Name: expansion of two-dimension electrospun nanofiber mats into three-dimension scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da concede dal National Institute of General Medical Science (NIGMS) al NIH (2P 20 GM103480-06 e 1R01GM123081 a J.X.), i fondi Otis Glebe Medical Research Foundation, NE LB606 e avvio dal University of Nebraska Medical Centro.

Tutti in vivo procedure descritte di seguito sono state approvate dal Comitato IACUC presso l'University of Nebraska Medical Center.
1. preparare le soluzioni per elettrofilatura Standard
<ol><li>In un tubo di vetro da 20 mL, sciogliere 2 g di poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) in una miscela solvente di diclorometano (DCM) e N, N-dimetilformammide (DMF) con una razione di 4:1 (v/v) ad una concentrazione del 10% (p/v). Attenzione: Maniglia DCM e DMF in un cappuccio ventilat...

<ol>
	<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+electrospun+nanofibers+for+wound+healing.">Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing.</a> Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).</li><li>Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+Nanofiber+Scaffolds+with+Gradations+in+Fiber+Organization.">Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52626 (2015).</li><li>Xie, J., Li, X., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Put+electrospun+nanofibers+to+work+for+biomedical+research.">Put electrospun nanofibers to work for biomedical research.</a> Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofiber+membranes+with+controllable+microwells+and+structural+cues+and+their+use+in+forming+cell+microarrays+and+neuronal+networks.">Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks.</a> Small. 7 (3), 293-297 (2011).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radially+aligned,+electrospun+nanofibers+as+dural+substitutes+for+wound+closure+and+tissue+regeneration+applications.">Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications.</a> ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Aligned-to-random"+nanofiber+scaffolds+for+mimicking+the+structure+of+the+tendon-to-bone+insertion+site.">"Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site.</a> Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+3D+Nanofiber+Scaffolds:+Cell+Penetration.">Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration.</a> Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+Two-Dimensional+Electrospun+Nanofiber+Membranes+in+the+Third+Dimension+by+a+Modified+Gas-Foaming+Technique.">Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-expanded+nanofiber+scaffolds+maintain+activity+of+encapsulated+bioactive+materials+and+promote+cellular+infiltration+and+positive+host+response.">CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response.</a> Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofiber-based+sutures+induce+endogenous+antimicrobial+peptide.">Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide.</a> Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).</li><li>Dhand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+crosslinking+and+matrix-drug+interactions+for+advanced+wound+dressings+with+long-term+antimicrobial+activity.">Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity.</a> Biomaterials. 138, 153-168 (2017).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+sustained+delivery+of+25-hydroxyvitamin+D3+for+production+of+antimicrobial+peptides.">Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides.</a> Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1&#945;,+25-dihydroxyvitamin+D3-eluting+nanofibrous+dressings+induce+endogenous+antimicrobial+peptide+expression.">1&#945;, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).</li><li>Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+nanofiber+scaffolds+for+orthopedic+tissue+repair+and+regeneration.">Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration.</a> Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).</li></ol>

Trasformando nanofibre elettrofilate 2D tradizionale in espanso scaffold 3D è stata studiata tramite CO2 depressurizzazione. 2D tradizionale nanofibre sono correttamente espansa tramite sottocritico CO2 fluido. I passaggi critici sono per fabbricare nanofibre 2D sotto una condizione ottimizzata e tagliare i tappetini senza deformare i bordi (ad es., usando forbici chirurgiche affilate). Questo CO2-espanso nanofibra impalcature hanno molti benefici sopra stuoie ...

