Name: induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin
Uploaded: 2019-04-30T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por una subvención RF-2011-02352331 del Ministero Italiano della Salute (a Armando Gabrielli).

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Ministerio de Salud de Italia (autorización n. 456/2016-PR) y realizados de acuerdo con la Declaración de los convenios de Helsinki.
1. Ratones
<ol><li>Después de comprarlos, deje que los ratones se aclimaten durante al menos 7 días antes de la inyección. NOTA: Los ratones fueron alojados en las instalaciones animales en condiciones libres de patógenos, se mantuvieron bajo temperatura y humedad ...

<ol>
	<li>Iudici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+are+we+going+in+the+management+of+interstitial+lung+disease+in+patients+with+systemic+sclerosis?.">Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis?.</a> Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).</li><li>Moore, B. B., Hogaboam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+pulmonary+fibrosis.">Murine models of pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).</li><li>Mouratis, M. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+fibrotic+lung+disease.">Animal models of fibrotic lung disease.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).</li><li>Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+strain+variation+in+murine+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).</li><li>Phan, S. H., Kunkel, S. 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(122), e55224 (2017).</li><li>Moroncini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+from+human+umbilical+cord+prevent+the+development+of+lung+fibrosis+in+immunocompetent+mice.">Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice.</a> PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).</li><li>Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+type+I+procollagen+mRNA+transcripts+in+the+lungs+of+mice+during+the+development+of+bleomycin-induced+fibrosis.">Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).</li><li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+hMSCs+improve+myocardial+infarction+in+mice+because+cells+embolized+in+lung+are+activated+to+secrete+the+anti-inflammatory+protein+TSG-6.">Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li><li>Scotton, C. J., Chambers, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin+revisited:+towards+a+more+representative+model+of+IPF?.">Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).</li><li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+intubation+in+mice+via+direct+laryngoscopy+using+an+otoscope.">Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).</li><li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice.">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+mediate+the+release+of+interferon+gamma-induced+protein+10+and+alleviate+bleomycin-induced+lung+inflammation+and+fibrosis.">Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis.</a> Shock. 39 (3), 261-270 (2013).</li><li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSG-6+as+a+biomarker+to+predict+efficacy+of+human+mesenchymal+stem/progenitor+cells+(hMSCs)+in+modulating+sterile+inflammation+in+vivo.">TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).</li></ol>

La administración endotraqueal es la vía preferencial para la entrega de agentes exógenos en los pulmones. Desde hace varios años, la inyección directa de bleomicina en la tráquea se ha utilizado ampliamente para inducir la fibrosis pulmonar13 y, recientemente, se han desarrollado técnicas no invasivas más avanzadas para lograr este14,15 ,16.
El método descrito aquí ...

La fibrosis pulmonar es un proceso patológico progresivo caracterizado por la deposición excesiva de componentes de la matriz extracelular, principalmente colágeno de tipo I, en el intersticio pulmonar, lo que conduce a una función pulmonar deteriorada. Es el sello distintivo de varias enfermedades pulmonares humanas con una etiología diferente y representa un mal factor de pronóstico clínico. Dado que las terapias actuales son bastante limitadas1, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta esencial tanto para la investigación ulterior de los mecanismos patógenos que influyen en la aparición y la progresión de la enfermedad como para el desarrollo de nuevos antifibrosticos estrategias2,3.
Hasta la fecha, la administración de bleomicina ha sido el modelo más comúnmente aplicado de fibrosis pulmonar inducida experimentalmente4. Además de múltiples métodos de administración (incluidos los métodos de administración intravenosos, intraperitoneales, subcutáneos e inhalatológicos), las inyecciones intratraales o endotraqueales de bleomicina han surgido como las rutas más utilizadas4,5. El método que describimos aquí se ha desarrollado para evitar el efecto escaldándose de la bleomicina en la mucosa traqueal. De hecho, al exteriorizar la tráquea y visualizarla a través de un microscopio operativo, es posible lograr la instilación de todo el volumen de solución de bleomicina directamente en las vías respiratorias inferiores sin derrames en las vías respiratorias superiores. Cuando se dispone de la experiencia quirúrgica y la instrumentación requeridas, este método permite la inducción segura, robusta y reproducible de la inflamación pulmonar y la fibrosis, como se indica a continuación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:236px;">Charles River</td>
			<td style="width:239px;">Jax Mice Stock n. 000664</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)&#160;</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:239px;">T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Barraquer Micro Needle Holder</td>
			<td style="width:236px;">Lawton</td>
			<td style="width:239px;">62-3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Bleomycin sulfate</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1141000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td style="width:236px;">Brand&#160;</td>
			<td style="width:239px;">718905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Culture Flasks&#160;</td>
			<td style="width:236px;">EuroClone</td>
			<td style="width:239px;">ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Disposable razors</td>
			<td style="width:236px;">Unigloves</td>
			<td style="width:239px;">4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:236px;">Aesculap Surgical Instruments</td>
			<td style="width:239px;">BD311R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">DPBS</td>
			<td style="width:236px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Heating pad</td>
			<td style="width:236px;">2Biological Instruments</td>
			<td style="width:239px;">557023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Isoflurane Vet</td>
			<td style="width:236px;">Merial Italia</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Operating Microscope</td>
			<td style="width:236px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:239px;">Model OPM 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td style="width:236px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12563-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Vannas Micro Scissors</td>
			<td style="width:236px;">Aesculap Surgical Instruments</td>
			<td style="width:239px;">OC498R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:369px;">Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm</td>
			<td style="width:236px;">Ethicon</td>
			<td style="width:239px;">VCP392ZH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin

