Name: a new portable in vitro exposure cassette for aerosol sampling
Uploaded: 2019-02-22T13:00:00
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Les auteurs aimeraient remercier Boris Solomonov et l’atelier d’usinage Virginia Commonwealth Innovation pour aider avec le prototypage rapide de l’appareil. Les auteurs aimeraient également remercier Cristian Romero-Fuentes du groupe Lewinski, Dr Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov et la Virginia Commonwealth nanomatériaux Core caractérisation Facility pour leur aide avec la caractérisation des particules. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage fournis au Dr. Lewinski par la faculté d’ingénierie à la Virginia Commonwealth University.

Les opérateurs doivent porter les équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes) lorsque les étapes 1, 2, 3, 5 et 6.
1. préparation des matériaux
<ol><li>
Préparer du matériel pour l’assemblage du système et l’exposition à assurer la répétabilité.
	<ol>
<li>Assurez-vous d’utilisation nouvelle ou 70 % éthanol nettoyé ¼" diamètre intérieur conducteur tube et ¼" diamètre extérieur connecteurs pour l’assembly system.</li>
		<li>Magas...

Cassettes de filtre fournissent une méthode simple et peu coûteuse de recueillir des aérosols dans la zone de respiration ; Cependant, extraits des filtres des échantillons d’aérosols ne pas représenter l’aérosol entier (gaz, les substances volatiles et particules) et par conséquent limiter l’évaluation des effets biologiques associés. À l’aide de la conception initiale de la cassette de filtre 37 mm, le HONZÁK est conçu pour maintenir la portabilité et imiter la déposition en vivo de par...

