Name: a new portable in vitro exposure cassette for aerosol sampling
Uploaded: 2019-02-22T13:00:00
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Os autores gostaria de agradecer a Boris Solomonov e Virginia Commonwealth inovação oficina para obter ajuda com o dispositivo de prototipagem rápida. Os autores também gostaria de agradecer Cristian Romero-Fuentes do grupo Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov e o Virginia Commonwealth nanomateriais caracterização facilidade do núcleo por sua ajuda com a caracterização de partículas. Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização fornecidos ao Dr. Lewinski pela faculdade de engenharia da Universidade de Virginia Commonwealth.

Os operadores devem usar equipamento de proteção pessoal (por exemplo, jaleco, luvas, óculos de proteção) quando executar etapas 1, 2, 3, 5 e 6.
1. preparação de materiais
<ol><li>
Prepare materiais para a montagem do sistema e exposição garantir repetibilidade.
	<ol>
<li>Certifique-se de nova utilização ou etanol a 70% limpo ¼" diâmetro interno condutiva e tubo de ¼" diâmetro exterior conectores para a montagem do sistema.</li>
		<li>Loja de materiais de test...

Fitas de filtro fornecem um método simples, barato, de coleta de aerossóis na zona de respiração; no entanto, amostras de aerossol extraídas de filtros não representam o aerossol inteiro (ou seja, gases voláteis e partículas) e, consequentemente, limitar a avaliação dos efeitos biológicos relacionados. Usando o projeto inicial da fita de filtro de 37 mm, o PIVEC é projetado para manter a portabilidade e imitar a deposição na vivo de partículas de inalação. O PIVEC é significativamente menor do ...

