Name: a new portable in vitro exposure cassette for aerosol sampling
Uploaded: 2019-02-22T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Boris Solomonov y la tienda de máquina de innovación de Virginia Commonwealth para ayuda con el prototipado rápido el dispositivo. Los autores también desean agradecer a Cristian Romero-Fuentes del grupo Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov y el Virginia Commonwealth nanomateriales caracterización instalaciones centrales para su ayuda con la caracterización de partículas. Este trabajo fue apoyado por fondos de arranque a Dr. Lewinski por la Facultad de ingeniería en Virginia Commonwealth University.

Los operadores deben usar equipo de protección personal (bata, guantes, gafas) cuando realice los pasos 1, 2, 3, 5 y 6.
1. preparación de materiales
<ol><li>
Preparar materiales para sistema de montaje y exposición para asegurar repetibilidad.
	<ol>
<li>Asegúrese de que uso nuevo o etanol al 70% limpia ¼" diámetro interno conductora tubería y ¼" diámetro exterior conectores para el conjunto del sistema.</li>
		<li>Almacén materiales de prueba incluyendo filtros, co...

Cartuchos del filtro proporcionan un método simple y económico de la recogida de aerosoles en la zona de respiración; sin embargo, muestras de aerosol extraídas de los filtros representan la entera del aerosol (es decir, gases volátiles y partículas) y por lo tanto limitar la evaluación de efectos biológicos relacionados. Utilizando el diseño inicial del cartucho de filtro de 37 mm, el PIVEC está diseñado para mantener la portabilidad y mímico en vivo la deposición de partículas de la inhalación. ...

