Name: expansion of two-dimension electrospun nanofiber mats into three-dimension scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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この作品が支持されたによって付与から国立科学研究所の一般医療 (日の出) (2 P 20 GM103480-06 と J.X. に 1R01GM123081)、NIH でネブラスカ大学医療からオーティス グリーブ医療研究財団、NE LB606、スタートアップ資金センター。

すべては、生体内での下記手続は、ネブラスカ大学医療センターで IACUC 委員会によって承認されました。
1. 標準静電紡糸用のソリューションを準備します。
<ol><li>20 mL ガラス管に poly(ε-caprolactone) の 2 g を溶解 (PCL、Mw = 80 kDa) ジクロロ メタン (DCM) の混合溶媒中と N, N-ジメチルホルムアミド (DMF) を 10% (w/v) の濃度で 4:1 比 (v/v) とします。 注意: ハンドル DCM およ...

<ol>
	<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+electrospun+nanofibers+for+wound+healing.">Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing.</a> Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).</li><li>Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+Nanofiber+Scaffolds+with+Gradations+in+Fiber+Organization.">Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52626 (2015).</li><li>Xie, J., Li, X., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Put+electrospun+nanofibers+to+work+for+biomedical+research.">Put electrospun nanofibers to work for biomedical research.</a> Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofiber+membranes+with+controllable+microwells+and+structural+cues+and+their+use+in+forming+cell+microarrays+and+neuronal+networks.">Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks.</a> Small. 7 (3), 293-297 (2011).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radially+aligned,+electrospun+nanofibers+as+dural+substitutes+for+wound+closure+and+tissue+regeneration+applications.">Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications.</a> ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Aligned-to-random"+nanofiber+scaffolds+for+mimicking+the+structure+of+the+tendon-to-bone+insertion+site.">"Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site.</a> Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+3D+Nanofiber+Scaffolds:+Cell+Penetration.">Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration.</a> Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+Two-Dimensional+Electrospun+Nanofiber+Membranes+in+the+Third+Dimension+by+a+Modified+Gas-Foaming+Technique.">Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-expanded+nanofiber+scaffolds+maintain+activity+of+encapsulated+bioactive+materials+and+promote+cellular+infiltration+and+positive+host+response.">CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response.</a> Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofiber-based+sutures+induce+endogenous+antimicrobial+peptide.">Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide.</a> Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).</li><li>Dhand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+crosslinking+and+matrix-drug+interactions+for+advanced+wound+dressings+with+long-term+antimicrobial+activity.">Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity.</a> Biomaterials. 138, 153-168 (2017).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+sustained+delivery+of+25-hydroxyvitamin+D3+for+production+of+antimicrobial+peptides.">Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides.</a> Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1&#945;,+25-dihydroxyvitamin+D3-eluting+nanofibrous+dressings+induce+endogenous+antimicrobial+peptide+expression.">1&#945;, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).</li><li>Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+nanofiber+scaffolds+for+orthopedic+tissue+repair+and+regeneration.">Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration.</a> Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).</li></ol>

伝統的な 2 D エレクトロスピニング ナノファイバー マットを経由でCO2減圧を行った拡張 3 D 足場に変換。伝統的な 2 D ナノファイバー マットは、亜臨界 CO2流体を介して正常に拡張です。重要なステップは、最適化された条件下で 2D ナノファイバー マットを作製し、エッジを変形させないで、マットをカット (e.g。 を使用して鋭い外科はさみ)。この CO...