Échantillonnage individuel en utilisant des techniques in vitro pourrait fournir des informations complètes concernant les effets biologiques des aérosols sur le lieu de travail. 1 exposition à des contaminants dans l’air inclure l’exposition au produit chimique lui-même, pour les échantillons d’air recueillis, dans des conditions submergées, où le gaz est introduit à la suspension cellulaire, exposition intermittente à l’aide d’un périphérique comme un rocker, ou direct expositions à l’interface air-liquide (ALI). 2 plusieurs de ces techniques sont effectuées avec des cellules cultivées en suspension ou de la collecte d’échantillons avant l’exposition, dont chacun peut affecter l’étude toxicologique à cause de changements potentiels dans l’aérosol. 3 pour éviter ces changements, le laboratoire peut être amené à ce champ en utilisant plusieurs in vitro systèmes d’exposition de la culture ALI qui sont utilisés dans la littérature,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 cependant, peu sont disponibles dans le commerce. 8 , 9 , 12 ces systèmes sont souvent volumineux, surtout quand les instruments pour réguler la température et l’humidité de l’environnement cellulaire et du débit de l’aérosol d’échantillon. En utilisant le HONZÁK, expositions de l’aérosol peuvent être réalisées en dehors d’un paramètre de laboratoire traditionnel ou la zone de respiration en imitant les conditions de l’inhalation.
La détermination de l’aerosol deposition in vitro est importante pour l’étude des effets de santé en raison de l’inhalation. La zone de respiration, la zone de moins de 30 cm de la bouche et le nez,14 est cruciale pour comprendre l’exposition aux nanoparticules et un lien vers les effets biologiques dans les poumons. 2 souvent, les dépôt sur les cellules est défini comme un rendement de dépôts, les particules déposées sur et absorbé par les cellules divisés par les particules administrées au système6,15 , ou sur une base massive des mêmes montants. 4 , 16 les méthodes actuelles pour mesurer les aérosols présents dans la zone de respiration sont filtre basé, capturant les particules sur une période donnée d’échantillonnage en utilisant les filtres de mener des essais supplémentaires. 17 surveillance personnelle nécessite un petit système qui vient avec le compromis de moins d’échantillons.
Il existe de nombreuses approches pour déterminer les effets sur la santé d’une exposition à un aérosol. Le modèle ALI permet l’aérosol à administrer directement aux cellules par l’intermédiaire de l’air comme dans un scénario d’exposition réelle, mais il est plus rentable et moins intensif de temps qu’in vivo études tout en imitant les barrières d’air liquide tels que les yeux, peau et les poumons. Poumon cellules cultivées à l’ILA ont la capacité de générer une couche barrière polarisée,18,19 , qui produit des caractéristiques physiologiques qui ressemblent à l’épithélium de poumon en vivo , y compris la production de mucus et agent tensio-actif en particulier lignées de cellules bronchiques ou alvéolaire, cils,19 des jonctions serrées,19,20 et cellules de polarisation. 18 changements comme ceux-ci peuvent affecter la réponse cellulaire mesurée dans les études de toxicité. 21 en outre, modèle, ALI in vitro résultats sont souvent plus sensibles que les cellules exposées par suspension modèles22 et sont capables de modèle aiguë in vivo toxicité par inhalation. 23 , 24 c’est pourquoi, un système d’exposition ALI qui est capable d’effectuer des mesures au sein de la zone de respiration est une étape naturelle.
En exposant les cellules à aérosols directement à la source d’émission, étude sur les effets de tous les gaz, les composés semi-volatils et particules impliquées dans le mélange se produit. Lorsque le mélange est recueilli sur un filtre, les gaz et les composés volatils ne sont pas capturés et le mélange entier ne peut pas être l’objet d’une enquête. En outre, reconstitution des particules dans une poudre ou une suspension liquide peut conduire à l’agrégation ou interactions particule-fluide, comme la dissolution, en suspension liquide. 25 , 26 lorsque des particules d’aérosol sont ajoutés au liquide, il y a un potentiel plus élevé d’agglomération, formation27 25,de corona de protéines,28 ou interaction avec des composés dans le liquide, qui peut affecter des dépôts et influencer la réponse biologique. 29 , 30
Exposition à l’ILA repose sur trois profils principaux aérosol, nuage des flux parallèles, décantation et écoulement perpendiculaire. Cloud s’installant, utilisé par exposition de cellule pour l’Interface Air-liquide (ALICE),4 est un système de traitement par lots où déposent des particules par gravitation et diffusion s’installer comme l’aérosol est traité comme une seule unité. Les flux parallèle, utilisée par les aérosols électrostatiques in vitro l’exposition système (gouttières)5 et Multiculture exposition chambre (MEC) II,6 permet pour les dépôts par le biais de l’ajout du mouvement brownien par le profil d’écoulement. Écoulement perpendiculaire, utilisé par un microsprayer,7 Nano aérochambre pour toxicité In Vitro (NACIVT),11 et commercial ALI systèmes8,9,10,12, ajoute l’impaction de particules dans la zone de dépôt. Beaucoup de ces systèmes d’exposition sont grands et encombrants, exigeant des systèmes excédentaires pour aérosol pré conditionnement, pompes pour l’écoulement, ou même de chauffage des chambres pour l’incubation des cellules. Cette grande taille diminue la portabilité du système. Au lieu de prélèvement à la source d’émission, ces systèmes ont souvent apportés à des aérosols de laboratoire ou modèle générés pour l’analyse des échantillons. La complexité de l’aérosol émis peut être perdue dans la traduction sur le terrain au laboratoire. Le HONZÁK est plus petit que les systèmes actuels, avec une surface extérieure d’environ 460 cm2 et ne pesant que 60 grammes, avec contrôle thermique et d’humidité intégré dans le système permettant à un périphérique portable. La diminution de taille et le poids permettent au système d’être porté ou prises à la source d’exposition, permettant le prélèvement direct.