La fibrosis pulmonar es un sello distintivo de varias enfermedades pulmonares humanas con una etiología diferente. Dado que las terapias actuales son bastante limitadas, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta esencial para desarrollar nuevas estrategias antifibroticas. Aquí proporcionamos un método eficaz para investigar la actividad antifibromática in vivo de las células estromales mesenquimales humanas obtenidas del cordón umbilical entero (hUC-MSC) en la atenuación de la lesión pulmonar inducida por bleomicina. Los ratones C57BL/6 reciben una única inyección endotraqueal de bleomicina (1,5 U/kg de peso corporal) seguida de una doble perfusión de hUC-MSC (2,5 x 105) en la vena de la cola, 24 h y 7 días después de la administración de bleomicina. Tras el sacrificio en los días 8, 14 o 21, se analizan los cambios inflamatorios y fibrosos, el contenido de colágeno y la presencia de hUC-MSC en el tejido pulmonar explantado. La inyección de bleomicina en la tráquea del ratón permite la orientación directa de los pulmones, lo que conduce a una inflamación pulmonar extensa y fibrosis. La administración sistémica de una dosis doble de hUC-MSC da como resultado la contundencia temprana de la lesión pulmonar inducida por bleomicina. Los hUC-MSC infundidos por vía intravenosa se injertan transitoriamente en los pulmones del ratón, donde ejercen su actividad antiinflamatoria y antifibrotica. En conclusión, este protocolo se ha aplicado con éxito para las pruebas preclínicas de hUC-MSC en un modelo experimental de ratón de fibrosis pulmonar humana. Sin embargo, esta técnica se puede extender fácilmente tanto para estudiar el efecto de diferentes sustancias administradas endotraquealmente en la fisiopatología de los pulmones como para validar nuevas terapias sistémicas antiinflamatorias y antifibromáticas.

La lesión pulmonar fue inducida por una única inyección endotraqueal de 1,5 U/kg de peso corporal de sulfato de bleomicina en 100 ml de solución salina estéril. Los animales de control recibieron una inyección endotraqueal de un volumen igual de salina. Se infundieron dos inyecciones de hUC-MSC (2,5 x 105 en 200 ml de solución salina estéril) en la vena de la cola del ratón, 24 h y 7 días después de la administración de bleomicina. Los animales de control recibieron...

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Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Aquí presentamos un método eficaz para investigar la actividad antifibrotica de las células mesenquimales humanas infundidas por vía intravenosa obtenidas de todo el cordón umbilical tras la inducción de la lesión pulmonar mediante una inyección endotraqueal de bleomicina en C57BL /6 ratones. Este protocolo se puede extender fácilmente a las pruebas preclínicas de otras terapias.

