar sistemas murino como um comensal9. Modelos de invertebrados de candidíase disseminada incluem o nematódeo Caenorhabditis elegans, a fruta voa melanogaster da drosófilae o waxworm Galleria mellonella, embora as preocupações sobre diferenças fundamentais em fisiologia básica, a temperatura do corpo hospedeiro e rotas de exposição têm dificultado sua ampla aceitação10,11.
Mais recentemente, foi adotado o modelo de infecção de waxworm g. mellonella a patogenicidade de modelo de uma vasta gama de patógenos bacterianos e fúngicos12,13,14. Vantagens deste modelo incluem sua taxa de transferência de custo relativamente baixo, maior facilidade de uso e reduziram as preocupações éticas sobre animal beneficência em relação aos modelos de murino. Para os pesquisadores, isso se traduz em maior capacidade de testar várias variáveis, intervalos de confiança mais fortes, mais rápida experimentação e desvio dos protocolos de animais. G. mellonella tem servido como uma plataforma para avaliar rapidamente a virulência de c. albicans após perturbação de genes necessários para regulamento de gene, filamentação e formação de biofilme em isolados clínicos11,15 ,16. Estudos recentes têm incorporado a investigação da eficácia antifúngica usando mellonella g. para avaliar a farmacocinética da droga atividade e resistência sob configurações na vivo , que são outro modo desafiador e demorado 17,18. Ainda, estudos de virulência de c. albicans em g. mellonella tem sido complicados por alegadamente altos níveis de variação dentro de experiências e protocolos inconsistentes entre grupos de pesquisa que produzem diferentes fenótipos de virulência entre ratos e waxworms11,13,19,20,21. Aqui, nós esboçamos um mellonella g. protocolo para padronizar a reprodutibilidade de aumento de infecções, de c. albicans em experimentos de virulência e demonstrar coerência com o descrito anteriormente estudos de virulência em murino modelos.
Estudos anteriores demonstraram que a c. albicans acasalamento como tipo (MTL) locus no cromossomo 5 regula a identidade da célula e competência semelhante ao Saccharomyces cerevisiae e outros de fungos ascomicetes22de acasalamento. A maioria dos isolados de c. albicans é heterozigota para o locus MTL , codificação um de cada dos MTLum e MTLα alelos (MTLum/α) e é consequentemente estéril15, 23 , 24. a perda de um dos alelos MTL através da perda de heterozigosidade (LOH) ou mutação leva à homozigotos MTLuma MTLα estirpes ou podem sofrer uma mudança fenotípica do estado estéril 'branco' para a acasalamento de Estado competente 'opaco'25. Trabalhos anteriores evidenciou que a perda de heterozigosidade MTL também reduz virulência em modelos murino de infecção sistêmica através de tensão diferentes origens26. Aqui, detalhamos o modelo g. mellonella para candidíase disseminada, usando um conjunto experimental geneticamente semelhante para retratar o contributo da heterozigosidade MTL de virulência em mellonella g.. Mostramos que a configuração de MTL influenciado patogenicidade de c. albicans , onde cepas MTLα foram menos virulentas em relação tantoum/α MTLe MTLuma células, semelhantes às conclusões dentro de modelo murino de infecção26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="853">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Galleria mellonella</td>
			<td style="width:140px;">Snackworms.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Buy twice as many worms as expected to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish, 100X15 mm, 500 pack</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97062-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Ethanol absolute, &#8805;99.5% pure, 500 mL</td>
			<td style="width:140px;">Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:427px;">autoclaved ddH2O</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the galleria mellonella waxworm infection model for disseminated candidiasis

Espécies de Candida são comensais fungos comuns dos seres humanos colonizando a pele, mucosas e trato gastrointestinal. Sob certas condições, a Candida pode overgrow seus nichos naturais resultando em debilitantes infecções da mucosa como infecções sistêmicas bem como risco de vida, que são um grande foco de investigação devido a seus associados altas taxas de mortalidade. Existem modelos animais de infecção disseminada para estudar a progressão da doença e dissecando as características de patogenicidade da Candida . Destes, o modelo de infecção waxworm Galleria mellonella fornece uma ferramenta de experimental cost-effective para investigações de alta produtividade de virulência sistêmica. Muitos outros agentes infecciosos bacterianos e eukaryotic têm sido efetivamente estudados em mellonella g. para entender a patogenicidade, tornando-se um sistema de modelo amplamente aceito. Ainda, variação no método usado para infectar mellonella g. pode alterar os resultados fenotípicos e complicar a interpretação dos resultados. Aqui, podemos descrever os benefícios e as desvantagens do modelo waxworm para estudar a patogênese de Candida sistêmica e uma abordagem para melhorar a reprodutibilidade de detalhe. Nossos resultados destacam a variedade de cinética de mortalidade em g. mellonella e descrevem as variáveis que podem modular esses cinética. Em última análise, este método permanece como uma abordagem ética, rápida e econômica para estudar a virulência em um modelo de candidíase disseminada.

Aqui, vamos demonstrar um método reprodutível para o uso de waxworms g. mellonella para investigar um modelo de candidíase disseminada de infecção usando c. albicans. O armazenamento adequado, manutenção e seleção de larvas para infecção são um componente crítico do garantindo a reprodutibilidade em mellonella g. mortalidade (Figura 1A). As larvas saudáveis que estão ativas, têm uma luz cor de amarel...

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The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serve como um modelo de invertebrados para candidíase disseminada. Aqui, detalhamos a infecção do protocolo e fornecer dados de apoio para a eficácia do modelo.