Amostragem pessoal, usando técnicas em vitro pode fornecer informações abrangentes sobre os efeitos biológicos de aerossóis no ambiente de trabalho. 1 exposição a contaminantes no ar incluem exposições para o produto químico em si, para as amostras de ar coletadas, sob condições submersas, onde o gás é introduzido à suspensão de células, as exposições intermitentes usando um dispositivo como um roqueiro, directa ou exposições na interface ar-líquido (ALI). 2 muitas dessas técnicas são realizadas com células cultivadas em suspensão ou a coleta de amostras antes da exposição, cada um deles pode afetar o estudo toxicológico devido a possíveis alterações no aerossol. 3 para evitar essas alterações, o laboratório pode ser trazido para o campo usando vários em vitro sistemas de exposição de cultura ALI que são usados na literatura,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 no entanto, poucos são comercialmente disponíveis. 8 , 9 , 12 destes sistemas são frequentemente volumosos, especialmente incluindo instrumentos para regular a temperatura e a umidade do ambiente celular e a vazão do aerossol da amostra. Usando o PIVEC, exposições de aerossol podem ser executadas fora de um ambiente de laboratório tradicional ou dentro da zona de respiração enquanto simulando condições de inalação.
A determinação do aerossol deposição em vitro é importante para a investigação dos efeitos de saúde devido à inalação. A zona de respiração, a área dentro de 30 cm da boca e nariz,14 é crucial para a compreensão da exposição a nanopartículas e para ligar para os efeitos biológicos nos pulmões. 2 muitas vezes, a deposição de células é definida como uma eficiência de deposição, as partículas depositadas no e retomadas pelas células divididas pelas partículas administradas ao sistema6,15 , ou em uma base em massa dos mesmos montantes. 4 , 16 os atuais métodos para medir aerossóis na zona de respiração são filtro baseado, capturando as partículas ao longo de um período de amostragem determinado e usando os filtros para realizar mais testes. 17 monitoramento pessoal exige um sistema pequeno que vem com a troca de amostras menos.
Existem muitas abordagens para determinar os efeitos na saúde da exposição a aerossóis. O modelo ALI permite o aerossol deve ser administrado diretamente para as células através do ar, como em um cenário de exposição real, ainda é mais rentável e menos tempo intensivo que na vivo estuda enquanto imitando as barreiras de ar-líquido, tais como os olhos, pele e pulmões. Células de pulmão crescidas no ALI têm a capacidade de gerar uma camada de barreira polarizada,18,19 , que produz traços fisiológicos que lembram o epitélio pulmonar na vivo , incluindo a produção de muco e surfactante em específico linhas de células brônquicas ou alveolar, cílios batendo, junções apertadas19 ,19,20 e célula de polarização. 18 alterações tais como estas podem afetar a resposta celular medida em estudos de toxicidade. 21 além disso, ALI in vitro do modelo resultados são muitas vezes mais sensível do que as células exposta via suspensão modelos22 e são capazes para modelo aguda na vivo inalação toxicidade. 23 , 24 portanto, um sistema de exposição ALI que é capaz de realizar medições dentro da zona de respiração é um próximo passo natural.
Expondo as células para aerossol diretamente na fonte de emissão, a investigação dos efeitos de todos os gases compostos semi voláteis e partículas envolvidas na mistura ocorre. Quando a mistura é coletada em um filtro, os gases e compostos voláteis não são capturados e a mistura inteira não pode ser investigada. Além disso, reconstituição de partículas em um pó ou uma suspensão líquida pode levar à agregação ou interações partícula-fluido, tais como a dissolução, em suspensão líquida. 25 , 26 quando partículas de aerossol são adicionadas ao líquido, existe um potencial maior para a aglomeração, formação de27 25,de uma coroa de proteína,28 ou interação com compostos no líquido, que pode afetar a deposição e influencia a resposta biológica. 29 , 30
Exposição no ALI baseia-se em três perfis principais aerossol nuvem fluxo de assentamento, paralela e fluxo perpendicular. Nuvem de sedimentação, usado pela exposição de célula Interface ar-líquido (ALICE),4 é um sistema descontínuo onde partículas depositam através de difusão, estabelecendo-se como o aerossol é tratado como uma unidade e gravitacional. Fluxo paralelo, usado pelo aerossol eletrostática em vitro sistema de exposição (BEIRAIS)5 e Multiculture exposição câmara (MEC) II,6 permite a deposição por meio da adição de movimento browniano através do perfil de fluxo. Fluxo perpendicular, usado por um microsprayer,7 câmara de aerossol Nano para toxicidade In Vitro (NACIVT),11 e comercial ALI sistemas8,9,10,12, adiciona a impactação de partículas dentro da região de deposição. Muitos destes sistemas de exposição são grandes e volumosas, que exigem sistemas de excesso para aerossol pré-condicionamento, bombas de fluxo, ou até mesmo aquecimento câmaras para a incubação das células. Este grande tamanho diminui a portabilidade do sistema. Em vez de amostragem diretamente na fonte de emissão, estes sistemas têm frequentemente amostras trazidas para os laboratório ou modelo aerossóis gerados para análise. A complexidade do aerossol emitido pode ser perdida na tradução do campo para o laboratório. O PIVEC é menor do que os sistemas atuais, com uma área de superfície externa de aproximadamente 460 cm2 e pesando apenas 60 gramas, com controle térmico e umidade incorporado no sistema permitindo a um dispositivo altamente portátil. A diminuição do tamanho e peso permitem que o sistema a ser usado ou tomadas para a fonte de exposição, permitindo a amostragem direta.