Inducción de lesión pulmonar de ratón por inyección endotraqueal de bleomicina

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Este protocolo se puede aplicar con éxito tanto para inducir una respuesta inflamatoria y fibrosa importante en ambos pulmones mediante inyección endotraqueal de Bleomycin y para validar nuevas terapias sistémicas antiinflamatorias y antifiticas por perfusión de venas de cola. La principal ventaja de esta técnica es que la inyección directa de Bleomicina en la tráquea de ratón garantiza una rápida focalización de los pulmones sin derrames en las vías respiratorias superiores permitiendo una inducción segura, robusta y reproducible de la inflamación pulmonar y la fibrosis. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Fiorenza Orlando, médico veterinario de nuestro laboratorio colaborador.Para empezar, coloque el ratón anestesiado acostado boca arriba sobre una plataforma quirúrgica. Fije delicadamente sus piernas con tiras de cinta quirúrgica para mantenerla en su lugar. Para extender el cuello del ratón, coloque un soporte como rollo de algodón dental debajo de su región cervical.Luego usa una cuchilla de afeitar para afeitar suavemente la garganta. Usa un par de fórceps anatómicos para pellizcar la piel. Utilice un par de tijeras contundentes curvadas manejadas por anillo para hacer una incisión corta de aproximadamente medio centímetro de longitud en correspondencia con el músculo esternohoides del ratón.Use palitos de lana de algodón para detener cualquier sangrado. A continuación, exteriorizar la tráquea por disección contundente y limpiar suavemente de grasa y otros tejidos. Gire la plataforma quirúrgica para orientar el ratón con la cabeza hacia el operador, lo que permite al operador durante la inyección inclinar la jeringa correctamente.Para visualizar la tráquea, coloque el ratón bajo un microscopio operativo. Ajuste la iluminación y ajuste la ampliación entre 1 y 1.2 y, a continuación, ajuste el enfoque y la nitidez. La tráquea se puede distinguir fácilmente como un tubo translúcido blanco con anillos traqueales claramente visibles.Pipetear suavemente para mezclar la solución de Bleomycin y aspirar 100 microlitros en una jeringa de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 25 evitando la formación de burbujas. Una vez que la tráquea se visualice claramente, perfore cuidadosamente con la punta de la aguja en un ángulo de 30 grados. Inyecte lentamente 100 microlitros de Bleomycin directamente en el lumen de la tráquea.Después de esperar unos segundos para que todo el volumen viaje por la aguja, retírela de la tráquea. Observe unos segundos de apnea cuando la aguja se inserte correctamente en la tráquea, lo que indica que se ha inhalado todo el volumen de líquido. Deseche de forma segura la jeringa y la aguja.Cierre la fascia subcutánea y la herida cutánea con una sutura absorbible 5-0 y permita que el animal se recupere. Después de anestesiar el ratón de nuevo y una vez que se ha confirmado la inconsciencia, coloque el ratón debajo de una capucha estéril. Usa una mascarilla facial con un flujo continuo de 1.5%isoflurano para mantener una anestesia suave durante todo el experimento.Para promover la vasodilatación y permitir una inyección más fácil, remoje la cola en agua tibia durante dos minutos. Mezclar una suspensión de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano pipeteando suavemente para evitar la formación de grumos celulares. Aspirar 200 microlitros en una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 26 evitando la formación de burbujas.Sostenga la cola por la punta y enderece suavemente. A continuación, localice la vena lateral de la cola. Raspa suavemente la cola con un bisturí y límpiala con 70%etanol.A partir de la parte distal de la cola, inserte la aguja en la vena en un ángulo de 15 grados. Infundir lentamente 200 microlitros de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano. Para controlar la perfusión intravenosa exitosa, observe el líquido que entra en la vena sin resistencia y falta de extravasación.Después de esperar unos segundos hasta que todo el volumen se desdesle por la aguja, retírela de la vena. A continuación, aplique brevemente presión sobre la herida de entrada con una gasa estéril para evitar el sangrado y permitir que el animal se recupere. Deseche de forma segura la jeringa y la aguja después de la perfusión.Después de la inyección de Bleomycin, los cambios histopatológicos pulmonares fueron evaluados por Hematoxilina y Eosina y Picrosirius Mancha roja que confirman una amplia infiltración inflamatoria y fibrosis en comparación con la arquitectura pulmonar normal después de la inyección salina. La inflamación pulmonar inducida por bleomicina y la fibrosis fueron atenuadas en gran medida por la infusión de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano, pero no por solución salina. La deposición de colágeno se midió mediante un ensayo de hidroxiprolina.Después de la inyección de Bleomycin, los niveles de hidroxiprolina aumentaron progresivamente desde el día ocho hasta el día 14 y 21. Mientras que la adición de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano redujo significativamente los efectos de la Bleomicina. Los niveles de expresión de Col1A1 tipo un gen de colágeno en el ARNm pulmonar entero también mostraron un aumento progresivo en los días ocho, 14 y 21 que se redujo parcialmente mediante el tratamiento de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano.La inmunostaining con anticuerpos específicos mostró que las células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano infundidas llegaron rápida y eficazmente a los pulmones de ratón, aunque sólo se detectaron unas pocas células. Estos datos sugieren una rápida luxación de las células de la lesión en el sitio a pesar del efecto protector prolongado. El uso de un microscopio de funcionamiento garantiza una alta confianza en el éxito al permitir al operador monitorear con precisión la colocación correcta de la aguja en la tráquea del ratón antes de la instalación, minimizando así el riesgo de dañarla.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

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Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

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Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

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Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

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Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

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While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Un Multimodal enfoque de imagen basados en tomografía Molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación Longitudinal de la Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones

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Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

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Un modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada por la instilación unilateral de ácido intrabronal

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...

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Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares

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