La grande taille des systèmes actuels de l’exposition diminue également la capacité d’effectuer l’échantillonnage pour enquêter sur des gradients spatiaux dans les concentrations. Cette résolution est la clé pour déterminer les effets toxicologiques de nombreux risques pour l’environnement et des risques professionnels tels que les activités de matière ou lieu de travail particules d’échappement véhicules où aérosolisation se produit. Immédiatement après émission, il devient une variance spatiale dans la concentration de particules. Cela se développe avec le temps que les particules se dispersent dans l’atmosphère et ces effets peuvent changer selon les conditions ambiantes, tels que température, pression, vent et soleil. Les particules peuvent commencer à l’âge et oxyder ainsi une fois émis31,32 et taux de dispersion sont affectés par la topographie ; On trouvera des concentrations plus élevées dans les canyons et les tunnels, où les effets de dispersion sont ralenties, et des concentrations plus faibles se trouvent là où il y a une grande surface de dispersion. 33 ces changements dans les taux de dispersion peuvent avoir des effets importants sur la santé humaine et peuvent être vu quand on compare le nombre d’asthmatiques adultes vivant en urbain ou en milieu rural. 34 alors que de nombreux systèmes d’exposition fournissent plusieurs échantillons à la fois, plusieurs systèmes sont nécessaires avec une abondance de gros équipements pour effectuer la résolution spatiale.
En apportant le laboratoire sur le terrain, le temps d’analyse peut être diminué en utilisant la cellule entière comme un capteur. Suite de points de terminaison et les mécanismes biologiques connus peut aider à la détermination de la composition des aérosols et de la taille. En raison de méthodes de dégagement lent, y compris la clairance mucociliaire, phagocytose et translocation, ces particules sont souvent en interaction avec les cellules pour quelque jours à semaines3 génératrices de stress oxydatif, l’inflammation et même la mort des cellules. Ces points de terminaison biologiques peuvent être les points de départ pour les voies d’issue défavorable pour les maladies cardiovasculaires ou les maladies pulmonaires obstructives chroniques. En outre, Wiemenn et coll. réalisé un tableau in vitro tests à comparer avec les valeurs de la littérature à court terme en vivo toxicité par inhalation. 35 In vivo la réponse a été prévue avec deux des quatre résultats positifs des tests de cytotoxicité par communiqué de la lactate déshydrogénase, stress oxydatif, de réduction et peroxyde d’hydrogène la formation de glutathion et libération et inflammation potentielle de le gène de facteur de nécrose tumorale alpha. Hors des oxydes métalliques dix taille nano testés, six testées comme active (oxyde de titane, oxyde de zinc et quatre l’oxyde de cérium différents) à l’aide d’expositions in vitro avec confirmation en vivo. 
Afin d’étudier les effets des aérosols dans un milieu professionnel, notre laboratoire a développé le HONZÁK pour des expositions dans le domaine. En outre, le HONZÁK peut être porté pendant l’échantillonnage individuel de surveiller et d’enquêter sur l’exposition par inhalation comme le 37 mm filtre cassette36 ou plusieurs systèmes peuvent être utilisés pour obtenir une résolution spatiale dans une zone donnée. Dans ce protocole, la caractérisation et l’utilisation de la HONZÁK est discutée. Après l’exposition, les effets biologiques sont observés à travers des analyses de cytotoxicité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Scanning mobility particle sizer (SMPS)</td>
			<td>TSI, Inc.</td>
			<td>3910</td>
			<td>NanoSMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical particle sizer (OPS)</td>
			<td>TSI, Inc.</td>
			<td>3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Pipe, 4&#34; Long</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4830K116</td>
			<td>Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass Ball Valve with Lever Handle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4112T12</td>
			<td>Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Pipe, 2&#34; Long</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>7753K121</td>
			<td>Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filter</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>09-744-12</td>
			<td>HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Generator</td>
			<td>PISCO USA</td>
			<td>VCH10-018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIVEC</td>
			<td>VCU</td>
			<td></td>
			<td>For design please contact authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resistive heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; barbed connectors</td>
			<td>Zefon International, Inc.</td>
			<td>459743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous tubing</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc.</td>
			<td>BB2062-1814A</td>
			<td>Hydrophilic 10 um pores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery power bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>353095</td>
			<td>24 well plate insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>13-711-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Fiber Filters</td>
			<td>SKC</td>
			<td>225-7</td>
			<td>Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Micro Balance</td>
			<td>A&#38;D</td>
			<td>BM-22</td>
			<td>Housed in environmental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm filter cassette</td>
			<td>SKC</td>
			<td>225-3250</td>
			<td>Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow vacuum pump</td>
			<td>SKC</td>
			<td>220-5000TC</td>
			<td>AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1090</td>
			<td>40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1088</td>
			<td>100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1117M</td>
			<td>800 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new portable in vitro exposure cassette for aerosol sampling