O grande tamanho dos atuais sistemas de exposição também diminui a capacidade de realizar a amostragem para investigar espaciais gradientes em concentrações. Esta resolução é chave ao determinar efeitos toxicológicos de muitas potencialidades ambientais e riscos ocupacionais como atividades partículas de matéria ou local de trabalho de exaustão veicular onde ocorre o clorofórmio. Imediatamente após emissão, aí torna-se uma variação espacial na concentração de partículas. Isso cresce com o tempo como as partículas se dispersar por toda a atmosfera e esses efeitos podem mudar com base das condições ambientais, como temperatura, pressão, vento e sol. Partículas podem começar a envelhecer e oxidar também uma vez emitido31,32 e taxas de dispersão são afetadas pela topografia; concentrações mais elevadas serão encontradas nos cânions e túneis, onde os efeitos de dispersão são diminuiu, e concentrações menores podem ser encontradas onde há uma grande área de dispersão. 33 estas mudanças nas taxas de dispersão podem ter efeitos significativos na saúde humana e podem ser vistas quando se compara o número de asmáticos adultos vivendo em urbano versus em ambientes rurais. 34 enquanto muitos sistemas de exposição fornecem amostras múltiplas de uma só vez, vários sistemas são necessários com uma abundância de grandes equipamentos para executar a resolução espacial.
Trazendo o laboratório para o campo, o tempo de análise pode ser diminuído usando o celular como um sensor. Seguir os pontos de extremidade e conhecidos mecanismos biológicos pode auxiliar na determinação da composição de aerossol e tamanho. Devido aos métodos de liberação lenta, incluindo infralateral, fagocitose e translocação, estas partículas são frequentemente interagindo com células cerca de dias a semanas3 gerando estresse oxidativo, inflamação e até mesmo a morte celular. Esses pontos de extremidade biológicos podem ser pontos de partida para percursos de resultado negativo para doença cardiovascular ou doença pulmonar obstrutiva crônica. Além disso, Wiemenn et al realizaram uma matriz de ensaios em vitro para comparar com valores de literatura para o curto prazo em vivo inalação toxicidade. 35 Resposta na vivo foi predita com dois dos quatro resultados positivos de testes de citotoxicidade através da libertação de lactato desidrogenase, estresse oxidativo do formação de redução e peróxido de hidrogênio de glutationa e lançamento e potencial de inflamação o gene de fator de necrose tumoral alfa. Fora de dez nanosized de óxidos de metal testado, seis testaram como ativo (óxido de titânio, óxido de zinco e óxido de cério diferentes quatro) usando as exposições em vitro com confirmação na vivo. 
A fim de estudar os efeitos de aerossóis no ambiente ocupacional, nosso laboratório desenvolveu o PIVEC para exposições no campo. Além disso, o PIVEC pode ser usado para amostragem pessoal monitorar e investigar a exposição por inalação, como o filtro de 37 mm gaveta36 ou vários sistemas podem ser usados para alcançar a resolução espacial numa determinada área. Neste protocolo, a caracterização e utilização do PIVEC é discutido. Após a exposição, os efeitos biológicos são observados através de ensaios de citotoxicidade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Scanning mobility particle sizer (SMPS)</td>
			<td>TSI, Inc.</td>
			<td>3910</td>
			<td>NanoSMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical particle sizer (OPS)</td>
			<td>TSI, Inc.</td>
			<td>3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Pipe, 4&#34; Long</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4830K116</td>
			<td>Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass Ball Valve with Lever Handle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4112T12</td>
			<td>Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Pipe, 2&#34; Long</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>7753K121</td>
			<td>Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filter</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>09-744-12</td>
			<td>HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Generator</td>
			<td>PISCO USA</td>
			<td>VCH10-018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIVEC</td>
			<td>VCU</td>
			<td></td>
			<td>For design please contact authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resistive heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; barbed connectors</td>
			<td>Zefon International, Inc.</td>
			<td>459743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous tubing</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc.</td>
			<td>BB2062-1814A</td>
			<td>Hydrophilic 10 um pores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery power bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>353095</td>
			<td>24 well plate insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>13-711-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Fiber Filters</td>
			<td>SKC</td>
			<td>225-7</td>
			<td>Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Micro Balance</td>
			<td>A&#38;D</td>
			<td>BM-22</td>
			<td>Housed in environmental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm filter cassette</td>
			<td>SKC</td>
			<td>225-3250</td>
			<td>Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow vacuum pump</td>
			<td>SKC</td>
			<td>220-5000TC</td>
			<td>AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1090</td>
			<td>40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1088</td>
			<td>100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1117M</td>
			<td>800 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new portable in vitro exposure cassette for aerosol sampling