Muestreo personal de vitro técnicas podría proporcionar información completa sobre los efectos biológicos de los aerosoles en el lugar de trabajo. 1 exposición a contaminantes en el aire incluye exposición a producto químico sí mismo, a las muestras de aire recogidas en condiciones sumergidas, donde el gas se introduce a la suspensión de células, exposición intermitente utilizando un dispositivo como un balancín, o en la exposiciones en la interfase aire-líquido (ALI). 2 muchas de estas técnicas se realizan con células cultivadas en suspensión o en la recogida de muestras antes de la exposición, cada una de ellas puede afectar el estudio toxicológico debido a posibles cambios en el aerosol. 3 para evitar estos cambios, el laboratorio puede ser traído al campo, utilizando varios en vitro ALI exposición los sistemas de cultivo que se utilizan en la literatura,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 sin embargo, pocos están comercialmente disponibles. 8 , 9 , 12 estos sistemas suelen ser voluminosos, especialmente cuando se incluye instrumentos para regular la temperatura y la humedad del ambiente celular y el flujo del aerosol de la muestra. Usando el PIVEC, exposiciones de aerosol pueden realizarse fuera de un entorno de laboratorio tradicional o dentro de la zona de respiración mientras que mímico las condiciones de la inhalación.
La determinación de la deposición de aerosoles en vitro es importante a la investigación de efectos sobre la salud debido a la inhalación. La zona de respiración, el área dentro de los 30 cm de la boca y la nariz,14 es crucial para la comprensión de la exposición a las nanopartículas y para vincular a los efectos biológicos en los pulmones. 2 a menudo, la deposición en las células se define como una eficiencia de deposición, las partículas deposita en y tomado por las células que se dividen las partículas administrada al sistema6,15 o en una base total de la misma cantidad. 4 , 16 los métodos actuales para la medición de aerosoles en la zona de respiración son filtro base, capturando las partículas durante un período de muestreo dado y con los filtros para llevar a cabo más pruebas. 17 monitoreo personal requiere un pequeño sistema que viene con el compromiso de pocas muestras.
Hay muchos métodos para determinar los efectos de la exposición a un aerosol. El modelo ALI permite el aerosol ser administrado directamente a las células a través del aire como en un escenario de exposición real, sin embargo, es más rentable y menos tiempo intensivo que en vivo los estudios mientras que mímico las barreras de aire líquido como los ojos, piel y pulmones. Las células del pulmón en el ALI tienen la capacidad para generar una capa de polarizado,18,19 que produce características fisiológicas que se parecen al en vivo pulmón epitelio, incluyendo la producción de moco y surfactante en específico líneas de célula bronquial o alveolar, cilia bate,19 ensambladuras apretadas,19,20 y cell polarización. 18 cambios como estos pueden afectar la respuesta celular en los estudios de toxicidad. 21 además, ALI en vitro modelo resultados son a menudo más sensibles que las células expuestas mediante suspensión modelos22 y capaz modelo aguda en vivo inhalación Toxicidad. 23 , 24 por tanto, un sistema de exposición de ALI que es capaz de realizar mediciones dentro de la zona de respiración es un siguiente paso natural.
Al exponer las células a aerosol directamente a la fuente de emisión, se produce la investigación de los efectos de todos los gases, compuestos semi volátiles y partículas en la mezcla. Cuando la mezcla se recoge en un filtro, no se capturan los gases y compuestos volátiles y la mezcla entera no puede ser investigada. Además, la reconstitución de partículas en un polvo o una suspensión líquida puede conducir a la agregación o interacciones partícula-líquido, como la disolución, en suspensión líquida. 25 , 26 cuando se agregan partículas de aerosol al líquido, hay un mayor potencial para la formación de27 25,de corona de proteína,28 o interacción con los compuestos en el líquido, que puede afectar a la deposición, aglomeración y influir en la respuesta biológica. 29 , 30
Exposición en la ALI se basa en tres perfiles principales aerosol nube dirimentes, paralelo de flujo y flujo perpendicular. Nube de adaptación, utilizado por el aire líquido interfaz celular exposición (ALICE),4 es un sistema por lotes donde depositan las partículas gravitacionales y difusionales colocar como el aerosol es tratado como una unidad. Flujo paralelo, utilizado por el Aerosol electrostático en vitro exposición sistema (aleros)5 y Multicultura exposición cámara (MEC) II,6 permite la deposición mediante la adición de movimiento browniano a través del perfil de flujo. Flujo perpendicular, usado por un microsprayer,7 Nano cámara de Aerosol para la toxicidad In Vitro (NACIVT),11 y comercial ALI sistemas8,9,10,12, añade la impactación de partículas dentro de la región de deposición. Muchos de estos sistemas de exposición son grandes y voluminosos, que requieren sistemas de exceso para aerosol previamente acondicionado, bombas de flujo, o incluso la calefacción cámaras de incubación de las células. Este gran tamaño disminuye la portabilidad del sistema. En lugar de muestreo directamente a la fuente de emisión, estos sistemas tienen a menudo las muestras que el laboratorio o modelo aerosoles generados para el análisis. La complejidad de los aerosoles emitidos se puede perder en la traducción del campo al laboratorio. El PIVEC es más pequeño que los sistemas actuales, con una superficie externa de aproximadamente 460 cm2 y pesa sólo 60 gramos, con control de humedad y térmico incorporado en el sistema que permite a un dispositivo portátil. La disminución del tamaño y peso permiten que el sistema de ser usado o tomado a la fuente de exposición, permitiendo el muestreo directo.