組織の修復・再生を支援する患者に注入することができる合成足場を開発のコンセプトは、何十年も再生医療の分野に浸透しています。理想的な合成足場周囲の健康な組織からの細胞の遊走を誘導するのに役立つ細胞播種・接着、シグナリング、増殖・分化、サポートの血管新生のアーキテクチャを提供します, 十分な酸素化が可能と栄養配信し、注入1の後の成功を確保するためホスト免疫活性を促進します。さらに、それ使用できますキャリアとして抗菌分子を埋め込むため創傷治癒1,3,6,7,8,9を支援します。合成の足場からこれらの生物学的分子の一時的なリリースを制御する能力は、工学骨格の1と見なされます別の望ましい属性です。
静電紡糸ナノファイバー足場1,2,3,4,5,6を生産するための適正使用法をされています。ここで説明したものなどナノファイバー足場を作成する以前の試みは、成功の度合いに行われています。しかし、伝統的なペプチドナノファイバースキャフォールドには、これらの目標を達成する能力が限られています。伝統的なナノファイバー足場はほとんど二次元マット1,3をされています。これらの nonexpanded の足場が小孔サイズを密集します。これは生体内で1,7,8,9を見られるには十分な環境を促進しない、細胞浸潤、移行、および分化を制限します。このため、2 D ナノファイバー マットに付属している固有の欠陥を修正するの 3 D エレクトロスピニング ナノファイバー足場の準備のより新しい技術が設けられています。これらの技術は、3 D の足場。しかし、彼らは水溶液を必要とし、手続きを凍結乾燥製法による適用を限った。この処理の結果、制限された組織、適切な厚さおよび/または細胞の遊走や増殖に必要な十分な nanotopographic キューを提供するために必要な気孔率なしナノファイバーのランダムに分布。これらの要因は、生活の十分な擬態を欠いている以前の 3 D エレクトロスピニング ペプチドナノファイバースキャフォールド組織1,7,8,9。
細胞外マトリックス (ECM) のより良いバイオミミ クリーを 3次元に拡張した足場の開発をより最近の試みはのよりよい制御を支援するため、水溶液中のナトリウム水素化ホウ素 (NaBH4) 固溶化熱処理とあらかじめデザインされた金型を使用して行われている、結果の形状は、7、8 を足場します。ただし、このメソッドはそれがポリマーや水溶性、任意のカプセル化された生体分子を妨げる水溶液・化学反応・凍結乾燥の使用を必要と適していません。使用される添加物は組織再生8,9時の副作用もあります。大きくこの資料に記載されている CO2拡張メソッド処理時間が短縮、水溶液の必要がある、量よりも大きい程度に生理活性分子の機能を保持、以前確立された方法9。
個別やエージェントを解放するこれらの足場の可能性を調査するための組み合わせで先行研究、抗生物質、銀、1 α、25 ジヒドロキシ D3、および抗菌ペプチドの LL 37 だったナノファイバー足場に読み込まれるさらに創傷治癒の9,10,12,13を支援します。ナノファイバー足場拡張のこの方法を実証を目的として Coumarine 6, 蛍光色素は、様々 な目的化合物と足場を埋め込むことの可能性を示すに足場にロードされます。カプセル化された生理活性分子と組み合わせて拡張ナノファイバー足場製造のこのメソッドは、組織再生、創傷治癒、組織の 3 D モデルの作成、薬の局所配信に大きな可能性を保持しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethlyformamide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D-199-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>AC61093-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coumarin 6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Steel Drum</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
			<td>This serves as a collector during electrospinning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-831-200</td>
			<td>Coaxial spinning requires two single syringe pumps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolver</td>
			<td>Lab Net International</td>
			<td>H5600</td>
			<td>Adjustable lab rotator for mixing solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle (27G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td>EXCELINT International Co</td>
			<td>26426</td>
			<td>This is part of the example customized coaxial nozzel shown.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle (21G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td>EXCELINT International Co</td>
			<td>26416</td>
			<td>This is part of the example customized coaxial nozzel shown.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage DC Power Supply</td>
			<td>Gamma High Voltage Research</td>
			<td>ES30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Nova 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LL 37 ELISA Kit</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td>HK321-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion of two-dimension electrospun nanofiber mats into three-dimension scaffolds

エレクトロスピニングは、細胞外マトリックス、組成、構造、および繊維の繊維径の簡単調節するバイオミミ クリーのため合成、機能性足場材料の生産に最寄りの技術をされています。ただし、これらの利点にもかかわらず、足場などの制限で来る伝統的なエレクトロスピニング ナノファイバー解体ナノファイバー向き、低気孔率、細孔サイズ、および主に二次元のマット。そのため、上記の制限を克服することができますエレクトロスピニング ペプチドナノファイバースキャフォールドを作製する新しいプロセスを開発するための大きい必要性があります。ここで、新規でシンプルな方法を説明します。伝統的な 2 D ナノファイバー マットは、所望の厚さ、ギャップ距離、気孔率、細胞および亜臨界 CO2流体の減圧によって増殖を許可する nanotopographic キューと 3 D 足場に変換されます。発生する組織再生用足場に加え、このメソッドはまた、薬剤の局所投与の抗菌ペプチドなどの生理活性物質をカプセル化する機会を提供します。CO2拡大ペプチドナノファイバースキャフォールド組織再生、創傷治癒、組織の 3 D モデリング、および局所薬物送達の大きな可能性を保持します。

異なる容量の亜臨界 CO2流体の減圧による 3 D 足場に伝統的な 2 D エレクトロスピニング ナノファイバー マットを拡大の有効性を示した: 1 mm 2.5 mm に未処理のときから足場の厚さが増加したと1 と 2 の CO2治療と 19.2 mm それぞれ (図 3 aの C)。細胞にとって重要なアーキテクチャの気孔率の特性-も厚みが増加 (<strong class="x...

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Expansion of Two-dimension Electrospun Nanofiber Mats into Three-dimension Scaffolds

この記事は、亜臨界 CO2流体の減圧による 3 次元 (3 D) 足場に伝統的な 2 次元 (2 D) エレクトロスピニング ナノファイバー マットを拡大する方法を示します。これらの拡張の足場は 3 D、厳密に模倣細胞 nanotopographic キューであり、生物学的分子ナノファイバー内にカプセル化の機能を保持します。

2 次元エレクトロスピニング ナノファイバー マットの 3 次元足場への拡張

Electrospinning has been the preferred technology in producing a synthetic, functional scaffold due to the biomimicry to extracellular matrix and the ease ...