Este protocolo introduz um novo em vitro sistema de exposição, capaz de ser usado, incluindo sua caracterização e desempenho. Sistemas de interface ar-líquido (ALI) em vitro exposição são frequentemente grandes e volumosas, tornando o transporte para o campo e a operação na fonte de emissão ou dentro da zona de respiração difícil. Através da miniaturização destes sistemas, o laboratório pode ser trazido para o campo, acelerando o tempo de processamento e fornecendo um método de exposição mais apropriado que não altera o aerossol antes de entrar em contato com as células. O portátil em vitro exposição Cassette (PIVEC) adapta-se uma fita de filtro de 37 mm para permitir a toxicidade em vitro testes fora de um ambiente de laboratório tradicional. O PIVEC foi caracterizado usando três tamanhos de nanopartículas de cobre para determinar a eficiência de deposição, com base em gravimétrica e análise de concentração número de partícula. Foram realizados experimentos de citotoxicidade inicial com células de pulmão exposto para determinar a capacidade do sistema de depósito de partículas, mantendo a viabilidade celular. O PIVEC fornece uma eficiência de deposição semelhante ou maior quando comparados aos dispositivos de fluxo perpendicular disponível em vitro exposição. Apesar da taxa de transferência de amostra menor, o tamanho pequeno dá algumas vantagens para o atual em vitro ALI sistemas de exposição. Estes incluem a capacidade de ser usado para monitoramento pessoal, custam de vários sistemas de resolução espacial, mantendo um usuário menor mobilidade do laboratório para a fonte de emissão e a opção de set-up. O PIVEC é um sistema capaz de coletar aerossóis no campo e dentro da zona de respiração em um modelo de ar-interfaceado, in vitro .