Il concetto di sviluppare un'impalcatura sintetica che possa essere impiantata nei pazienti per aiutare nella rigenerazione e riparazione tissutale è uno che ha permeato il campo della medicina rigenerativa per decenni. Lo scaffold sintetico ideale serve per indurre la migrazione delle cellule dal tessuto sano circostante, fornisce un'architettura per vascolarizzazione di supporti di semina, adesione, segnalazione, proliferazione e differenziazione, cella, consente un'adeguata ossigenazione e consegna di nutrizione e promuove l'attività immunitaria ospite per garantire il successo dopo l'impianto1. Inoltre, può essere utilizzato come vettore per l'incorporamento di molecole antimicrobiche per assistere nella cicatrizzazione1,3,6,7,8,9. La capacità di controllare il rilascio temporale di queste molecole biologiche da scaffold sintetico è un altro attributo desiderabile che è considerato quando ingegneria ponteggi1.
Elettrofilatura è stata una tecnica ben utilizzata per la produzione di nanofibra ponteggi1,2,3,4,5,6. Precedenti tentativi di creare un'impalcatura di nanofibra come quello discusso qui sono state fatte a vari gradi di successo. Tuttavia, ponteggi tradizionali nanofibra hanno limitato le capacità di realizzare questi obiettivi. Nanofibra tradizionali ponteggi sono stati principalmente bidimensionale stuoie1,3. Queste impalcature nonexpanded sono densamente imballate con pori di piccole dimensioni; Questo limita l'infiltrazione delle cellule, migrazione e differenziazione come non promuove un ambiente abbastanza simile a quelli trovati in vivo1,7,8,9. Per questo motivo, più nuove tecniche di preparazione di scaffold nanofibre elettrofilate 3D sono state stabilite a modificare i difetti inerenti che vengono con nanofibre 2D. Queste tecniche si tradurrà in 3D impalcature; Tuttavia, hanno limitata applicabilità a causa dei metodi di produzione che richiedono soluzioni acquose e liofilizzazione procedure. Questa elaborazione comporta la distribuzione casuale delle nanofibre senza organizzazione ristretta, spessore adeguato, e/o porosità desiderata per fornire i segnali di nanotopographic adeguate che sono necessari per la proliferazione e migrazione cellulare. Questi fattori sono nei ponteggi di nanofibra elettrofilate 3D precedenti che non dispongono di adeguati mimetismo di vivere tessuti1,7,8,9.
Più recenti tentativi di sviluppare un'impalcatura espansa, 3D con migliore biomimetica della matrice extracellulare (ECM) sono stati effettuati utilizzando un trattamento della soluzione acquosa di sodio boroidruro (NaBH4) e stampi predefiniti per aiutare a controllare meglio la forma della risultante dell'impalcatura7,8. Tuttavia, questo metodo non è ideale in quanto richiede l'utilizzo di soluzioni acquose, reazioni chimiche e liofilizzazione che potrebbe interferire con polimeri e qualsiasi biomolecole incapsulato che sono solubili in acqua. Gli additivi utilizzati possono anche causare effetti collaterali durante la rigenerazione del tessuto8,9. Il metodo di espansione di CO2 descritto in questo articolo notevolmente riduce il tempo di elaborazione, Elimina la necessità di soluzioni acquose e conserva l'importo e la funzionalità delle molecole biologicamente attive in misura maggiore rispetto alla precedentemente metodi consolidati9.
In studi precedenti, antibiotici, argento, 1 α, 25 dihydroxyvitamin D3e peptide antimicrobico LL-37 sono stati caricati in nanofibra impalcature individualmente e in associazione a studiare il potenziale di queste impalcature di distaccanti per ulteriore aiuto nella cicatrizzazione9,10,12,13. Allo scopo di dimostrare questo metodo di espansione impalcatura nanofibra, cumarinici 6, un colorante fluorescente, verranno caricati nel patibolo per dimostrare il potenziale di incorporare il patibolo con vari composti desiderati. Questo metodo di montaggio di impalcatura nanofibra espansa in combinazione con molecole bioattive incapsulati ha un grande potenziale nella rigenerazione dei tessuti, la guarigione della ferita, la creazione di modelli 3D del tessuto e la consegna d'attualità della droga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethlyformamide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D-199-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>AC61093-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coumarin 6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Steel Drum</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
			<td>This serves as a collector during electrospinning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-831-200</td>
			<td>Coaxial spinning requires two single syringe pumps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolver</td>
			<td>Lab Net International</td>
			<td>H5600</td>
			<td>Adjustable lab rotator for mixing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle (27G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td>EXCELINT International Co</td>
			<td>26426</td>
			<td>This is part of the example customized coaxial nozzel shown.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle (21G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td>EXCELINT International Co</td>
			<td>26416</td>
			<td>This is part of the example customized coaxial nozzel shown.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage DC Power Supply</td>
			<td>Gamma High Voltage Research</td>
			<td>ES30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Nova 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LL 37 ELISA Kit</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td>HK321-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion of two-dimension electrospun nanofiber mats into three-dimension scaffolds