Ce protocole introduit un nouveau in vitro l’exposition système, pouvant être portés, y compris de sa caractérisation et performance. Systèmes de l’interface air-liquide (ALI) in vitro exposition sont souvent grands et encombrants, rendant le transport au champ et au fonctionnement à la source de l’émission ou la zone de respiration difficile. Grâce à la miniaturisation de ces systèmes, le laboratoire peut être amené au champ, accélérer les temps de traitement et en fournissant une méthode plus appropriée d’exposition qui n’altère pas l’aérosol avant de communiquer avec les cellules. Le Portable In vitro l’exposition Cassette (HONZÁK) s’adapte une cassette de filtre 37 mm pour permettre in vitro des essais de toxicité à l’extérieur du laboratoire traditionnel. Le HONZÁK a été caractérisée à l’aide de trois tailles de nanoparticules de cuivre afin de déterminer l’efficacité de dépôts basée sur gravimétrique et analyse de concentration nombre de particules. Cytotoxicité initiale expériences ont été réalisées avec des cellules pulmonaires exposées afin de déterminer la capacité du système de dépôt des particules tout en préservant la viabilité des cellules. Le HONZÁK offre une efficacité similaire ou une augmentation des dépôts lors de la comparaison d’appareils disponibles écoulement perpendiculaire in vitro d’exposition. Malgré le débit d’échantillon inférieur, la petite taille donne certains avantages au courant in vitro ALI systèmes d’exposition. Il s’agit de la capacité à être portés pour la surveillance personnelle, la mobilité du laboratoire à la source d’émission et l’option de mettre en place plusieurs systèmes de résolution spatiale tout en conservant un utilisateur plus faible coûtent. Le HONZÁK est un système capable de recueillir des aérosols sur le terrain et au sein de la zone de respiration sur un modèle air-relié, in vitro .