O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da Candida sobre a virulência da tensão e as contribuições de genes específicos para esses processos. As principais vantagens dessa técnica são que ela evita preocupações com o uso de animais, é robusta, rápida, barata e proporciona um alto número de animais por experimento. De um modo geral, indivíduos que são novos neste método provavelmente lutarão um pouco porque terão alguma dificuldade em avaliar a viabilidade dos vermes antes do início do experimento ou podem ter alguns problemas com a injeção inconsistente dos vermes.Peça larvas de atacadistas e fornecedores que não introduzem hormônios, antibióticos ou outros tratamentos às larvas e que são capazes de enviar e entregar espécimes vivos. Quando as larvas chegarem, verifique cada recipiente para confirmar a saúde e viabilidade das larvas. Larvas saudáveis ficarão completamente submersas sob a cama, movendo-se e possuindo uma coloração amarela e bronzeada com poucas larvas contendo marcas pretas ou descolorações ao longo do corpo.As larvas podem ser armazenadas em seus recipientes em um espaço ventilado à temperatura ambiente por até duas semanas. Para preparar as células de levedura para a infecção pela Galleria mellonella, cresça as cepas de C.albicans a serem injetadas durante a noite em três mililitros de caldo fresco de levedura-pepton-dextrose por cepa em tubos de cultura padrão em um tambor rotativo a velocidade média e 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, recolham as células por centrifugação, e lavem a levedura três vezes em cinco mililitros de pbs fresco por centorifugação.Após a última lavagem, resuspend as células em um mililitro de PBS fresco e transfira a levedura para um tubo de microcentrifuge. Diluir as células em PBS adicionais em 1-100, 1-1.000, e de uma a 100.000 concentrações, e contar as células das diluições de um a 100 e de um a 1.000. Ajuste as células para uma diluição de 2,5 vezes a sétima células por mililitro de concentração de PBS em um novo tubo de microcentrífuga, e confirme a precisão da dose infecciosa, emplacando o volume apropriado da diluição de um a 100.000 para alcançar 100 unidades formadoras de colônias em uma placa de ágar levedura-peptone-dextrose para cada cultura a ser usada na infecção.Para infectar as larvas com as células Candida, primeiro espalhe uma pequena quantidade de lombriga de cera em uma placa de Petri estéril vazia de 100 por 15 centímetros por réplica biológica, e esterilize uma seringa de 10 microlitres equipada com uma agulha de 26 bitola três vezes com 10 microliters de 70% de etanol e três vezes com 10 microliters de PBS por lavagem. Em seguida, vórtice a diluição inoculação de C.albicans, e carregar 10 microliters de células para a seringa. Abra um recipiente de larvas G.mellonella, e use um dedo para virar cuidadosamente a cama para descobrir larvas, selecionando larvas amarelas e bronzeadas de tamanho semelhante que estão em boa saúde com a falta de pigmentação negra nos corpos, usando os dedos médios e indicadores e o polegar para pegar uma larva de maneira semelhante a agarrar um lápis.Enrole a larva nas costas para que as pernas fiquem voltadas para cima, segurando toda a extensão do corpo entre os dedos e o polegar para que a larva seja incapaz de enrolar ou se afastar da injeção. Por outro lado, gire a seringa para que o chanfrado da agulha esteja voltado para cima, e insira lentamente todo o comprimento do bisel na junção com a perna esquerda mais traseira, garantindo que a agulha penetre o corpo e não empurre simplesmente o corpo da larva para dentro. O passo mais crítico neste procedimento é a injeção da enceguicultura de tal forma que os danos ao corpo larval são minimizados e o bolus completo é inoculado.Em seguida, injete os 10 microliters completos de Candida inoculum, e extraia a agulha. Co-abrigar até 10 larvas injetadas da mesma cultura candida em cada placa de Petri de 100 por 15 milímetros após a inoculação, e incubar a larva a 37 graus Celsius por oito dias. Verifique os pratos a cada 24 horas para monitorar a morte.A mortalidade pode ser inicialmente avaliada pela pigmentação escurecida, pela formação de manchas pretas ou corpos, e pela falta de movimento. Para confirmar a mortalidade, use pinças para rolar suavemente larvas moribundas em suas costas e cutucar levemente a parte inferior da larva com a pinça. Larvas que começam a se transformar em mariposas podem ser incluídas na análise, mas devem ser removidas se começarem a se fundar.Não há diferença significativa na cinética da morte de G.mellonella entre larvas infectadas zero ou 10 dias após a chegada. Os sinais característicos da doença surgem em larvas de ambas as idades que sucumbem à infecção, começando pela descoloração que dá lugar a manchas negras antes de uma perda total de motilidade e eventualmente morte. A infecção por C.albicans acelera esse processo de descoloração e morbidade, mas não altera significativamente a cascata de marcadores fenotípicos que levam à morte em comparação com larvas não infectadas ou injetadas por PBS.Notavelmente, a infecção de G.mellonella com homo-ou heterozygotes tipo acasalamento de qualquer uma das cepas c.albicans clinicamente isoladas testadas produz altas taxas de mortalidade em comparação com animais injetados por PBS, enquanto as injeções de cepas prototróficas derivadas atenuam o efeito letal neste modelo. É importante lembrar de escolher larvas saudáveis e ser gentil no manuseio das larvas. Se várias cepas serão inoculadas, tome cuidado para não deixar as células Candida sentarem-se na PBS por muito tempo.Após esse procedimento, outros métodos como o perfil imunológico e a localização de Candida dentro das larvas podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as interações entre o hospedeiro e o patógeno fúngico durante uma infecção. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a patógena candida usando formatos de alto rendimento. Não se esqueça que trabalhar com candida albicans requer cuidados e que as precauções padrão, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

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O inseto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

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Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

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Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

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Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

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Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

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Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...