このプロトコルは、従来のエレクトロスパンナノファイバーメンブレンを2Dから3Dに変え、これまで実現されなかった亜臨界CO2流体の減圧を通じて報告した。この方法は、水溶液および化学反応の使用、複数のステッププロセス、封入された生体分子の活性の喪失、疎水性ポリマーの制限など、以前のアプローチに関連する多くの問題を排除します。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるShixuan Chenです。20ミリリットルのガラス管で、ジクロロメタンとDMFの溶媒混合物に2グラムのPCLを溶解し、濃度10%で4対1の比率を有する。溶液がはっきりするまで、ガラス管をラボの回転子に入れます。ソリューションは一晩中混ざるかもしれません。エレクトロスピニング装置をセットアップするには、まず、21ゲージの鈍い針を取り付けた20ミリリットルのシリンジにPCL溶液を追加します。シリンジに空気がなく、切り出したチューブがないことを確認します。針先から12センチメートルの地面コレクターで回転するスチールドラムを置きます。ワニのクリップを使用して、直流高圧電源を針に接続し、コレクタが接地されていることを確認します。PCL溶液の20ミリリットルの場合、直径20.27ミリメートル、毎時0.5ミリリットルの流量を使用してシリンジポンプのパラメータを設定します。針の先端に液滴が形成されているかどうかを確認します。紡ぎ場から 20 センチ離れた地盤コレクターとの間に 20 キロボルトの電位を適用します。2,000 RPMで回転するドラムに整列したナノファイバーマットを集める。PCLナノファイバーマットは、厚さ約1ミリメートルに達したら回収します。PCLナノファイバーマットを液体窒素に5分間浸します。PCLナノファイバーマットを液体窒素に入れ、PCLナノファイバーマットに直径0.5ミリメートルのパンチを入れておいてください。PCLナノファイバーマットを液体窒素に5分間入れます。エッジの変形を避けるために液体窒素に沈めながら、鋭い外科用はさみを使用して1センチメートルの正方形にマットを1センチメートルにカットします。カットマットを約1グラムのドライアイスを入れ、30ミリリットルの遠心管に入れ。蓋をしっかりとキャップし、ドライアイスを液体二酸化炭素に変えます。チューブに液体が形成されたら、キャップを開けて圧力を素早く解放します。ふくらんだ足場をチューブから取り出して観察します。ドライアイスを備えた新しい遠心分離管に足場を置き、繰り返しの要望の厚さが達成されます。細胞とのインキュベーション前に、拡大したナノファイバースキャフォールドをエチレンオキシドで殺菌します。従来の2DエレクトロスパンナノファイバーマットをサブクリティカルCO2液の減圧によって3D足場に拡大する効果は、2回目の処理後に左側に示されています。足場の厚さは、1回のCO2処理で2.5ミリメートルに未処理の場合、1ミリメートルから2CO2処理で19.2ミリメートルに増加しました。足場の空隙率は、未処理のマットの79.5%から最初の治療後の92.1%に増加し、2回目の治療後に99.0%に増加した。これは、足場への細胞浸透の程度、したがって再生を誘導するその有効性が、空隙率に大きく依存するため重要である。SEM画像は、未処理の2Dマットの密に詰まったフィブラ構造が、CO2で膨張した後、整列したナノファイバーを持つ秩序ある層状構造に変換されたことを明らかにした。Vevoでは、ラットに対して正方形配列の穴を有するCO2拡張ナノ繊維足場の皮下移植によって実施された。これにより、細胞移動と穴内での増殖、および拡張中に作成されたナノファイバー層内のさらなる浸潤が可能になります。移植後の第1週から4週目まで、拡大した足場は、従来のナノファイバーマットと比較して形成された血管の数および多核巨細胞の有意な増加を示した。この手順に従って、成長因子、アミノ調節化合物、止血剤、および抗微小管剤を含む異なる分子をナノファイバーマットに組み込み、亜臨界CO2流体中に展開することができる。このような機能拡張された拡大ナノ繊維足場は、止まり止め、感染の予防と治療、免疫学、組織再生および修復などの他の科学分野における新たな疑問を探求するために使用することができる。有機溶剤は有毒であり、化学フードで取り扱う必要があります。さらに、サブクリティカルなCO2流体の高圧に耐えることができる容器を膨張に使用する必要があります。

Research

JoVE Journal

Genetics

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

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遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

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CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

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細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

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Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

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Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

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The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

2 次元エレクトロスピニング ナノファイバー マットの 3 次元足場への拡張

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