El gran tamaño de los actuales sistemas de exposición también disminuye la capacidad para realizar el muestreo para investigar gradientes espaciales en las concentraciones. Esta resolución es clave para determinar los efectos toxicológicos de potencial ambiental y riesgos laborales como escape vehicular partículas materia o lugar de trabajo actividades donde se produce la aerosolización. Inmediatamente la emisión, allí se convierte en una variación espacial en la concentración de partículas. Esto crece con el tiempo las partículas se dispersan en la atmósfera y estos efectos pueden cambiar en base a las condiciones ambientales, como temperatura, presión, viento y sol. Las partículas pueden comenzar a la edad, así como una vez emitidos31,32 se oxida y las tasas de dispersión están afectadas por la topografía; concentraciones más altas se encuentran en cañones y túneles, donde efectos de dispersión se ralentizó, y concentraciones más bajas pueden encontrarse donde hay una gran área de dispersión. 33 estos cambios en las tasas de dispersión pueden tener efectos significativos sobre la salud humana y pueden verse al comparar el número de adultos asmáticos viven en urbanos y en entornos rurales. 34 mientras que los sistemas de exposición muchos proporcionan múltiples muestras a la vez, múltiples sistemas son necesarios con una abundancia de grandes equipos para realizar la resolución espacial.
Al llevar el laboratorio al campo, el momento del análisis puede reducirse mediante el uso de la célula entera como un sensor. Siguiendo criterios de valoración y los mecanismos biológicos conocidos puede ayudar en la determinación de la composición del aerosol y el tamaño. Debido a los métodos de remoción lenta, incluyendo depuración mucociliar, fagocitosis y desplazamiento, estas partículas son a menudo interactuando con las células para unos días a la semanas3 generadoras de estrés oxidativo, inflamación y hasta la muerte celular. Estos criterios de valoración biológicos pueden ser los puntos de partida para rutas de resultados adversos para la enfermedad cardiovascular o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además, Wiemenn et al realizó una serie de ensayos en vitro para comparar con los valores de la literatura para a corto plazo en vivo inhalación Toxicidad. 35 Respuesta in vivo fue predicho con dos de los cuatro resultados positivos de ensayos de citotoxicidad por liberación de lactato deshidrogenasa, el estrés oxidativo de glutatión reducción y peróxido de hidrógeno formación y liberación y potencial de la inflamación el gene alfa del factor de necrosis tumoral. De combinar diez óxidos metálicos probados, seis prueban como activo (óxido de titanio, óxido de zinc y óxido de cerio diferentes cuatro) mediante exposiciones in vitro con confirmación en vivo. 
Para estudiar los efectos de los aerosoles en un ámbito laboral, nuestro laboratorio desarrollado PIVEC para exposiciones en el campo. Además, el PIVEC puede usarse para que muestreo personal para vigilar e investigar la exposición por inhalación como el filtro de 37 mm cassette36 o sistemas múltiples pueden utilizarse para lograr la resolución espacial dentro de un área determinada. En este protocolo, se discute la caracterización y el uso de la PIVEC. Después de la exposición, los efectos biológicos se observan a través de ensayos de citotoxicidad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Scanning mobility particle sizer (SMPS)</td>
			<td>TSI, Inc.</td>
			<td>3910</td>
			<td>NanoSMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical particle sizer (OPS)</td>
			<td>TSI, Inc.</td>
			<td>3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Pipe, 4&#34; Long</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4830K116</td>
			<td>Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass Ball Valve with Lever Handle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4112T12</td>
			<td>Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Pipe, 2&#34; Long</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>7753K121</td>
			<td>Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filter</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>09-744-12</td>
			<td>HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Generator</td>
			<td>PISCO USA</td>
			<td>VCH10-018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIVEC</td>
			<td>VCU</td>
			<td></td>
			<td>For design please contact authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resistive heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; barbed connectors</td>
			<td>Zefon International, Inc.</td>
			<td>459743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous tubing</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc.</td>
			<td>BB2062-1814A</td>
			<td>Hydrophilic 10 um pores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery power bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>353095</td>
			<td>24 well plate insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>13-711-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Fiber Filters</td>
			<td>SKC</td>
			<td>225-7</td>
			<td>Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Micro Balance</td>
			<td>A&#38;D</td>
			<td>BM-22</td>
			<td>Housed in environmental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm filter cassette</td>
			<td>SKC</td>
			<td>225-3250</td>
			<td>Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow vacuum pump</td>
			<td>SKC</td>
			<td>220-5000TC</td>
			<td>AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1090</td>
			<td>40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1088</td>
			<td>100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Particles</td>
			<td>U.S. Research Materials, Inc.</td>
			<td>US1117M</td>
			<td>800 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new portable in vitro exposure cassette for aerosol sampling