Toxicologia Ocupacional em vitro envolve a manutenção da viabilidade celular durante a realização de exposição de aerossol. O sistema PIVEC é mostrado na Figura 2, incluindo a temperatura e controle de umidade e o PIVEC desgastado. A temperatura foi mantida usando um aquecedor resistivo pilhas e o aerossol humedecido utilizando aumentou umidificação natural através de um tubo poroso, molhada. Em um aerossol controlado configuração dentro ...

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A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Um novo portátil em Vitro Cassette exposição para amostragem de aerossol

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar exposições de aerossol de celular portátil e medir a resposta celular. O método utiliza células, crescidas na interface ar-líquido, imitando a fisiologia na vivo . Observou-se resposta celular de aerossóis de nanopartículas de cobre como estresse oxidativo através da geração de espécies reativas de oxigênio e citotoxicidade como liberação de lactato desidrogenase.

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Este protocolo é significativo, pois o PIVEC permite a exposição direta de uma cultura celular a aerossóis do mundo real. O sistema pode ser avisado para provar o mesmo ar que uma pessoa respira, permitindo um novo tipo de monitoramento da qualidade do ar. A principal vantagem dessa técnica é a facilidade de capturar aerossóis em células pulmonares cultivadas em locais inacessíveis para sistemas de bancada, como na fonte de admissão ou dentro da zona respiratória.Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Lynn Secondo, recém-formado no meu laboratório, e Nathaniel Wygal, um estudante de graduação do meu laboratório. Para este experimento, armazenados materiais de teste e ambiente controlado por 24 horas antes do teste. Para montar o sistema de dispersão seca, conecte a válvula de esfera a uma extremidade do tubo roscado de quatro polegadas de comprimento e 1/8 de tamanho.Isso serve como o funil de partículas. Através da extremidade aberta do funil de partículas, coloque a quantidade desejada de nanopartículas de cobre. Em seguida, feche o funil de partículas com outra válvula de esfera.Conecte o tubo de dois centímetros de comprimento e tamanho 1/8 à válvula. Coloque uma tubulação externa de 3 polegadas de comprimento e 1/2 polegada em torno do tubo de duas polegadas. Insira um filtro HEPA dentro da tubulação curta, garantindo que a direção de fluxo seja através da válvula da esfera.Usando rosca, conecte o gerador de vácuo à outra válvula de esfera. Em seguida, conecte o gerador de vácuo ao tanque de ar. Coloque tubos de 1/4 polegada de diâmetro externo sobre a saída do gerador de vácuo para conectá-lo à configuração experimental.Gire a válvula principal e as válvulas reguladoras do tanque de ar para definir o fluxo desejado. Abra a válvula de esfera, mais próxima do filtro HEPA e abra a válvula de esfera mais próxima do gerador de vácuo. Mantenha-os abertos durante a caracterização ou exposição antes de fechá-los.Primeiro a válvula de esfera mais próxima do gerador de vácuo e, em seguida, a válvula de esfera mais próxima do filtro HEPA. Feche as válvulas principais e reguladoras no tanque de ar para parar o fluxo. Para limpar, use 70% de etanol para lavar válvulas de esfera e gerador de vácuo.Coloque tubos de metal em autoclave para esterilização. Depois de esculpir células na interface líquida de ar, permita que as células se equilibrem por 24 horas. Para montar, pegue a base PIVEC com o poço voltado para cima e conecte o adaptador de inserção de cultura celular na parte superior.Adicione quatro mililitros de mídia de cultura celular ao poço da base do PIVEC usando uma micropipette. Use pinças para colocar a inserção da cultura celular dentro do adaptador. Com a parte estreita da peça superior PIVEC voltada para cima, conecte-se ao adaptador.Cuidadosamente, enrole pivec com uma única camada de fita adesiva. Empurre para conectar peças de de 37 milímetros na parte superior e inferior do PIVEC. Coloque adaptadores farpados de 1/4 polegada em entrada e saída de.Enrole o aquecedor resistivo ao redor de PIVEC com os fios na base. Fita para segurança. Enrole o PIVEC com oito rodadas de papel alumínio para isolamento e fixe com fita.Conecte tubos de 1/2 polegada de diâmetro externo ao adaptador na parte superior do PIVEC. Remova a tubulação porosa da água estéril e coloque dentro da tubulação em cima do PIVEC. Transfira o sistema para o capô de fumaça e aperte o PIVEC no suporte do anel e proteja.Conecte o PIVEC ao sistema aerossol conectando a tubulação de 1/4 polegada de diâmetro na saída do gerador de aerossol à tubulação porosa. Conecte a saída do PIVEC a tubos de 1/4 polegada de diâmetro conectados a um filtro HEPA e a uma bomba de vácuo por um conector Y. Ligue as válvulas e ajuste a vazão da bomba para 0,5 litros por minuto.Exponha as células a nanopartículas de cobre por dez minutos antes de fechar as válvulas e desligar a bomba. Remova o PIVEC do sistema aerossol. Tire a inserção da cultura celular usando pinças e coloque-a na placa de poço estéril para iniciar os ensaios biológicos desejados.Pontos de tempo de exposição propostos, coloque a inserção de volta na incubadora de dióxido de carbono. Aspirar mídia do PIVEC usando um dropper. Use 70% de etanol para lavar PIVEC e esterilizá-lo com luz ultravioleta por pelo menos 30 minutos antes do próximo experimento.O PIVEC foi caracterizado usando três tamanhos de nanopartículas de cobre para determinar a eficiência da deposição. O aumento da deposição é observado no geral para o projeto do poço 24, em seguida, o projeto do poço seis. Diminui ligeiramente por 100 nanômetros em comparação com 40 nanômetros e 800 nanômetros de partículas de cobre.A concentração do número de partículas de aerossóis de nanopartículas de cobre foi determinada pelo dimensionador de partículas baseado em filtro, bem como por medições ópticas de tamanho de partículas. A análise pós-exposição pode ser acelerada determinando a relação de dose entre o filtro de 37 milímetros e a inserção da cultura celular. A comparação mostra uma forte correlação para partículas de cobre de 800 nanômetros com um valor p inferior a 0,05.Em comparação com os sistemas de exposição in vitro de fluxo perpendicular ao longo da literatura, a eficiência de deposição do PIVEC sobre a faixa dos tamanhos de partículas testadas é comparável ou aumentada do que os valores relatados. O mais importante a ser lembrado é que, embora este protocolo demonstre o uso do PIVEC em um ambiente de laboratório, ele foi projetado para medir respostas celulares a aerossóis no local da exposição. Ao realizar testes no local, é importante caracterizar a eficiência da deposição do aerossol de teste.A eficiência do depoimento determina a dose depositada de partículas às quais as células estão expostas. Ensaios biológicos adicionais podem ser realizados para investigar mais pontos finais de resposta celular devido à exposição. O PIVEC tem sido usado para avaliar a resposta celular devido a aerossóis gerados durante processos de impressão 3D, como cais de aglutinante metálico e fabricação de filamento fundido.O uso de nanopartículas, particularmente na forma aerossol, pode ser perigoso e quaisquer exposições devem ser realizadas em um capô de fumaça. O trabalho celular deve ser feito em um armário de biosegurança.

Research

JoVE Journal

Environment

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