Elettrofilatura è stata la tecnologia preferita nella produzione di uno scaffold sintetico, funzionale dovuto la biomimetica alla matrice extracellulare e il controllo di facilità di composizione, struttura e diametro delle fibre. Tuttavia, nonostante questi vantaggi, nanofibre elettrofilate tradizionali ponteggi vengono con limitazioni tra cui disorganizzato nanofibra orientamento, bassa porosità, la dimensione dei pori piccoli e tappetini principalmente bidimensionale. Come tale, c'è un grande bisogno per lo sviluppo di un nuovo processo per la realizzazione di ponteggi di nanofibre elettrofilate capaci di superare le limitazioni di cui sopra. Nel presente documento, è descritto un metodo semplice e romanzo. Una stuoia di nanofibra 2D tradizionale si trasforma in un'impalcatura 3D con spessore desiderato, distanza del gioco, porosità e le indicazioni di nanotopographic per consentire per la semina delle cellule e proliferazione attraverso la depressurizzazione del sottocritico CO2 fluido. Oltre a fornire un scaffold per la rigenerazione del tessuto si verifica, questo metodo fornisce anche la possibilità di incapsulare le molecole bioattive come i peptidi antimicrobici per la consegna di droga locale. I ponteggi di nanofibra di CO2 espanso tengono grandi potenzialità nella rigenerazione dei tessuti, la guarigione della ferita, modellazione 3D del tessuto e somministrazione di farmaci topici.

L'efficacia di espansione nanofibre elettrofilate 2D tradizionale nei ponteggi 3D tramite depressurizzazione del sottocritico CO2 fluido è stata dimostrata in diverse capacità: lo spessore delle impalcature è aumentato da 1 mm quando non trattata fino a 2,5 mm e 19.2 mm con uno e due trattamenti di CO2 , rispettivamente (Figura 3A-C). La porosità-a caratteristica dell'architettura critico per la semina delle cellule-...

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Expansion of Two-dimension Electrospun Nanofiber Mats into Three-dimension Scaffolds

In questo articolo viene illustrata la tecnica di espansione una stuoia di nanofibra tradizionale, due dimensioni (2D) elettrofilate in un'impalcatura di tre dimensioni (3D) attraverso la depressurizzazione del sottocritico CO2 fluido. Queste impalcature aumentate 3D, strettamente mimica cellulare nanotopographic spunti e preservare le funzioni delle molecole biologiche incapsulati all'interno delle nanofibre.

Espansione del due-dimensione elettrofilate nanofibre in tre dimensioni ponteggi

Electrospinning has been the preferred technology in producing a synthetic, functional scaffold due to the biomimicry to extracellular matrix and the ease ...