Este Protocolo introduce un nuevo en vitro exposición sistema, capaz de ser usado, incluyendo su caracterización y funcionamiento. Sistemas de interfaz de aire líquido (ALI) en vitro exposición suelen ser grandes y voluminosos, dificultando el transporte al campo y la operación en la fuente de emisión o dentro de la zona de respiración. A través de la miniaturización de estos sistemas, el laboratorio puede ser traído al campo, acelerar el tiempo de procesamiento y proporciona un método de exposición más apropiado que no altere el aerosol antes de ponerse en contacto con las células. El Portable In vitro exposición Cassette (PIVEC) adapta un casete de filtro de 37 mm para permitir en vitro toxicidad pruebas fuera de un entorno de laboratorio tradicional. El PIVEC fue caracterizado mediante tres tamaños de nanopartículas de cobre para determinar eficacia de deposición basada en gravimétrico y análisis número de concentración de partículas. Se realizaron experimentos de citotoxicidad inicial con células pulmonares expuestas para determinar la capacidad del sistema para depositar las partículas mientras que mantiene la viabilidad celular. El PIVEC proporciona una eficiencia de deposición similar o mayor al comparar a los dispositivos de flujo perpendicular disponible en vitro exposición. A pesar de la baja demanda, el tamaño pequeño le da algunas ventajas a la actual en vitro ALI sistemas de exposición. Estos incluyen la capacidad de ser usado para control de personal, movilidad del laboratorio a la fuente de emisión y la opción de configuración múltiples sistemas de resolución espacial manteniendo un usuario más bajo costo. El PIVEC es un sistema capaz de recoger los aerosoles en el campo y dentro de la zona de respiración en una interfaz de aire, en vitro modelo.