Professionnelle in vitro de toxicologie comprend le maintien de la viabilité cellulaire tout en effectuant l’exposition aérosol. Le système HONZÁK est montré dans la Figure 2, y compris la température et contrôle de l’humidité et la HONZÁK usé. La température a été maintenue à l’aide d’un appareil de chauffage résistif alimenté par batterie et l’aérosol humidifié à l’aide d’augmenté humidification naturelle à traver...

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A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Une nouveau Portable In Vitro exposition Cassette pour l’échantillonnage des aérosols

Nous présentons ici un protocole pour effectuer des expositions portable cellulaire aérosol et mesurer la réponse cellulaire. La méthode utilise des cellules, cultivées à l’interface air-liquide, imitant en vivo physiologie. Réponse cellulaire aux aérosols de nanoparticules de cuivre a été observée dans le stress oxydatif grâce à la génération d’espèces réactives de l’oxygène et la cytotoxicité dans le communiqué de la lactate déshydrogénase.

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Ce protocole est significatif, car le PIVEC permet l’exposition directe d’une culture cellulaire aux aérosols du monde réel. Le système peut être averti d’échantillonner le même air qu’une personne respire, permettant un nouveau type de surveillance de la qualité de l’air. Le principal avantage de cette technique est la facilité de capturer des aérosols sur les cellules pulmonaires de culture à des endroits inaccessibles aux systèmes de banc- dessus, comme à la source d’admission ou dans la zone de respiration.Le Dr Lynn Secondo, récemment diplômée de mon laboratoire, et Nathaniel Wygal, étudiant de premier cycle de mon laboratoire, démontreront la procédure. Pour cette expérience, les matériaux d’essai stockés et l’environnement contrôlé pendant 24 heures avant le test. Pour assembler le système de dispersion sèche, connectez la valve à billes à une extrémité du tuyau fileté de quatre pouces de long et de 1/8 de taille.Cela sert de trémie de particules. À travers l’extrémité ouverte de la trémie de particules, mettre dans la quantité désirée de nanoparticules de cuivre. Ensuite, fermez la trémie à particules avec une autre valve à billes.Connectez le tuyau de deux pouces de long et 1/8 de taille à la vanne. Placez un tube extérieur de trois pouces de long et 1/2 pouce de diamètre autour du tuyau de deux pouces. Insérez un filtre HEPA à l’intérieur du tube court, en vous assurant que la direction d’écoulement passe par la valve à billes.À l’aide du filetage, connectez le générateur de vide à l’autre soupape de boule. Ensuite, connectez le générateur de vide au réservoir d’air. Placez 1/4 pouce tube de diamètre extérieur sur la sortie du générateur de vide pour le connecter à la configuration expérimentale.Tournez la vanne principale et les vannes de régulation sur le réservoir d’air pour régler le débit désiré. Ouvrez la valve à billes, la plus proche du filtre HEPA, puis ouvrez la valve à billes la plus proche du générateur de vide. Gardez-les ouverts pendant la caractérisation ou l’exposition avant de les fermer.D’abord la valve à billes la plus proche du générateur de vide, puis la valve à billes la plus proche du filtre HEPA. Fermer les vannes principales et de régulation sur le réservoir d’air pour arrêter le débit. Pour nettoyer, utilisez 70 % d’éthanol pour laver les valves à billes et le générateur de vide.Mettez les tuyaux métalliques dans l’autoclave pour la stérilisation. Après avoir culture des cellules à l’interface liquide de l’air, permettre aux cellules d’équilibrer pendant 24 heures. Pour assembler, prenez la base PIVEC avec le puits orienté vers le haut et connectez l’adaptateur d’insertion de culture cellulaire sur le dessus.Ajouter quatre millilitres de médias de culture cellulaire au puits de la base du PIVEC à l’aide d’une micropipette. Utilisez des pinces à épiler pour placer l’insert de culture cellulaire dans l’adaptateur. Avec la partie étroite de la pièce supérieure PIVEC face vers le haut, connectez-vous à l’adaptateur.Enveloppez soigneusement le PIVEC d’une seule couche de ruban adhésif. Poussez pour connecter des pièces de cassette de 37 millimètres sur le dessus et le bas de PIVEC. Placez des adaptateurs barbelés de 1/4 de pouce dans l’entrée et la sortie de cassettes.Enroulez le réchauffeur résistatif autour de PIVEC avec les fils à la base. Bande à sécuriser. Envelopper le PIVEC de huit cartouches de papier d’aluminium pour obtenir de l’isolation et fixer avec du ruban adhésif.Connectez le tube extérieur de 1/2 pouce de diamètre à l’adaptateur sur le dessus de PIVEC. Retirer les tubes poreux de l’eau stérile et les placer dans des tuyaux au-dessus du PIVEC. Transférer le système sur le capot de fumée et serrer le PIVEC sur le support d’anneau et fixer.Connectez PIVEC au système d’aérosol en connectant le tube de 1/4 de pouce de diamètre à la sortie du générateur d’aérosols au tube poreux. Connectez la sortie du PIVEC à un tube de 1/4 de pouce de diamètre relié à un filtre HEPA et à une pompe à vide par un connecteur Y. Allumez les vannes et réglez le débit de la pompe à 0,5 litres par minute.Exposez les cellules aux nanoparticules de cuivre pendant dix minutes avant de fermer les vannes et d’éteindre la pompe. Retirez le PIVEC du système d’aérosols. Sortez l’insert de culture cellulaire à l’aide d’une pince à épiler et placez-le dans la plaque stérile du puits pour commencer les analyses biologiques désirées.Points de temps d’exposition proposés, remettre l’insert à l’incubateur de dioxyde de carbone. Aspirez les médias de PIVEC à l’aide d’un dropper. Utilisez 70 % d’éthanol pour laver le PIVEC et stériliser avec de la lumière ultraviolette pendant au moins 30 minutes avant la prochaine expérience.Le PIVEC a été caractérisé à l’aide de trois tailles de nanoparticules de cuivre pour déterminer l’efficacité des dépôts. Des dépôts accrus sont observés dans l’ensemble pour la conception des 24 puits, puis la conception des six puits. Il diminue légèrement de 100 nanomètres par rapport aux particules de cuivre de 40 nanomètres et de 800 nanomètres.La concentration en nombre de particules d’aérosols de nanoparticules de cuivre a été déterminée par sizer de particules de mobilité à balayage à base de filtre, ainsi que par des mesures optiques de la taille des particules. L’analyse post-exposition peut être accélérée en déterminant la relation de dose entre le filtre de 37 millimètres et l’insertion de culture cellulaire. La comparaison montre une forte corrélation pour les particules de cuivre de 800 nanomètres dont la valeur p est inférieure à 0,05.Comparé aux systèmes d’exposition in vitro perpendiculaire-flow dans toute la littérature, l’efficacité de dépôt du PIVEC sur la gamme des tailles de particules testées est comparable, ou augmentée, aux valeurs rapportées. La chose la plus importante à retenir est que, bien que ce protocole démontre l’utilisation du PIVEC en laboratoire, il a été conçu pour mesurer les réponses cellulaires aux aérosols sur le site d’exposition. Lors des essais sur place, il est important de caractériser l’efficacité des dépôts de l’aérosol d’essai.L’efficacité du dépôt détermine la dose déposée de particules auxquelles les cellules sont exposées. D’autres analyses biologiques peuvent être effectuées pour étudier plus de critères d’évaluation de réponse cellulaire en raison de l’exposition. Le PIVEC a été utilisé pour évaluer la réponse cellulaire due aux aérosols générés au cours des processus d’impression 3D, tels que le jetting liant métallique, et la fabrication de filament fondu.L’utilisation de nanoparticules, en particulier sous forme d’aérosols, peut être dangereuse et toute exposition doit être effectuée dans un capot de fumée. Le travail cellulaire doit être effectué dans un cabinet de biosécurité.

Research

JoVE Journal

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