Questo protocollo ha riportato la trasformazione delle nanofibremembrane elettrospunte tradizionali dal 2D al 3D, attraverso la depressurizzazione del fluido di CO2 subcritico che non è stato realizzato in precedenza. Questo metodo elimina molti problemi associati ad approcci precedenti, tra cui l'uso di soluzioni acquose e reazioni chimiche, processi a più passaggi, perdita di attività di molecole biologiche incapsulate e limitazioni dei polimeri idrofobi. A dimostrare questa procedura è Shixuan Chen, un postdoc del mio laboratorio.In un tubo di vetro da 20 mililitre, sciogliere due grammi di PCL in una miscela solvente di diclorometano e DMF, con un rapporto quattro a uno ad una concentrazione del 10%. Posizionare il tubo di vetro in un rotatore da laboratorio fino a quando la soluzione non diventa chiara. La soluzione può mescolarsi durante la notte.Per impostare l'apparato elettrofilante, aggiungere innanzitutto la soluzione PCL a una siringa da 20 millilitri con un ago smussato calibro 21 collegato. Assicurarsi che non ci sia aria nella siringa e tubi dissociati. Posizionare un tamburo in acciaio rotante con il collettore di terra a 12 centimetri dalla punta dell'ago.Utilizzando clip di alligatore, collegare l'alimentatore ad alta tensione a corrente diretta all'ago e assicurarsi che il collettore sia a terra. Per i 20 millilitri della soluzione PCL, impostare il parametro della pompa siringa utilizzando un diametro di 20,27 millimetri e una portata di 0,5 millilitri all'ora. Controllare se le goccioline si stanno formando sulla punta dell'ago.Applicare un potenziale elettrico di 20 kilovolt tra lo spinneret e un collettore di terra situato a 20 centimetri di distanza dallo spinneret. Raccogliere i tappetini in nanofibra allineati in un tamburo, ruotando a 2.000 giri/min. Raccogliere i tappetini in nanofibra PCL una volta raggiunto uno spessore di circa un millimetro.Immergere i tappetini in nanofibra PCL in azoto liquido per cinque minuti. Mantenere i tappetini in nanofibra PCL in azoto liquido e punzonare i tappetini in nanofibra PCL con un punzone di 0,5 millimetri di diametro. Posizionare i tappetini in nanofibra PCL in azoto liquido per cinque minuti.Tagliare i tappetini in quadrati di un centimetro per un centimetro usando forbici chirurgiche affilate mentre sono immersi nell'azoto liquido per evitare la deformazione dei bordi. Posizionare il tappetino tagliato in un tubo di centrifuga da 30 millilitri con circa un grammo di ghiaccio secco. Limitare saldamente il coperchio e consentire al ghiaccio secco di passare all'anidride carbonica liquida.Una volta che il liquido si è formato nel tubo, rilasciare rapidamente la pressione aprendo il tappo. Rimuovere e osservare l'impalcatura gonfia dal tubo. Posizionare l'impalcatura in un nuovo tubo di centrifuga con ghiaccio secco e ripetere l'utilizzo dello spessore del desiderio.Sterilizzare le impalcature espanse in nanofibra in ossido di etilene prima dell'incubazione con le cellule. L'efficacia dell'espansione dei tradizionali tappetini in nanofibra elettrospun 2D in impalcature 3D attraverso la depressurizzazione del fluido di CO2 subcritico viene mostrata a sinistra dopo il secondo trattamento. Lo spessore dell'impalcatura è aumentato da un millimetro quando non trattato a 2,5 millimetri con un trattamento di CO2, a 19,2 millimetri con due trattamenti di CO2.La porosità delle impalcature è aumentata dal 79,5% per i tappetini non trattati, al 92,1% dopo il primo trattamento, al 99,0% dopo il secondo trattamento. Questo è significativo perché il grado di penetrazione cellulare in un'impalcatura, e quindi la sua efficacia per indurre la rigenerazione, dipende in gran parte dalla porosità. Le immagini SEM rivelano che la struttura fibulare densamente imballata di tappetini 2D non trattati è stata trasformata in strutture ordinate e stratificate con nano fibre allineate dopo l'espansione con CO2.In Vevo gli studi sono stati effettuati mediante impianto sottocutaneo di impalcature in nanofis fibre espanse di CO2 con fori a matrice quadrata ai ratti. Ciò consente la migrazione cellulare e la proliferazione all'interno dei fori, così come ulteriori infiltrazioni all'interno degli strati di nano fiber che sono stati creati durante l'espansione. Dalla prima alla quarta settimana dopo l'impianto, le impalcature espanse hanno mostrato un aumento significativo del numero di vasi sanguigni formati e cellule giganti multinucleate rispetto a un tradizionale tappetino a nano fiber.Seguendo questa procedura, diverse molecole tra cui fattori di crescita, composti amminomodulanti, agenti emostatici e agenti anti-microtubulari possono essere incorporate nei tappetini nano fiber e espanse in fluido di CO2 subcritico. Tali impalcature a nanofia fibra espansa funzionalizzate potrebbero essere utilizzate per esplorare nuove domande in altri campi scientifici, come l'emostasi, la prevenzione e il trattamento delle infezioni, l'immunologia e la rigenerazione e riparazione dei tessuti. I solventi organici sono tossici e devono essere maneggiati in una cappa chimica.Inoltre, un contenitore che può sopportare l'alta pressione del fluido di CO2 subcritico dovrebbe essere utilizzato per l'espansione.

Research

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Genetics

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