Toxicología ocupacional en vitro implica mantener la viabilidad celular mientras realiza la exposición de aerosoles. El sistema PIVEC se muestra en la figura 2, incluyendo la temperatura y control de humedad y la PIVEC desgastada. La temperatura se mantuvo utilizando un calentador resistivo pilas y aerosol humidificado con mayor humectación natural a través de un tubo poroso, húmedo. En un aerosol controlado ajuste dentro de un laboratorio, el P...

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A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Un nuevo portátil In Vitro exposición Cassette para el muestreo de aerosoles

Aquí, presentamos un protocolo para realizar exposiciones de aerosol celular portable y medir la respuesta celular. El método utiliza las células, cultivadas en la interfase aire-líquido, imitando en vivo fisiología. Respuesta celular a aerosoles de nanopartículas de cobre se observó como el estrés oxidativo a través de la generación de especies reactivas de oxígeno y la citotoxicidad como liberación de lactato deshidrogenasa.

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Este protocolo es significativo, ya que el PIVEC permite la exposición directa de un cultivo celular a aerosoles del mundo real. El sistema puede ser advertido para tomar muestras del mismo aire que una persona respira, lo que permite un nuevo tipo de monitoreo de la calidad del aire. La principal ventaja de esta técnica es la facilidad de capturar aerosoles en células pulmonares cultivadas en lugares inaccesibles para los sistemas de sobremesa, como en la fuente de admisión o dentro de la zona de respiración.Lynn Secondo, una recién graduada de mi laboratorio, y Nathaniel Wygal, un estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para este experimento, almacenó los materiales de prueba y el entorno controlado durante 24 horas antes de la prueba. Para montar el sistema de dispersión en seco, conecte la válvula de bola a un extremo de la tubería roscada de cuatro pulgadas de largo y tamaño 1/8.Esto sirve como la tolva de partículas. A través del extremo abierto de la tolva de partículas, poner en la cantidad deseada de nanopartículas de cobre. A continuación, cierre la tolva de partículas con otra válvula de bola.Conecte el tubo de dos pulgadas de largo, tamaño 1/8 a la válvula. Coloque un tubo exterior de tres pulgadas de largo y media pulgada alrededor del tubo de dos pulgadas. Inserte un filtro HEPA dentro del tubo corto, asegurando que la dirección del flujo sea a través de la válvula de bola.Con el roscado, conecte el generador de vacío a la otra válvula de bola. A continuación, conecte el generador de vacío al tanque de aire. Coloque tubos de diámetro exterior de 1/4 de pulgada sobre la salida del generador de vacío para conectarlo a la configuración experimental.Gire la válvula principal y las válvulas reguladoras del tanque de aire para ajustar el flujo deseado. Abra la válvula de bola, más cercana al filtro HEPA y luego abra la válvula de bola más cercana al generador de vacío. Manténgalos abiertos durante la caracterización o exposición antes de cerrarlos.Primero la válvula de bola más cercana al generador de vacío, y luego la válvula de bola más cercana al filtro HEPA. Cierre las válvulas principales y reguladoras del tanque de aire para detener el flujo. Para limpiar, utilice 70% de etanol para lavar las válvulas de bola y el generador de vacío.Ponga tubos metálicos en el autoclave para la esterilización. Después de cultivar las células en la interfaz del líquido del aire, permita que las células se equilibren durante 24 horas. Para montar, tome la base PIVEC con el pozo hacia arriba y conecte el adaptador de plaquita de cultivo celular en la parte superior.Añadir cuatro mililitros de medios de cultivo celular al pozo de la base del PIVEC utilizando una micropipeta. Utilice pinzas para colocar el inserto de referencia cultural de celda dentro del adaptador. Con la parte estrecha de la pieza superior PIVEC hacia arriba, conéctese al adaptador.Envuelva cuidadosamente PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva. Empuje para conectar piezas de cassette de 37 milímetros en la parte superior e inferior de PIVEC. Coloque adaptadores de púas de 1/4 de pulgada en la entrada y salida del cassette.Envuelva el calentador resistivo alrededor de PIVEC con los cables en la base. Cinta para asegurar. Envuelva PIVEC con ocho rondas de papel de aluminio para aislamiento y asegúrelo con cinta adhesiva.Conecte el tubo de diámetro exterior de 1/2 pulgada al adaptador en la parte superior de PIVEC. Retire el tubo poroso del agua estéril y colóquelo dentro del tubo en la parte superior de PIVEC. Sistema de transferencia a la campana de humo y sujetar el PIVEC en el soporte del anillo y asegurar.Conecte PIVEC al sistema de aerosol conectando el tubo de 1/4 de pulgada de diámetro a la salida del generador de aerosoles al tubo poroso. Conecte la salida del PIVEC a un tubo de 1 x 4 pulgadas de diámetro que esté conectado a un filtro HEPA y a una bomba de vacío mediante un conector Y. Encienda las válvulas y ajuste el caudal de la bomba a 0,5 litros por minuto.Exponga las células a nanopartículas de cobre durante diez minutos antes de cerrar las válvulas y apagar la bomba. Retire PIVEC del sistema de aerosoles. Saque el inserto de cultivo celular con pinzas y colóquelo en la placa de pozo estéril para comenzar los ensayos biológicos deseados.Puntos de tiempo de exposición propuestos, vuelva a colocar el inserto en la incubadora de dióxido de carbono. Aspirar medios de PIVEC con un cuentagotas. Utilice 70%etanol para lavar PIVEC y esterilizarlo con luz ultravioleta durante al menos 30 minutos antes del siguiente experimento.El PIVEC se caracterizó utilizando tres tamaños de nanopartículas de cobre para determinar la eficiencia de la deposición. El aumento de la deposición se observa en general para el diseño de 24 pozos, luego el diseño de seis pozos. Disminuye ligeramente para 100 nanómetros en comparación con 40 nanometros y 800 nanometros de partículas de cobre.La concentración del número de partículas de aerosoles de nanopartículas de cobre se determinó mediante un dimensionador de partículas de movilidad de escaneo basado en filtros, así como mediciones de tamaño de partícula óptica. El análisis posterior a la exposición se puede acelerar determinando la relación de dosis entre el filtro de 37 milímetros y el inserto de cultivo celular. La comparación muestra una fuerte correlación para partículas de cobre de 800 nanómetros con un valor p inferior a 0,05.En comparación con los sistemas de exposición in vitro de flujo perpendicular en toda la literatura, la eficiencia de la deposición del PIVEC en el rango de los tamaños de partículas probados es comparable o aumenta con los valores notificados. Lo más importante a recordar es que aunque este protocolo demuestra el uso del PIVEC en un entorno de laboratorio, fue diseñado para medir las respuestas celulares a los aerosoles en el lugar de exposición. Al realizar pruebas in situ, es importante caracterizar la eficiencia de la deposición del aerosol de prueba.La eficiencia de la deposición determina la dosis depositada de partículas a las que están expuestas las células. Se pueden realizar ensayos biológicos adicionales para investigar más puntos finales de respuesta celular debido a la exposición. El PIVEC se ha utilizado para evaluar la respuesta celular debido a aerosoles generados durante los procesos de impresión 3D, como el chorro de aglutinante de metal, y la fabricación de filamentos fusionados.El uso de nanopartículas, particularmente en forma de aerosol, puede ser peligroso y cualquier exposición debe realizarse en una campana de humos. El trabajo celular debe realizarse en un gabinete de biosemase.

Research

JoVE Journal

Environment

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